CN107574134A - 一种粪菌移植治疗中标准粪菌冻干粉制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种粪便移植治疗中标准粪菌冻干粉制备工艺，包括以下步骤：(1)标准粪菌液制备；(2)冻干保护剂配制；(3)三步法冷冻，真空干燥；其中,冻干保护剂的配制为在无菌生理盐水中分别加入10‑20％海藻糖，5‑10％甘油和0.02‑0.05％维生素C混匀，滤过除菌。本发明特制的冻干保护剂可以在冻干过程中保护粪菌不损失活性，提高粪菌成活率；特定的冻干程序既能使粪菌快速进入休眠状态，又不会损失其活性，有效保护了有效成份的稳定性。实验表明，经本发明提供的工艺制备的冻干粉有效保持了粪便中粪菌的活性，大大提高了存活率。

Description

一种粪菌移植治疗中标准粪菌冻干粉制备工艺

技术领域

本发明涉及医疗技术领域，更具体地，涉及一种粪便移植治疗中标准粪菌冻干粉制备工艺。

背景技术

粪菌移植(fecal microbiota transplantation，FMT)在世界医学史上至少始于公元4世纪，但是直到近几年才得到了前所未有的快速发展。2013年，FMT首次被写入美国医学指南，用于复发性难辨梭状芽孢杆菌感染

(clostridiumdifficile infection，CDI)的治疗。同时，其在国内外用于炎症性肠病、肠易激综合征、代谢综合征等肠内外疾病的治疗，也已引起广泛关注。目前临床开展的粪菌移植治疗皆为取供体新鲜粪便制备标准粪菌液进行治疗。这种新鲜粪菌标准液需要从粪便采集到治疗过程控制在6h内，时间紧迫，而且由于合格供体不易寻找，且供体筛选费用较高，这些阻碍了粪菌移植的临床应用。

冷冻干燥技术对生物组织和细胞结构和特征的损伤较小，使其快速进入休眠状态，有效保护了有效成份的稳定性，故为了便于运输和储藏将所需粪菌制备成粪菌冻干粉，但在制备冻干粉过程中容易损失粪菌的活性，粪菌存活率大打折扣。

发明内容

本发明的目的是解决目前粪菌冻干粉活性不高的缺陷，发明一种粪菌冻干粉制备工艺，可以有效地保持粪菌的活性。

为了实现上述目的，本发明提供一种粪便移植治疗中标准粪菌冻干粉制备工艺，包括以下步骤：

(1)标准粪菌液制备；

(2)冻干保护剂配制；

(3)三步法冷冻，真空干燥；

其中,冻干保护剂的配制为在无菌生理盐水中分别加入10-20％海藻糖，5-10％甘油和0.02-0.05％维生素C混匀，滤过除菌。

上述步骤(1)的具体操作为：筛选合格供体，分别无菌采集粪便，匀质处理后，经纱布过滤后离心，弃掉上清液得到粪菌泥浆沉淀物。

上述步骤(3)的具体操作为：将冻干保护剂加入粪菌泥浆中，涡旋混匀，取1mL菌液进行粪菌培养计数，剩余液体置于冻干机内，设定冻干程序：由室温快速降温至4℃，4℃至-40℃每分钟降低1℃，-40℃到-60℃每分钟降低5℃，当温度下降到-60℃以下时，将冻结好的样品迅速放入冻干机钟罩内，启动真空泵抽气直到样品干燥。冻干的样品置于-80℃冰箱，保存三个月。

本发明所述粪菌培养计数选取对环境条件比较敏感且为益生菌的双歧杆菌作为检测指标。

上述粪菌培养计数包括以下步骤：BBL培养平板制备，涂板，培养计数。

上述BBL培养平板制备的具体操作为：BBL培养基70g，加入1ml吐温80，加热溶于1000ml蒸馏水中，115℃灭菌20min；冷却至约50℃，倾倒至直径为90mm的无菌培养皿中，每皿10mL-15mL，置于无菌条件下冷却凝固。

上述涂板的具体操作为：将取得的样品分别加至9mL体积的无菌生理盐水中，倍比稀释混匀，取10⁷和10⁸两个稀释度涂板。

上述培养计数的具体操作为：将培养板置于厌氧袋中，放于培养箱中37℃厌氧培养72h后，进行菌落计数。

本发明按照GB/T4789.34—2008方法进行菌落计数。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明特制的冻干保护剂可以在冻干过程中保护粪菌不损失活性，提高粪菌成活率；

(2)本发明的冻干程序既能使粪菌快速进入休眠状态，又不会损失其活性，有效保护了有效成份的稳定性；

(3)本发明特定的培养平板，使粪菌冻干粉在涂板计数过程中减少对粪菌活性的影响，使计数更准确；

(4)本发明所述工艺能够将粪菌制备成粪菌冻干粉，且至少保持三个月，存活率可达92％。

具体实施方式

下面将结合具体实施例更详细地描述本发明的优选实施方式。

实施例1

一种粪便移植治疗中标准粪菌冻干粉制备工艺，包括以下步骤：

(1)标准粪菌液制备：筛选合格供体(年龄25-35岁，无重大疾病，健康男性)5人，无菌采集粪便50g，匀质处理后，经纱布过滤后离心，弃掉上清液得到粪菌泥浆沉淀物。

(2)冻干保护剂配制：100mL无菌生理盐水分别加入15％海藻糖，7％甘油和0.05％维生素C混匀，滤过除菌。

(3)三步法冷冻，真空干燥：将冻干保护剂加入粪菌泥浆中，涡旋混匀，分别取1mL菌液进行双歧杆菌培养计数，剩余液体装入冻干管中。然后将冻干管置于冻干机内，设定冻干程序：由室温快速降温至4℃，4℃至-40℃每分钟降低1℃，-40℃到-60℃每分钟降低5℃。当温度下降到-50℃以下时，将冻结好的样品迅速放入冻干机钟罩内，启动真空泵抽气直到样品干燥。冻干的样品置于-80℃冰箱，保存三个月。三个月后每份冻干粉取1g进行菌落培养计数。

上述粪菌培养计数的操作步骤为：

①BBL培养平板制备：称取BBL培养基70g，加入1ml吐温80，加热溶于1000ml蒸馏水中，115℃灭菌20min；灭菌后的培养基温度冷却至约50℃时，倾倒到无菌的直径为90mm的培养皿中，每皿10-15mL。置于生物安全柜中(无菌条件下)冷却凝固。

②涂板：将取得的样品分别加至9ml无菌生理盐水中，倍比稀释混匀，取10⁷和10⁸两个稀释度涂板，每个稀释度各两个平行。

③培养计数：将培养板置于厌氧带中，放于培养箱中37℃厌氧培养48h后进行菌落计数。

实施例1五组平行实验的粪菌计数结果见表1：

表1双歧杆菌总数(lg10ⁿ)

冻干前样品中双歧杆菌活菌总数均值为6.54±0.31log₁₀cfu，冻干保存三个月后双歧杆菌活菌总数均值为6.02±0.51log₁₀cfu，存活率为92％。

结果证明，经本发明提供的工艺制备的冻干粉有效保持了粪便中粪菌的活性，大大提高了存活率。

Claims (8)

1.一种粪便移植治疗中标准粪菌冻干粉制备工艺，其特征在于包括以下步骤：

(1)标准粪菌液制备；

(2)冻干保护剂配制；

(3)三步法冷冻，真空干燥；

其中,冻干保护剂的配制为在无菌生理盐水中分别加入10-20％海藻糖，5-10％甘油和0.02-0.05％维生素C混匀，滤过除菌。

2.根据权利要求1所述的粪便移植治疗中标准粪菌冻干粉制备工艺，其特征在于所述步骤(1)的具体操作为：无菌采集供体粪便，匀质处理后，经纱布过滤后离心，弃掉上清液得到粪菌泥浆沉淀物。

3.根据权利要求1所述的粪便移植治疗中标准粪菌冻干粉制备工艺，其特征在于所述步骤(3)的具体操作为：将冻干保护剂加入粪菌泥浆中，涡旋混匀，取1mL菌液进行粪菌培养计数，剩余液体置于冻干机内，设定冻干程序：由室温快速降温至4℃，4℃至-40℃每分钟降低1℃，-40℃到-60℃每分钟降低5℃，当温度下降到-60℃以下时，将冻结好的样品迅速放入冻干机钟罩内，启动真空泵抽气直到样品干燥，冻干的样品置于-80℃冰箱，保存三个月。

4.根据权利要求3所述的粪便移植治疗中标准粪菌冻干粉制备工艺，其特征在于所述粪菌培养计数选取对环境条件比较敏感且为益生菌的双歧杆菌作为检测指标。

5.根据权利要求4所述的粪便移植治疗中标准粪菌冻干粉制备工艺，其特征在于所述粪菌培养计数包括以下步骤：BBL培养平板制备，涂板，培养计数。

6.根据权利要求4所述的粪便移植治疗中标准粪菌冻干粉制备工艺，其特征在于所述BBL培养平板制备的具体操作为：BBL培养基70g，加入1ml吐温80，加热溶于1000ml蒸馏水中，115℃灭菌20min；冷却至50℃，倾倒至直径为90mm的无菌培养皿中，每皿10mL-15mL，置于无菌条件下冷却凝固。

7.根据权利要求4所述的粪便移植治疗中标准粪菌冻干粉制备工艺，其特征在于所述涂板的具体操作为：将取得的样品分别加至9mL体积的无菌生理盐水中，倍比稀释混匀，取10⁷和10⁸两个稀释度涂板。

8.根据权利要求4所述的粪便移植治疗中标准粪菌冻干粉制备工艺，其特征在于所述培养计数的具体操作为：将培养板置于厌氧袋中，放于培养箱中35℃-37℃厌氧培养72h后，进行菌落计数。