CN107513515A - 一种粪菌移植治疗中标准粪菌液制备工艺 - Google Patents

一种粪菌移植治疗中标准粪菌液制备工艺 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种粪便移植治疗中标准粪菌液制备工艺，包括以下步骤：(1)粪便匀质处理：包括采集粪便和制备粪便稀释液。(2)逐级过滤：将粪便稀释液先后经过80目标准筛、300目标准筛、20μm滤膜、5μm滤膜、0.8μm滤膜过滤并收集滤液；(3)离心，制备混悬液。本发明采用的逐级过滤的方式以及过滤工具的设置，不仅有效过滤食物残渣，且能保持粪菌中微生物活性，提高活菌数；特定的缓冲液能够更好地在过滤过程中维持细菌活性。经实验表明，本发明既能去除掉有害的食物残渣，又极大地提高了粪菌提取率和存活率，且操作简洁有效。

Description

一种粪菌移植治疗中标准粪菌液制备工艺
技术领域
本发明涉及医学技术领域，更具体地，涉及一种粪便移植治疗中标准粪菌液制备工艺。
背景技术
粪菌移植(fecal microbiota transplantation，FMT)在世界医学史上至少始于公元4世纪，但是直到近几年才得到了前所未有的快速发展。2013年，FMT首次被写入美国医学指南，用于复发性难辨梭状芽孢杆菌感染(clostridiumdifficile infection，CDI)的治疗。同时，其在国内外用于炎症性肠病、肠易激综合征、代谢综合征等肠内外疾病的治疗，也已引起广泛关注。粪菌中起治疗作用的是其中存活的微生物，因此，在粪菌液制备过程中，程序尽量简单，尽量获得所有的微生物是粪菌移植过程中非常重要的环节。我们经过试验验证，发明了一套简洁而有效的粪菌液制备方法，既能够保持粪菌中微生物活性不减少，又能除掉有害的食物残渣。
发明内容
本发明的目的是克服目前粪菌液制备技术食物残渣多和损失大量细菌的缺陷，发明一种既能够保持粪菌中微生物活性不减少，又能除掉有害的食物残渣的简洁而有效的粪菌液制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供一种粪便移植治疗中标准粪菌液制备工艺，包括以下步骤：
(1)粪便匀质处理：包括采集粪便培养计数和制备粪便稀释液。
(2)逐级过滤：将粪便稀释液先后经过80-100目标准筛、250-300目标准筛、20μm滤膜、5μm滤膜、0.8μm滤膜过滤并收集滤液；
(3)离心，制备混悬液。
上述步骤(1)具体操作为：无菌采集供体粪便置于无菌烧杯中进行培养计数；加入100-200倍体积的缓冲液，置于氮气生物工程橱中，将粪便搅匀至无明显大颗粒；所述缓冲液为含有5％甘油的氯化钠蛋白胨无菌4℃缓冲液。
上述步骤(3)具体操作为：将逐级过滤收集的滤液置于无菌离心管中，3000-10000g离心去上清，沉淀物加入无菌生理盐水重新混悬；混悬后取混悬液以备培养。
本发明所述的粪菌培养计数选取对环境条件比较敏感且为益生菌的双歧杆菌作为检测指标。
上述粪菌培养计数包括以下步骤：BBL培养平板制备；涂板；培养计数。
上述BBL培养平板制备具体操作为：称取BBL培养基70g，加入1ml吐温80，加热溶于1000ml蒸馏水中，115℃灭菌20min；冷却至45-55℃后，倾倒至直径为90mm的无菌培养皿中，每皿10-15mL，置于无菌条件下冷却凝固。
上述涂板具体操作为：将取得的样品分别加至9ml无菌生理盐水中，倍比稀释混匀，取107和108两个稀释度涂板，每个稀释度各两个平行。
上述培养计数具体操作为将培养板置于厌氧带中，放于培养箱中37℃厌氧培养72h后，进行菌落计数。
本发明按照GB/T4789.34—2008方法进行菌落计数。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明采用的逐级过滤的方式以及过滤工具的设置，不仅有效过滤食物残渣，且能保持粪菌中微生物活性，提高活菌数；
(2)本发明特定的缓冲液能够更好地在过滤过程中维持细菌活性；
(3)本发明特定的培养平板，使粪菌液在涂板计数过程中减少对粪菌活性的影响，使计数更准确；
(4)本发明工艺过程以及选定的试剂，既能去除掉有害的食物残渣，又极大地提高了粪菌的存活率，且操作简洁有效。
具体实施方式
下面将结合具体实施例更详细地描述本发明的优选实施方式。
实施例1
一种粪便移植治疗中标准粪菌液制备工艺，包括以下步骤：
(1)粪便匀质处理：无菌采集五位经筛选合格供体(年龄25-35岁，无疾病，健康男性)粪便各100g，每个样品均分为A、B两部分置于无菌烧杯中，一份50g，从A部分中各称取1g粪便进行双歧杆菌培养计数。粪便分别加入200ml含有5％甘油的氯化钠蛋白胨无菌4℃缓冲液，置于氮气生物工程橱中，应用磁力搅拌器每分钟1000转，搅拌20min，将粪便搅匀至无明显大颗粒。
(2)逐级过滤：将搅匀的粪便稀释液先后经过80目标准筛和300目标准筛，边搅拌边过滤，收集的滤出液再经20μm、5μm和0.8μm滤膜抽滤并收集滤液。
(3)离心，制备混悬液：收集逐级过滤的滤液置于50ml无菌离心管中，4℃，6000g离心力离心10-30min，去上清，沉淀物称量后，加入100ml无菌生理盐水重新混悬。混悬后取1ml混悬液进行双歧杆菌培养计数。
上述粪菌培养计数的操作步骤为：
①BBL培养平板制备：称取BBL培养基70g，加入1ml吐温80，加热溶于1000ml蒸馏水中，115℃灭菌20min；灭菌后的培养基温度冷却至约50℃时，倾倒到无菌的直径为90mm的培养皿中，每皿10-15mL。置于生物安全柜中(无菌条件下)冷却凝固。
②涂板：将取得的样品分别加至9ml无菌生理盐水中，倍比稀释混匀，取107和108两个稀释度涂板，每个稀释度各两个平行。
③培养计数：将培养板置于厌氧带中，放于培养箱中37℃厌氧培养72h后进行菌落计数。
对比例1
一种粪便移植治疗中标准粪菌液制备工艺，包括以下步骤：
从实施例1中采集的粪便B部分中各称取1g粪便进行双歧杆菌培养计数。粪便用0.9％的无菌生理盐水200ml，置于氮气生物工程橱中，搅拌均匀，然后用四层无菌纱布过滤，收集滤过液，4℃，6000g离心力离心10-30min，去上清，沉淀物称量后，加入100ml无菌生理盐水重新混悬。混悬后，分别取1ml混悬液进行双歧杆菌培养计数。
实施例1(A)与对比例1(B)的5组平行实验粪菌处理前后菌落总数以及制备粪菌质量的具体数据见表1。
表1双歧杆菌总数(lg10n)及制备粪菌质量(x±s，g)
*和△：与粪菌B组相比，p＜0.01；
实施例1：粪便中双歧杆菌活菌总数均值为7.91±0.42log10cfu，制备菌液双歧杆菌活菌总数均值为6.02±0.36log10cfu，提取率为76％。
对比例1：粪便中双歧杆菌活菌总数均值为7.86±0.35log10cfu，制备菌液双歧杆菌活菌总数均值为3.52±0.51log10cfu，提取率为45％。
数据经单因素ANOVA分析，处理前两组菌落总数差异不显著，处理后两组菌落总数和制备粪菌质量差异极显著(p＜0.01)。
从表中可以看出，本发明所制备的菌粪沉淀质量只有现有的技术的43％左右，但活菌数却是其的1.7倍。粪便中除了细菌等微生物，主要成份为食物消化后的残渣。粪菌移植治疗中，细菌能微生物对治疗有积极作用，而食物消化后的残渣为有害物质。本发明的制备方法不但提高了粪菌的活菌数还大大减少了食物消化残渣，能提高粪菌移植的临床疗效。
上述数据表明，本发明所述制备粪菌液工艺明显优于现有技术的一般处理方法，大大提高了粪菌移植液中的粪菌提取率和活细菌数。

Claims (8)

1.一种粪菌移植治疗中标准粪菌液制备工艺，其特征在于包括以下步骤：
(1)粪便匀质处理：包括采集粪便培养计数和制备粪便稀释液。
(2)逐级过滤：将粪便稀释液先后经过80-100目标准筛、250-300目标准筛、20μm滤膜、5μm滤膜、0.8μm滤膜过滤并收集滤液；
(3)离心，制备混悬液。
2.根据权利要求1所述的粪便移植治疗中标准粪菌液制备工艺，其特征在于所述步骤(1)具体操作为：无菌采集供体粪便置于无菌烧杯中进行培养计数；加入100-200倍体积的缓冲液，置于氮气生物工程橱中，将粪便搅匀至无明显大颗粒；所述缓冲液为含有5％甘油的氯化钠蛋白胨无菌4℃缓冲液。
3.根据权利要求1所述的粪便移植治疗中标准粪菌液制备工艺，其特征在于所述步骤(3)具体操作为：将逐级过滤收集的滤液置于无菌离心管中，3000-10000g离心力离心去上清，沉淀物加入两倍体积无菌生理盐水重新混悬；混悬后取混悬液以备培养。
4.根据权利要求1所述的粪便移植治疗中标准粪菌液制备工艺，其特征在于所述的粪菌培养计数选取对环境条件比较敏感且为益生菌的双歧杆菌作为检测指标。
5.根据权利要求4所述的粪便移植治疗中标准粪菌液制备工艺，其特征在于所述的粪菌培养计数包括以下步骤：BBL培养平板制备；涂板；培养计数。
6.根据权利要求4所述的粪便移植治疗中标准粪菌液制备工艺，其特征在于所述的BBL培养平板制备具体操作为：称取BBL培养基70g，加入1ml吐温80，加热溶于1000ml蒸馏水中，115℃灭菌20min；冷却至45-55℃后，倾倒至直径为90mm的无菌培养皿中，每皿10-15mL，置于无菌条件下冷却凝固。
7.根据权利要求4所述的粪便移植治疗中标准粪菌液制备工艺，其特征在于所述的涂板具体操作为：将取得的样品加至8-10倍体积的无菌生理盐水中，倍比稀释混匀，取107和108两个稀释度涂板。
8.根据权利要求4所述的粪便移植治疗中标准粪菌液制备工艺，其特征在于所述的培养计数具体操作为将培养板置于厌氧带中，放于培养箱中35℃-37℃厌氧培养72h，进行菌落计数。
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