CN104713895B - 基于氢核磁共振结合偏最小二乘法鉴别蜂蜜真假的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于氢核磁共振结合偏最小二乘法鉴别蜂蜜真假的方法。该方法涉及食品检测，是氢核磁共振指纹图谱在食品检测的应用。该方法首先分别建立纯蜂蜜数据库和糖浆掺假蜂蜜数据库，然后构建鉴别模型，对鉴别模型进行可靠性检验，再对待测蜂蜜样品的进行鉴别，并将待测蜂蜜样品的鉴别结果对数据库的进行扩充，以增加样品的代表性和判别能力。优点是：技术可靠，操作简单，可在短时间内处理大量样品，快速筛查出可疑蜂蜜样品，避免了主观因素、人为误差，结论科学可靠。

Description

基于氢核磁共振结合偏最小二乘法鉴别蜂蜜真假的方法

技术领域

本发明涉及食品检测，更具体涉及利用氢核磁共振指纹图谱结合偏最小二乘法鉴别蜂蜜中掺有糖浆的方法。

背景技术

蜂蜜是一种蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或者蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质(蜂蜜国家标准GB14963-2011GB)。作为一种天然保健品和营养品，深受广大消费者的青睐。尽管标准中明确规定蜂蜜是天然物质，不允许人为添加和去除任何物质，但目前国内市场上掺假蜂蜜泛滥成灾，严重损害了广大消费者的利益，影响了蜂蜜产业的健康发展。

蜂蜜市场掺假严重的原因主要有4点：(1)蜂蜜中主要糖类物质是葡萄糖、果糖，结构比较简单，同时受蜜源植物种类、花期长短、气候以及蜂蜜的加工、储存、结晶等多种因素影响，造成蜂蜜主要物质的含量波动范围较大。这些客观原因，使得蜂蜜掺假简单、方便；(2)目前掺假的主要手段是在蜂蜜中加入外源植物糖浆，例如玉米糖浆、甜菜糖浆、大米糖浆等。市场上糖浆的价格远低于蜂蜜的价格，不法生产厂商从掺假蜂蜜中能获得更多的经济利益；(3)掺假蜂蜜本身对人体危害程度不及其它一些掺假食品，没有引起消费者的高度警惕；(4)缺乏有效检测手段，导致打击蜂蜜掺假面临困难。

蜂蜜真实性检验的传统方法是感观鉴别、花粉分析以及化学分析。然而,这些方法费时,准确度和精确度较差。目前也发展了许多仪器检测方法，根据被测量的物理和化学性质可分为光谱分析法、电化学分析法、色谱分析法、质谱分析法、热量分析法等几类。这些方法都各有优缺点。例如，高效液相色谱曾广泛用于蜂蜜掺假的检测，但是该方法检测不到低浓度掺假以及掺加与蜂蜜成分相似的糖浆。稳定性碳同位素比值(¹³C/¹²C)法可以测定蜂蜜中掺入碳-4植物源的糖分，但是对于掺入的转化糖分(人造甜味剂等)以及由水稻、小麦、大豆等碳-3植物源制造的糖浆就很难区分开来。通过高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱可以检测大米糖浆的特征化合物，进而判断蜂蜜中是否掺有大米糖浆。但该技术只针对大米糖浆掺假，对于其他糖浆掺假则无法判断。检测技术的滞后影响到蜂蜜产品的质量保证和食用安全性，必须为蜂蜜的质量控制提供新的方法和思路。因此如何鉴别蜂蜜产品掺假已经成为我国蜂蜜产业亟待解决的问题。有必要开展蜂蜜真伪鉴定的研究，以保护消费者利益和保证蜂蜜产业健康发展。

核磁共振(NMR)是一种非常重要的研究和分析测试工具，在化学、生物、医学等领域中得到广泛应用，对有机小分子和生物大分子的结构解析具有重要作用。核磁共振技术有如下特点：(1)样品预处理简单，无需预筛选，可以避免由于分离所造成的微小成分的丢失；(2)无损伤性，不会破坏样品的结构和性质，可以进行实时和动态的检测；(3)谱图中信号的相对强弱直接反映了样品中各组分的相对含量；(4)可设计多种编辑手段，实验方法灵活多样。

采用氢核磁共振(¹H NMR)技术测试食品等复杂混合体系可以得到体系中许多化学成分的信息，但是各种成分信号的重叠也使得图谱变得十分复杂。通常，仅靠肉眼观察只能从核磁共振图谱中获得很有限的信息。而多元统计分析可以有效而全面地分析复杂的谱图数据，能够从复杂的数据中最大限度的提取信息。应用多元统计分析方法建立的数学模型，就能从未知样品的¹H NMR谱图中预测样品的成分、性质等信息。因此，¹H-NMR结合多元统计分析方法对食品的定性分析提供了一条新的思路和方法，也是目前食品整体质量检测的理想方法。

针对现行的一些蜂蜜质量检测方法只关注某一种或者几种成分的含量和变化，提出了以¹H-NMR技术结合偏最小二乘法建立蜂蜜掺假的鉴别方法。

发明内容

本发明的目的是，提供一种基于氢核磁共振结合偏最小二乘法鉴别蜂蜜真假的方法。该方法首先分别建立纯蜂蜜数据库和糖浆掺假蜂蜜数据库，然后构建鉴别模型，对鉴别模型进行可靠性检验，再对待测蜂蜜样品的进行鉴别，并将待测蜂蜜样品的鉴别结果对数据库的进行扩充，以增加样品的代表性和判别能力。优点是：技术可靠，操作简单，可在短时间内处理大量样品，避免了主观因素、人为误差，结论科学可靠。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种基于氢核磁共振结合偏最小二乘法鉴别蜂蜜真假的方法，该方法包含下列步骤：

(a)建立纯蜂蜜数据库

(a1)收集N个纯蜂蜜样品，N不少于80；

(a2)在N个纯蜂蜜样品中取一个纯蜂蜜样品一份；

(a3)将样品置于离心管中，在60℃水浴至蜂蜜完全溶解，再加入样品体积8～15倍的磷酸盐缓冲溶液，涡旋振荡至均匀混合，离心，取上清液；

(a4)将步骤(a3)中的上清液转移到核磁共振管中，在500MHz液体核磁共振谱仪上进行¹H NMR测试，实验温度为298K，用D₂O进行锁场，采用noesypr1d脉冲序列，90°脉冲宽度9.7微秒，混合时间100.0毫秒，¹H NMR谱的谱宽为10kHz，采样点数32768，延迟等待时间2.0秒，累加48次，得到样品的核磁共振信号；

(a5)用核磁共振谱仪自带的数据处理软件对样品的核磁共振信号进行傅里叶变换，变换点数为131072，指数线宽因子为1Hz，手动调相位和基线校正，2,2,3,3-氘代三甲基硅烷丙酸钠作为内标物，共振峰设为δ0.00，进行化学位移定标，得到样品的¹H NMR谱图；

(a6)对¹H NMR谱图进行分段积分，积分范围为化学位移δ0.1-δ6.0之间，积分间隔为δ0.01，将¹H NMR谱中δ4.73-4.93区域的信号剔除，采用峰面积归一化，得到强度积分相对值的一组数据；

(a7)在N个纯蜂蜜样品中，逐一取样品，按照步骤(a3)～(a6)的方法，得到N组数据，每组数据为一行，第1行为化学位移值，构成纯蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵；

(b)建立糖浆掺假蜂蜜数据库

(b1)从质检部门查获的糖浆掺假蜂蜜中收集M个样品，M不少于40；

(b2)在M个糖浆掺假蜂蜜样品中，逐一取样品，按照步骤(a3)～(a6)的方法，得到M组数据，每组数据为一行，第1行为化学位移值，构成糖浆掺假蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵；

(c)构建鉴别模型

对纯蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵和糖浆掺假蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵进行标准化，标准化方法采用自适换算；类别变量Y代表样品的类型，数值为“1”，代表纯蜂蜜样品，数值为“2”，代表糖浆掺假蜂蜜样品，阈值设为0.5；采用偏最小二乘法将经过标准化处理的纯蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵、糖浆掺假蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵与类别变量Y进行线性回归，得到鉴别模型；

(d)鉴别模型的可靠性检验

采用排列实验法对鉴别模型的可靠性进行检验：通过n次随机改变类别变量的排列顺序，得到相应不同的累积贡献率值R²和预测能力值Q²，n≥100；然后对类别变量顺序随机排列模型的R²值和Q²值与类别变量顺序未改变模型的R²值和Q²值之间做回归线，如果类别变量顺序未改变模型的Q²值大于任何一个类别变量随机排列模型的Q²值，说明鉴别模型可靠有效，可以使用；

(e)蜂蜜样品的鉴别

将待鉴别蜂蜜样品按步骤(a3)～(a6)的方法，得到强度积分相对值的一组数据；将其导入步骤(c)中的鉴别模型，得到类别变量Y的数值，当类别变量Y在1±0.5之间时，待鉴别蜂蜜样品为纯蜂蜜，当类别变量Y在2±0.5之间时，待鉴别蜂蜜样品为糖浆掺假蜂蜜，当类别变量Y＝1.5时，不能确定待鉴别蜂蜜样品是纯蜂蜜还是糖浆掺假蜂蜜；

(f)数据库的扩充

如果待鉴别蜂蜜样品的鉴别结果为纯蜂蜜，在步骤(a7)的纯蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵中增加一行该待鉴别蜂蜜样品的强度积分相对值的一组数据，得到新的纯蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵，并用该矩阵更新原步骤(a7)的纯蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵；

如果待鉴别蜂蜜样品的鉴别结果为糖浆掺假蜂蜜，在步骤(b2)的糖浆掺假蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵中增加一行该待鉴别蜂蜜样品的强度积分相对值的一组数据，得到新的糖浆掺假蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵，并用该矩阵更新原步骤(b2)的糖浆掺假蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵。以扩充数据库和增加样品的代表性和判别能力。

与现有技术相比，采用本发明鉴别蜂蜜的真假具有以下优点：

(1)¹H-NMR对蜂蜜样品进行检测，样品预处理要求不高，技术成熟可靠，操作简单易行，可以实现高通量测试，短时间内处理大量样品。

(2)偏最小二乘法可以有效而全面地分析复杂的谱图数据，能够从复杂的数据中最大限度的提取信息，避免主观因素、人为误差，结论科学可靠。

(3)整个方法准确可靠、简单高效，可以通过增加数据库容量，扩大使用范围，提高准确率，对完善目前蜂蜜质量检测技术体系具有重要意义。

附图说明

图1是纯蜂蜜样品(a)与糖浆掺假蜂蜜样品(b)的¹H NMR谱图。

图2是纯蜂蜜样品与糖浆掺假蜂蜜样品的偏最小二乘法得分散点图(1-纯蜂蜜样品○；2-糖浆掺假蜂蜜样品△)。

图3是纯蜂蜜样品与糖浆掺假蜂蜜样品类别变量Y的计算值与实际值之间的关系(“1”代表纯蜂蜜，“2”代表糖浆掺假蜂蜜)。

图4鉴别模型的可靠性验证(排列实验Permutation Test)。

图5是待鉴别蜂蜜样品类别变量Y的计算值。

具体实施方式

1.仪器、试剂与样品

1.1仪器：

500MHz液体核磁共振谱仪(Bruker AVANCE)，瑞士Bruker Biospin公司；微量台式离心机(Sorvall Legend Micro 17R)，美国Thermo Scientific公司；电子天平(AL104)，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；5mm核磁管(ST500-7)，美国Norell公司

1.2试剂：

K₂HPO₄·3H₂O和NaH₂PO₄·2H₂O(分析纯)购于上海国药集团试剂有限公司。NaN₃(分析纯)购于天津福晨化学试剂厂。重水(D₂O，99.9％氘代，含2,2,3,3-氘代三甲基硅烷丙酸钠(TSP)，0.05wt％)购于Cambridge Isotope Laboratories公司。用于样品制备的磷酸盐缓冲溶液(K₂HPO₄:NaH₂PO₄＝4:1,0.15mol/L,pH 7.40)使用含10％D₂O的双蒸水配制而成。其中缓冲溶液包含的TSP和NaN₃(0.01％，w/v)分别用作化学位移内标物和防腐剂。

1.3样品：

纯蜂蜜样品来自湖北省仙桃、松滋、汉川以及湖南澧县等地区的养蜂场，为保证样品的真实性，直接从蜂箱中的巢脾取样，选取自然酿造成熟的封盖蜂蜜采集。共采集24个养蜂场154个纯蜂蜜样品。蜂蜜收集后，储藏在6-8℃冰箱中备用。其中122个纯蜂蜜样品用于纯蜂蜜数据库的建立

收集到糖浆掺假蜂蜜样品共60份，其中48份用于糖浆掺假蜂蜜数据库的建立。

2.纯蜂蜜数据库的建立

2.1收集122个纯蜂蜜样品；

2.2在122个纯蜂蜜样品中称取一个纯蜂蜜样品，称取范围为40.0mg-60.0mg，其中优选称取50.0mg；

2.3将样品置于离心管中，再加入0.6mL磷酸盐缓冲溶液，涡旋振荡10分钟至均匀混合，再离心10分钟，取上清液

2.4将步骤(2.3)中的上清液转移0.55mL到核磁共振管中，在500MHz液体核磁共振谱仪上进行¹H NMR测试，实验温度为298K，利用D₂O进行锁场。采用noesypr1d脉冲序列(90°-t₁-90°-t_m-90°-采样)采集一维¹H NMR谱。序列中90°脉冲持续的时间为9.7微秒，t₁(脉冲间隔)和t_m(混合时间)分别设为4.0微秒和100.0毫秒。采用预饱和方法进行水峰抑制，即施加强度50-80Hz的低功率连续波脉冲照射水峰，持续时间2.0秒。谱宽为10kHz，采样点数32768，延迟等待时间2.0秒，信号累加48次，得到样品的核磁共振信号；

2.5使用核磁共振谱仪自带的数据处理软件对样品的核磁共振信号进行傅里叶变换，变换点数为131072，指数线宽因子为1Hz，手动调相位和基线校正，2,2,3,3-氘代三甲基硅烷丙酸钠(TSP)作为内标物(共振峰设为δ0.00)，进行化学位移定标，得到样品的¹H NMR谱图；

2.6对¹H NMR谱图进行分段积分，积分范围为化学位移δ0.1-δ6.0之间，积分间隔为δ0.01。为消除残余水信号的影响，将¹H NMR谱中δ4.73-4.93区域的信号剔除。共571个积分段。采用峰面积归一化，即各分段积分值除以积分区域总的峰面积，得到强度积分相对值的一组数据；

2.7在122个纯蜂蜜样品中，逐一取样品，按照步骤(2.3)～(2.6)的方法，得到122组强度积分相对值数据，每组数据一行，第1行为化学位移值，构成纯蜂蜜样品强度积分相对值的数据矩阵；

3.糖浆掺假蜂蜜数据库的建立

3.1从质检部门查获的糖浆掺假蜂蜜中收集48个样品；

3.2在48个糖浆掺假蜂蜜样品中，逐一取样品，按照步骤(2.3)～(2.6)的方法，得到48组数据，每组数据一行，第1行为化学位移值，构成糖浆掺假蜂蜜样品强度积分相对值的数据矩阵；

4.鉴别模型的构建

对122个纯蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵和48个糖浆掺假蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵进行标准化，标准化方法采用自适换算(Unit Variance Scaling)。纯蜂蜜样品和糖浆掺假蜂蜜样品的类别变量值分别为1和2，阈值设定为0.5。采用偏最小二乘法将经过标准化处理的纯蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵、糖浆掺假蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵(X变量)与类别变量(Y变量)进行线性回归，得到鉴别模型。

鉴别模型中，前7个主成分对X变量以及分类Y变量的累计贡献率分别为73.8％、95.8％，其中第1成分和第2成分对Y变量的贡献率分别为76.1％、4.29％(累积贡献率为80.4％)。以成分1的得分值(t[1])和成分2的得分值(t[2])分别作为横纵坐标绘制得分散点图。如图2(纯蜂蜜样品与糖浆掺假蜂蜜样品的得分散点图)所示，纯蜂蜜样品和糖浆掺假蜂蜜样品可以在得分散点图上明显区分，即组内聚集、组间很好的分开。说明纯蜂蜜样品和糖浆掺假蜂蜜样品存在明显差异。

利用鉴别模型对170个样品(122个纯蜂蜜样品，48个糖浆掺假蜂蜜样品)的类别变量Y进行了计算。计算值在1±0.5之间的样品为纯蜂蜜样品，计算值在2±0.5之间的为糖浆掺假样品。若Y的计算值不在上述范围内，则判定样品归类不明确。图3给出了122个纯蜂蜜样品和48个糖浆掺假样品类别变量Y的计算值与实际值之间的关系。122个纯蜂蜜样品，48个糖浆掺假样品都得到了正确分类。纯蜂蜜样品类别变量Y的计算值相对集中，而掺假样品类变量Y计算值较分散。

为验证鉴别模型的可靠性，采用排列实验(Permutation Test)法。该方法保持X变量不变，通过随机变化Y变量的顺序，观察多个Y变量的顺序随机排列的模型与原始Y变量模型之间的差异。然后对Y变量顺序随机排列模型的R²值和Q²值与原始鉴别模型的R²值和Q²值之间做回归线。鉴别模型可靠性的验证如图4所示，共进行160次随机排列，R²回归线和Q²回归线与纵轴的截距分别为0.642、-0.115。最右端原始鉴别模型的Q²值大于左边任何一个Y变量随机排列模型的Q²值。因此模型验证结果显示模型有效可靠。

6.鉴别蜂蜜样品

将待鉴别的44份蜂蜜样品按步骤(2.3)～(2.6)的方法进行操作，获得相应的强度积分相对值数据，导入步骤(4)中得到的鉴别模型。通过鉴别模型计算类别变量值，判断样品属于纯蜂蜜还是糖浆掺假蜂蜜。图5显示的是44份蜂蜜样品类别变量Y的计算值。计算值在1±0.5之间的样品为纯蜂蜜样品，预测值在2±0.5之间的为糖浆掺假样品。按照上述规则，32个纯蜂蜜样品，12个糖浆掺假蜂蜜样品都得到了正确分类，总体鉴别正确率为100％。

Claims (1)

1.基于氢核磁共振结合偏最小二乘法鉴别蜂蜜真假的方法，其特征在于，该方法包含下列步骤：

(a)建立纯蜂蜜数据库

(a1)收集N个纯蜂蜜样品，N不少于80；

(a2)在N个纯蜂蜜样品中取一个纯蜂蜜样品一份；

(a3)将样品置于离心管中，在60℃水浴至蜂蜜完全溶解，再加入样品体积8～15倍的磷酸盐缓冲溶液，涡旋振荡至均匀混合，离心，取上清液；

(a4)将步骤(a3)中的上清液转移到核磁共振管中，在500MHz液体核磁共振谱仪上进行¹H NMR测试，实验温度为298K，用D₂O进行锁场，采用noesypr1d脉冲序列，90°脉冲宽度9.7微秒，混合时间100.0毫秒，¹H NMR谱的谱宽为10kHz，采样点数32768，延迟等待时间2.0秒，累加48次，得到样品的核磁共振信号；

(a5)用核磁共振谱仪自带的数据处理软件对样品的核磁共振信号进行傅里叶变换，变换点数为131072，指数线宽因子为1Hz，手动调相位和基线校正，2,2,3,3-氘代三甲基硅烷丙酸钠作为内标物，共振峰设为δ0.00，进行化学位移定标，得到样品的¹H NMR谱图；

(a6)对¹H NMR谱图进行分段积分，积分范围为化学位移δ0.1-δ6.0之间，积分间隔为δ0.01，将¹H NMR谱中δ4.73-4.93区域的信号剔除，采用峰面积归一化，得到强度积分相对值的一组数据；

(a7)在N个纯蜂蜜样品中，逐一取样品，按照步骤(a3)～(a6)的方法，得到N组数据，每组数据为一行，第1行为化学位移值，构成纯蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵；

(b)建立糖浆掺假蜂蜜数据库

(b1)从质检部门查获的糖浆掺假蜂蜜中收集M个样品，M不少于40；

(b2)在M个糖浆掺假蜂蜜样品中，逐一取样品，按照步骤(a3)～(a6)的方法，得到M组数据，每组数据为一行，第1行为化学位移值，构成糖浆掺假蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵；

(c)构建鉴别模型

对纯蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵和糖浆掺假蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵进行标准化，标准化方法采用自适换算；类别变量Y代表样品的类型，数值为“1”，代表纯蜂蜜样品，数值为“2”，代表糖浆掺假蜂蜜样品，阈值设为0.5；采用偏最小二乘法将经过标准化处理的纯蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵、糖浆掺假蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵与类别变量Y进行线性回归，得到鉴别模型；

(d)鉴别模型的可靠性检验

采用排列实验法对鉴别模型的可靠性进行检验：通过n次随机改变类别变量的排列顺序，得到相应不同的累积贡献率值R²和预测能力值Q²，n≥100；然后对类别变量顺序随机排列模型的R²值和Q²值与类别变量顺序未改变模型的R²值和Q²值之间做回归线，如果类别变量顺序未改变模型的Q²值大于任何一个类别变量随机排列模型的Q²值，说明鉴别模型可靠有效，可以使用；

(e)蜂蜜样品的鉴别

将待鉴别蜂蜜样品按步骤(a3)～(a6)的方法，得到强度积分相对值的一组数据；将其导入步骤(c)中的鉴别模型，得到类别变量Y的数值，当类别变量Y在1±0.5之间时，待鉴别蜂蜜样品为纯蜂蜜，当类别变量Y在2±0.5之间时，待鉴别蜂蜜样品为糖浆掺假蜂蜜；

(f)数据库的扩充

如果待鉴别蜂蜜样品的鉴别结果为纯蜂蜜，在步骤(a7)的纯蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵中增加一行该待鉴别蜂蜜样品的强度积分相对值的一组数据，得到新的纯蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵，并用该矩阵更新原步骤(a7)的纯蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵；

如果待鉴别蜂蜜样品的鉴别结果为糖浆掺假蜂蜜，在步骤(b2)的糖浆掺假蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵中增加一行该待鉴别蜂蜜样品的强度积分相对值的一组数据，得到新的糖浆掺假蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵，并用该矩阵更新原步骤(b2)的糖浆掺假蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵。