CN103083645A - 神经调节素1及其受体作为制备或筛选抗癫痫药物靶点的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及神经调节素1(NRG1)及其受体作为制备或筛选抗癫痫药物靶点的用途。本发明首次提出NRG1通过激活脑内的抑制性神经元中的鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4(ErbB4)来抑制癫痫的发生发展过程，为有效预防、控制或治疗癫痫病提供了新靶标。

Description

神经调节素1及其受体作为制备或筛选抗癫痫药物靶点的用途

技术领域

本发明属于生物技术和医药领域，更具体地，本发明涉及神经调节素1及其受体作为制备或筛选抗癫痫药物靶点的用途。 

背景技术

癫痫病是大脑神经元突发性异常放电导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性、破坏性神经***疾病，颞叶癫痫是其最常见的一种，由于异常放电神经元所涉及的部位不同，可表现为发作的运动、感觉、植物神经、意识及精神障碍。癫痫病(Epilepsy)是一种危及人类健康的常见疾病，其发病率约占世界各地的约1-2％，目前本领域中对其还缺乏有效的治疗手段(McNamara，J.O.，Huang，Y.Z.& Leonard，A.S.Molecular signaling mechanisms underlying epileptogenesis.Sci STKE 2006，2006：12；Morimoto，K.，Fahnestock，M.& Racine，R.J.Kindling and status epilepticus models of epilepsy：rewiring the brain.Prog Neurobiol2004，73：1-60)。 

在癫痫发病过程中，异常电活动可以触发一系列信号级联反应，诱导神经多肽和神经营养因子的表达。过去的几十年中许多研究就这些营养因子的活性表达是否癫痫有干预作用进行了大量的观察和研究。一些促进癫痫的产生的因子如脑源性生长因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)被鉴定出来，但是那些在这个过程中起着对体内稳态的反向制衡作用的生长因子却鲜为人知。更重要的是，目前已经鉴定出来的那些营养因子如BDNF和神经肽Y都对体内本底状态(而不仅仅是癫痫活动状态)的神经元兴奋性和突触传递产生着重要的作用。针对这些靶点的药物或干预操作势必带着很严重甚至是致命性的副作用，从而限制了其在癫痫病中的实践应用。 

综上，尽管目前已知一些癫痫在遗传学和流行病学上的病因，本领域人员除了外科切除手术以外仍然没有找到理想的抗癫痫靶点和有效的药物。因此，本领域迫切需要从癫痫发病机制出发，研究找到抗癫痫靶点以及药物。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种神经调节素1(NRG1)或其上调剂的用途。 

本发明的另一目的在于提供一种鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4(ErbB4)磷酸化促进剂的用途。 

本发明的另一目的在于提供一种基于NRG1、ErbB4及其相互作用来筛选药物的方法。 

在本发明的第一方面，提供一种神经调节素1(NRG1)或其上调剂的用途，用于制备预防、改善或治疗癫痫的组合物。 

在一个优选例中，所述的神经调节素1通过与鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4(ErbB4)相互作用，促进鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4磷酸化，预防、改善或治疗癫痫。 

在另一优选例中，所述的神经调节素1的上调剂包括：神经调节素1的功能片段；重组表达神经调节素1或其功能片段的质粒。 

在另一优选例中，所述的功能片段含NRG1的EGF功能区。在另一优选例中，所述的功能片段是如GenBank登录号NM_013956.3中第176-246位(含NRG1的EGF功能区)的多肽或该多肽的变异体或衍生物。 

在另一优选例中，所述的神经调节素1选自：氨基酸序列如GenBank登录号NM_013956.3或其中第176-246位(含NRG1的EGF功能区)的多肽或该多肽的变异体或衍生物。更佳地，所述的变异体或衍生物选自：将GenBank NM_013956.3或其中第176-246位(含NRG1的EGF功能区)所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有GenBank登录号NM_013956.3的多肽功能的多肽；或与GenBank登录号NM_013956.3或其中第176-246位(含NRG1的EGF功能区)所示氨基酸序列的多肽的序列相同性高于70％，且具有GenBank登录号NM_013956.3多肽功能的多肽。 

在另一优选例中，所述的上调剂包括(但不限于)：激动剂、激活剂、促进剂。 

在另一优选例中，所述的神经调节素1通过与鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4(ErbB4)相互作用，促进鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4磷酸化，调控(较佳地，为激活)下游的PI3K-Akt-S6K通路和/或促进AKT蛋白的磷酸化水平，从而预防、改善或治疗癫痫。 

在另一优选例中，所述的组合物用于： 

延缓癫痫的形成；和/或 

抑制癫痫持续状态；和/或 

提高鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4磷酸化的水平；和/或 

减弱癫痫发作引起的脑兴奋性程度；和/或 

抑制苔藓纤维发芽；和/或 

调控(较佳地，为激活)下游的PI3K-Akt-S6K通路；和/或 

促进AKT蛋白的磷酸化水平。 

在本发明的另一方面，提供一种鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4(ErbB4)磷酸化促进剂的用途，用于制备预防、改善或治疗癫痫的组合物。 

在一个优选例中，所述的鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化促进剂选自(但不限于)：鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的特异性配体，鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化激酶区域激活剂。 

在另一优选例中，所述的鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的特异性配体选自(但不限于)：神经调节素1。 

在另一优选例中，所述的组合物用于： 

延缓癫痫的形成；和/或 

抑制癫痫持续状态；和/或 

减弱癫痫发作引起的脑兴奋性程度；和/或 

抑制苔藓纤维发芽。 

在本发明的另一方面，提供一种神经调节素1和/或鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的用途，用于筛选预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。 

在本发明的另一方面，提供一种筛选预防、改善或治疗癫痫的潜在物质的方法，包括以下步骤： 

(a)将候选物质与表达神经调节素1和/或鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的体系接触； 

(b)检测神经调节素1的表达或活性，若所述候选物质在统计学上提高(如提高20％以上；更佳地提高40％以上；更佳地提高60％以上)神经调节素1的表达或活性，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质；和/或 

检测鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化水平，若所述候选物质在统计学上提高(如提高20％以上；更佳地提高40％以上；更佳地提高60％以上)鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化水平，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。 

在一个优选例中，步骤(a)包括：在测试组中，在表达神经调节素1和/或鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的体系中添加候选物质；在步骤(b)中，检测神经调节素1的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、表达神经调节素1和/或鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的体系；若测试组中Neuregulin1的表达或活性在统计学上高于(如提高20％以上；更佳地提高40％以上；更佳地提高60％以上)对照组，就表明该候选物质是抗癫痫的潜在物质。 

在另一优选例中，步骤(a)包括：在测试组中，在表达神经调节素1和/或鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的体系中添加候选物质；在步骤(b)中，检测鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化水平，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、表达神经调节素1和/或鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的体系；若测试组中鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化水平在统计学上高于(如提高20％以上；更佳地提高40％以上；更佳地提高60％以上)对照组，就表明该候选物质是抗癫痫的潜在物质。 

在另一优选例中，通过分析鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的受体酪氨酸激酶活性确定鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化水平。 

在另一优选例中，步骤(a)中，所述的体系表达神经调节素1和鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4，两者发生相互作用； 

步骤(b)中，检测神经调节素1和鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4相互作用情况，若所述候选物质在统计学上促进(如促进20％以上；更佳地促进40％以上；更佳地促进60％以上)神经调节素1和鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的相互作用，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。 

在另一优选例中，步骤(a)包括：在测试组中，在表达神经调节素1和鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的体系中添加候选物质；在步骤(b)中，检测神经调节素1和鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4相互作用情 况，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、表达神经调节素1和鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的体系；若测试组中检测神经调节素1和鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4相互作用在统计学上被促进(如促进20％以上；更佳地促进40％以上；更佳地促进60％以上)对照组，就表明该候选物质是抗癫痫的潜在物质。 

在另一优选例中，步骤(b)中，所述的检测鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化水平包括：检测鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4氨基酸序列中第1056位(相应于GenBank登录号NM_005235.2的氨基酸序列的第1056位)的酪氨酸的磷酸化水平，若该位点的磷酸化水平在统计学上提高(如提高20％以上；更佳地提高40％以上；更佳地提高60％以上)，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。 

在另一优选例中，所述的表达神经调节素1和/或鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的体系中还包括AKT信号通路(较佳地为PI3K-Akt-S6K信号通路)；步骤(b)中，所述方法还包括： 

检测AKT信号通路的激活状况或检测AKT蛋白的磷酸化水平，若AKT信号通路被激活或者AKT蛋白的磷酸化水平在统计学上提高(如提高20％以上；更佳地提高40％以上；更佳地提高60％以上)，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。 

在另一优选例中，所述体系选自：溶液体系、细胞体系、组织体系、器官体系、或动物体系。较佳地，所述的体系是细胞体系；更佳地所述的细胞体系是神经元细胞；更佳地所述的神经元细胞选自：PV阳性中间神经元细胞；海马神经元细胞；大脑皮层细胞。 

在另一优选例中，所述的动物体系为癫痫动物模型。较佳地，所述的动物体系选自(但不限于)：电刺激点燃癫痫动物模型，或匹罗卡品癫痫动物模型。 

在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对所述神经调节素1和/或鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4设计的小分子化合物、重组表达载体。 

在本发明的另一方面，提供采用所述筛选方法获得的抗癫痫的潜在物质。 

在本发明的另一方面，提供一种神经调节素1的用途，用于制备检测癫痫的试剂。 

在本发明的另一方面，提供一种特异性识别神经调节素1或其编码基因的试剂的用途，用于制备检测癫痫的试剂或试剂盒。 

较佳的，所述的特异性识别神经调节素1或其编码基因的试剂选自： 

特异性扩增神经调节素1编码基因的引物； 

特异性识别神经调节素1编码基因的探针；或 

特异性结合神经调节素1的抗体或配体。 

在本发明的另一方面，提供一种检测癫痫的试剂盒，所述的试剂盒中含有：特异性识别神经调节素1或其编码基因的试剂。 

在本发明的另一方面，提供一种特异性检测鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4磷酸化水平的试剂的用途，用于制备检测癫痫的试剂或试剂盒。 

在一个优选例中，所述的特异性检测鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4磷酸化水平的试剂是识别磷酸化的鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的抗体。 

在本发明的另一方面，提供一种检测癫痫的试剂盒，所述的试剂盒中含有：特异性检测鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4磷酸化水平的试剂。 

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。 

附图说明

图1、癫痫发作活动诱导上调大鼠脑内Nrg1基因的表达和ErbB4受体的激活。 

(a)癫痫活动后大鼠海马组织内Nrg1 mRNA水平的分析结果。左侧(Stim)，电刺激点燃癫痫模型及对照(未电刺激，Unstim)的结果；右侧(Pilo)，匹罗卡品癫痫模型及对照(匹罗卡品模型，给予溶液对照(Vehicle))。上半部分：RT-PCR实验的结果；下半部分：Real-time PCR实验的结果。Nrg1 mRNA的水平被标准化为Gapdh mRNA表达水平的相对倍数。 

(b)癫痫发作上调脑内的NRG1蛋白表达水平。提取的海马组织匀浆用针 对NRG1的ELISA试剂盒进行检测。每个时间点的NRG1平均水平以未刺激组(大鼠点燃模型)或溶剂对照组(匹罗卡品模型)作为对照进行标准化。 

(c)大鼠冠状脑片上的Nrg1 mRNA原位杂交结果。英文缩略词：Ctx，皮层；Hip，海马；Tha，丘脑；Amyg，杏仁核；Pir，梨状皮层。标尺：1000μm。 

(d)Western免疫印迹结果显示癫痫活动后大鼠海马内ErbB4表达及其磷酸化的水平的变化情况。左侧，电刺激点燃模型；右侧，匹罗卡品模型。以GAPDH表达水平为参照。 

(e)对Western免疫印迹结果的相对定量分析。 

*P＜0.05，**P＜0.01和***P＜0.01；one-way ANOVA with post hoc Dunnett’s test。 

图2、不同的剪切体形式的大鼠Nrg1mRNA的水平均在癫痫发作后上调。用RT-PCR(a和b)和荧光定量PCR(c和d)分别证明了电刺激点燃模型(a和c)和匹罗卡品模型(b和d)大鼠海马组织内Nrg1-typeI、II和III等型mRNA水平受癫痫发作活动调控的时间依赖性变化。*P＜0.05，**P＜0.01和***P＜0.001，one-way ANOVA with post hoc Dunnett’s test。 

图3、小鼠脑内的颞叶癫痫发作也上调NRG1-ErbB4信号***的活性。 

(a)RT-PCR结果显示Nrg1mRNA及其不同剪切体的水平在癫痫发作后上调。左侧：点燃模型；右侧：匹罗卡品模型。 

(b)Real-time PCR实验的分析结果。 

(c)对小鼠癫痫模型海马内ErbB4和p-ErbB4的Western免疫印迹分析结果。左侧：点燃模型。右侧：匹罗卡品模型。上图：代表性的免疫印迹。中图和下图：统计分析的结果。*P＜0.05和**P＜0.01；one-way ANOVA。 

图4、NRG1、ecto-ErbB4和PD158780对DIV14大鼠体外培养神经元的ErbB4磷酸化状态的不同影响。 

(a)NRG1以剂量依赖的方式激活ErbB4磷酸化。对海马神经元以NRG1处理10min后裂解进行Western免疫印迹实验。 

(b)ecto-ErbB4可以阻断外源性NRG1对ErbB4磷酸化的激活作用。给予神经元ecto-ErbB4处理10min后再给予NRG1(终浓度10nM)处理10min后提取细胞总蛋白。 

(c)NRG1对ErbB4的激活作用可以被PD158780阻断。以GAPDH作为上样对照蛋白。 

图5、脑内注射NRG1、ecto-ErbB4和PD158780对正常大鼠和癫痫模型大鼠脑内ErbB4磷酸化水平的不同影响。 

(a)脑内注射NRG1重组蛋白(10μM，5μL，i.c.v)在正常动物和癫痫发作之后都可以显著脑内ErbB4磷酸化的水平。 

(b)脑内注射ecto-ErbB4(1μg/μL，i.c.v.)可以有效阻断内源性的NRG1从而阻止其激活ErbB4的磷酸化。 

(c)脑内注射抑制剂PD158780(2mM，i.c.v.)可以显著抑制ErbB4的磷酸化。给予PD158780后，癫痫发作也不能明显上调ErbB4磷酸化水平。 

以上实验中，脑内注射30分钟后，动物处死取脑，裂解海马组织提取总蛋白。GAPDH为上样参照。 

图6、改变NRG1-ErbB4信号***的活性对电刺激点燃模型癫痫发生的影响。 

(a)实验流程示意图。 

(b)脑内注射外源性NRG1重组蛋白(10μM，5μL，i.c.v.；n＝7)对大鼠点燃进程的影响。中左：行为学发作级别的进展；中右：诱发的脑电图放电发作持续时间(ESD)；最右：达到第一次1级、3级和完全点燃状态所需要的刺激次数。以注射溶剂(n＝9)和变性失活的NRG1蛋白(n＝5)的大鼠作为对照。 

(c和d)分别脑内注射ecto-ErbB4(c；1μg/μL，i.c.v.；n＝6)以阻断内源性NRG1的活性、或PD158780(d；2mM，i.c.v.；n＝11)以抑制ErbB受体磷酸化活性对点燃进程的影响。n＝8(c)或n＝7(d)，溶剂处理对照组；n＝6，变性失活的ecto-ErbB4处理对照组(c)。各图中的阴影部分指代在点燃过程中注射蛋白或药物试剂的部分。电刺激的强度与阈值电刺激的强度一致，刺激次数指的是能诱发出3秒或以上的脑电图放电发作的有效刺激的次数。完全点燃状态定义为连续3次出现行为学5级发作。 

(e)诱发第一次5级行为学癫痫发作时的各组大鼠的代表性脑电图。黑色箭头指示电刺激，白色箭头指示电刺激后脑电图上的短暂不应期，截短箭头指示的是脑电图放电发作的终止。 

*P＜0.05，**P＜0.01和***P＜0.001，与溶剂组处理相比； 

P＜0.05和 

P＜0.01与变性失活的NRG1或ecto-ErbB4处理组相比；one-way ANOVA with post hoc Bonferrom’s test。 

图7、脑内注射NRG1对大鼠匹罗卡品模型癫痫发作的影响。 

(a)NRG1(10μM，5μL)注射30分钟后匹罗卡品给药引起第1次5级行为学癫痫发作所需要的时间。 

(b)两组大鼠在匹罗卡品给药40分钟时的癫痫发作强度比较。每个数据点代表一例动物。*P＜0.05和**P＜0.01；双侧t检验。 

图8、在脑内敲除ErbB4基因导致电刺激点燃诱导的癫痫发生明显增快。 

(a)心脏重表达的ErbB4基因敲除小鼠的鉴定。鼠尾基因组抽提鉴定显示，野生型小鼠出现一条约150bp的条带，而纯合子敲除小鼠出现约一条约320bp的条带。心脏组织重新表达的转基因条带鉴定时显示约500bp的条带。 

(b)Western免疫印迹实验显示，ErbB4敲除小鼠大脑的海马内检测不到ErbB4及其磷酸化的表达水平。GAPDH为上样参照蛋白。 

(c)ErbB4敲除鼠的纯合子-/-)、杂合子(+/-)和野生型(+/+)之间的电刺激阈值没有明显差别。P＝0.390；one-way ANOVA。图中每个数据点来自一只小鼠。 

(d和e)纯合子(n＝4)、杂合子(n＝27)的ErbB4敲除鼠及其野生型对照小鼠(n＝30)的电刺激点燃进程比较。d图上半部分，行为学发作级别的进展；d图下半部分，各组小鼠达到第一次1级、3级和完全点燃状态所需要的平均刺激次数；e图，电刺激所诱发的脑电图发作放电时程。统计数据代表均数±标准差。 

*P＜0.05，**P＜0.01和***P＜0.001，与野生型(ErbB4+/+)相比；one-way ANOVA with post hoc Dunnett’s test。 

图9、特异性地在CaMKIIα阳性的神经元中敲除ErbB4的CaMkIIα-iCre；ErbB4^-/-和CaMkIIα-CreER；ErbB4^-/-两种小鼠脑内Cre重组酶和ErbB4的表达情况及其ErbB4磷酸化水平分析。 

(a)免疫组织化学染色显示CaMkIIα-iCre；ErbB4^-/-小鼠脑内Cre重组酶的表达情况。Cre免疫染色可明显见于海马和皮层。左侧：没有携带Cre转基因的ErbB4-floxed同窝对照显示Cre染色为阴性。中部：右图中框内的放大图。Scale bars：左侧与中间，100μm；右侧，600μm。 

(b)对CaMkIIα-iCre；ErbB4^-/-小鼠脑片的免疫荧光染色显示Cre特异性地表达于CaMkIIα阳性的神经元中。Scale bar：25μm。 

(c)Western blot分析结果显示，CaMkIIα-iCre；ErbB4^-/-小鼠海马的ErbB4表达量明显降低，而p-ErbB4的水平变化不大。 

(d)CaMKIIα-iCre；ErbB4^-/-小鼠在电刺激点燃引起的癫痫发作前后ErbB4和p-ErbB4表达水平的western免疫印迹分析。 

(e)CaMkIIα-CreER；ErbB4^{floxed/floxed}小鼠在它莫西芬(tamoxifen；sigma)诱导前后的特异性Cre表达情况。它莫西芬给药足够诱导Cre重组酶进入CaMkIIα阳性神经元的细胞核内。Scale bar：25μm。 

(f)CaMkIIα-CreER；ErbB4^{floxed/floxed}小鼠在它莫西芬诱导前后ErbB4和p-ErbB4表达水平的western blot分析结果。上左图：兔单克隆ErbB4抗体(#1200-1)；上右图：兔多克隆ErbB4抗体(sc-283)。白箭头指示为非特异性条带。 

(g)CaMKIIα-CreER；ErbB4^-/-小鼠在电刺激点燃引起的癫痫发作前后ErbB4和p-ErbB4表达水平的western免疫印迹分析。 

图10、在CaMKIIα阳性的神经元中敲除ErbB4对电刺激诱导的癫痫发生没有影响。 

(a)CaMkIIα-iCre；ErbB4^-/-小鼠和两组同窝对照小鼠的电刺激阈值比较。P＝0.749，one-way ANOVA。 

(b和c)CaMkIIα-iCre；ErbB4^-/-小鼠表现出的行为学发作级别(b)和诱发出的脑电图发作放电时程(c)与对照组相比没有显著性差异。n＝14，CaMkIIα-iCre；ErbB4^-/-；n＝17，CaMkIIα-iCre；n＝12，ErbB4-floxed。 

(d)各组小鼠达到第一次1、3级和完全点燃状态所需要的刺激次数比较。P＞0.05，one-way ANOVA。 

(e)CaMkIIα-CreER；ErbB4^-/-和对照小鼠的电刺激阈值比较。CaMkIIα-CreER和ErbB4-floxed同窝小鼠合并为对照组。P＝0.542，t检验。 

(f和g)CaMkIIα-CreER；ErbB4^-/-小鼠与其同窝对照在电刺激点燃过程中的癫痫发生进展情况比较。 

(h)CaMkIIα-CreER；ErbB4^-/-小鼠与其对照达到特定发作级别所分别需要的电刺激次数比较。P＞0.05，t检验。 

图11、特异性地在PV阳性神经元中敲除了ErbB4的PV-Cre；ErbB4^-/-小鼠脑内Cre重组酶和ErbB4的表达情况及ErbB4磷酸化水平分析。 

(a)免疫荧光染色显示Cre重组酶特异性地表达于PV阳性神经元中。Scalebars：100μm。 

(b)Western免疫印迹结果显示PV-Cre；ErbB4^-/-海马内的ErbB4表达水平轻微降低而其磷酸化水平降低明显。 

(c)PV-Cre；ErbB4^-/-小鼠在电刺激点燃引起的癫痫发作前后ErbB4和p-ErbB4表达水平的western免疫印迹分析。结果显示磷酸化ErbB4在癫痫后上调不明显。 

图12、特异性地在PV阳性的神经元中敲除ErbB4促进电刺激诱导的癫痫发生。 

(a)PV-Cre；ErbB4^-/-小鼠和两组对照小鼠的平均电刺激阈值比较。P＝0.577；one-way ANOVA。 

(b-d)与对照组相比，PV-Cre；ErbB4^-/-小鼠表现出明显加快的癫痫发生，具体表现在行为学发作级别的显著提高(b)、脑电图放电发作的时程大大延长(c)和达到完全点燃状态所需要的刺激次数明显减少(d)。每组n＝10。*P＜0.05，**P＜0.01和***P＜0.001，与PV-Cre小鼠相比； 

P＜0.01和 

P＜0.001，与ErbB4-floxed小鼠相比；one-way ANOVA with post hoc Bonferroni’s test。 

(e)电刺激结束两个月后PV-Cre；ErbB4^-/-小鼠的自发性癫痫发生率提高。*P＜0.05，与PV-Cre小鼠相比； P＜0.05，与ErbB4-floxed小鼠相比；continuityx² test。 

(f)电刺激结束两个月后各组小鼠的典型脑电图。PV-Cre；ErbB4^-/-小鼠出现典型癫痫发作现象。 

(g)点燃的PV-Cre；ErbB4^-/-小鼠的自发性癫痫的频率显著高于对照组小鼠。*P＜0.05和***P＜0.001，与PV-Cre小鼠相比； P＜0.01和 

P＜0.001，与ErbB4-floxed小鼠相比；two-way ANOVA with post hoc Bonferroni’s test。 

图13、NRG1的抗癫痫效应在PV-Cre；ErbB4^-/-小鼠身上消失。 

(a)在电刺激点燃的过程中给予脑内注射NRG1(10μM，2μL，i.c.v.)并不影响PV-Cre；ErbB4^-/-小鼠的行为学发作级别(左)、脑电图放电发作的时程变化(中)、达到首次4级癫痫发作所需的刺激次数(右)。 

(b)NRG1可以减缓与PV-Cre；ErbB4-/-具有相同初始发作强度的PV-Cre小鼠的癫痫发生进程。以上图中黑色虚线指示的是开始脑内注射时的行为学发作强度。灰色虚线为开始给药时各组的刺激次数。 

(c和d)同等剂量的NRG1可以在行为学和脑电图上都显著性地降低CaMKIIα-iCre；ErbB4^-/-(c)和野生型小鼠(d)的点燃发展进程。阴影区域指示NRG1蛋白的注射。*P＜0.05和**P＜0.01，one-way ANOVA。 

图14、特异性地在PV阳性神经元中敲除ErbB4加剧电刺激诱导引起的脑高兴奋性状态。 

(a-c)完全点燃的ErbB4^-/-(a)、PV-Cre；ErbB4^-/-(b)和CaMkIIα-iCre；ErbB4^-/-(c)小鼠在兴奋性刺激测试下的代表性脑电图。在完全点燃的小鼠休息两周后，脑电图发作诱发自一个阈值强度的单刺激。 

(d)对各组小鼠的脑电图时程所进行的定量分析比较。各组小鼠的总数量标识于各图上方。**P＜0.01和***P＜0.01，one-way ANOVA。 

图15、特异NRG1-ErbB4信号通路对电刺激点燃引起的苔藓纤维发芽的影响。 

(a)空白对照、溶剂对照、NRG1处理、和PD 158780处理组的大鼠在电刺激结束两个月后脑片Timm染色的结果比较。Timm染色阳性区域主要呈现在海马齿状回的内分子层，上图中虚线所示的区域在对应的下图中放大显示。箭头所示为Timm染色阳性颗粒。标尺：上排，500μm；下排，50μm。 

(b)对各组大鼠Timm染色结果的定量分析。每组N＝4-8；^##P＜0.01，与空白对照组相比；*P＜0.05和**P＜0.01，与溶剂对照组相比；one-wayANOVA with post hoc Bonferroni’s test。 

(c)对ErbB4^+/-鼠及其同窝对照的齿状回颗粒内分子层的Timm染色结果的定量分析。*P＜0.05，2-way ANOVA with post hoc Bonferroni’s test。 

(d)对PV-Cre；ErbB4^-/-和PV-Cre小鼠的齿状回颗粒内分子层的Timm染色结果的定量分析。**P＜0.01，2-way ANOVA with post hoc Bonferroni’s test。 

图16、ErbB4在第1056氨基酸位点的酪氨酸磷酸化特异性地限定在抑制性神经元中。 

(a)CaMKIIa抗体标记上的兴奋性神经元均表达ErbB4阳性，而还有一小 部分ErbB4阳性细胞不表达CaMKIIa阳性，一方面说明组织化学实验和抗体的特异性，另一方面可以用排除法推测，其余这小部分ErbB4阳性细胞应该是抑制性神经元。标尺：20μm。 

(b)ErbB4在1284位点磷酸化可以表达在所有ErbB4阳性细胞中(上排)，而且大部分表达在CaMKIIa阳性神经元中(下排)，排除了这个位点在癫痫发生中的作用，因为CaMKIIa阳性神经元中的ErbB4敲除不影响癫痫(见实施例5)。标尺：20μm。 

(c)ErbB4在第1056位点的酪氨酸磷酸化局限性地表现于部分ErbB4阳性细胞中，当给予10nM NRG1刺激15分钟后该位点的磷酸化水平可以急剧升高。标尺：20μm。 

(d)ErbB4在1056氨基酸位点的酪氨酸磷酸化表达在抑制神经元中。上排：一部分GAD67阳性GABA能神经元表达ErbB4磷酸化；下排：PV阳性的GABA能神经元表达ErbB4磷酸化。标尺：上排，20μm；下排，10μm。圆饼示意图总结了细胞化学研究中的发现。 

图17、PI3K-Akt-S6K通路是PV阳性神经元中NRG1-ErbB4信号***抗癫痫作用的下游靶标。GAPDH作为内源性参照，表明各组样品的总蛋白上样量相等。 

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现癫痫发作后神经调节素1(Neuregulin 1，NRG1)的表达上调，其受体鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4(v-erb-a erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 4，ErbB4)的磷酸化水平上调；NRG1蛋白可以通过激活ErbB4的磷酸化来延缓癫痫病的形成、抑制癫痫持续状态、降低癫痫活动引起的脑兴奋性状态和/或抑制癫痫发作引起的苔藓纤维发芽。本发明首次提出NRG1通过激活脑内的抑制性神经元中的ErbB4受体来抑制癫痫的发生发展过程，为有效预防、控制或治疗癫痫病提供了新靶标。 

NRG1和ErbB4信号及相关用途 

神经调节素1(Neuregulin-1，NRG1)是生长因子家族的一员，ErbB4(v-erb-a erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 4(avian)，鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4)是其主要受体之一(Mei，L.&Xiong，W.C. Neuregulin 1 in neural development，synaptic plasticity and schizophrema.Nature Reviews Neuroscience 2008，9：437-452)，ErbB4既具酪氨酸激酶活性又兼有配体高亲和力。人ErbB4是Homo sapiens v-erb-a erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 4(avian)的简称。NRG1和ErbB4都广泛而丰富地存在于与癫痫发生密切相关的脑区内——如边缘叶结构中，特别是海马、杏仁核和梨状皮质等部位。脑内许多神经元包括一些γ-氨基丁酸能的中间神经元，例如在锥体神经元的兴奋性调控中起着重要作用的小清蛋白(Parvalbumin；PV)免疫阳性的篮状细胞和枝状细胞细胞，都丰富地表达着ErbB4蛋白。NRG1和ErbB4在体内可以由金属蛋白酶等从前体形式剪切为成熟形式并发挥功能。NRG1和ErbB4都与神经发育、神经传导和突触可塑性有重要的联系。最近的研究发现NRG1可以促进前额叶皮质抑制性中间神经元释放γ-氨基丁酸并进一步抑制锥体神经元的兴奋性；同时，神经元的活动也可以影响NRG1的表达和其受体ErbB4的磷酸化激活。 

本发明人在研究中发现，NRG1-ErbB4信号***可以应答癫痫活动，并参与癫痫发生的内源性抑制机制。NRG1可以有效激活ErbB4的酪氨酸激酶活性(磷酸化)，进而延缓癫痫病的形成、抑制癫痫持续状态、降低癫痫活动引起的脑兴奋性程度、和/或抑制苔藓纤维发芽。同理，ErbB4的激动剂会有效地抑制癫痫发生或发展的进程。本发明人进一步发现了一个NRG1抗癫痫作用的细胞学环路机制，即NRG1分泌于多种类型的细胞，但是其作用于ErbB4产生抗癫痫作用的细胞学靶点是PV阳性的神经元而不是CaMKIIa阳性的兴奋性神经元，这为癫痫病的预防和治疗揭示了一个细胞类型特异性的、有效的新靶标。 

在本发明的优选实施例中详细地论证了本发明人的上述发现，在模拟人类颞叶癫痫病的两种经典动物模型--电刺激点燃模型和匹罗卡品癫痫模型中，癫痫发作都可以给予显著诱导上调NRG1的mRNA和蛋白表达水平，并上调NRG1的受体ErbB4的酪氨酸磷酸化水平。给予脑内注射NRG1能显著延缓癫痫病的形成、抑制癫痫持续状态、同时抑制电刺激点燃发作所诱发的苔藓纤维发芽这一病理现象，而消耗脑内的NRG1、给予ErbB4的抑制剂或是敲除ErbB4基因消除ErbB4的活性则加速癫痫发生和发展的进程、恶化癫痫活动引起的脑兴奋性程度、和/或促进苔藓纤维发芽。实验中还发现，PV阳性神经元中的ErbB4信号通路对癫痫病的抑制起着主要作用，然而CaMKII α阳性神经元中的ErbB4受体对癫痫的抑制作用不大，揭示了一个基于特异性细胞学环路基础的抗癫痫分子信号通路上的新靶标。 

基于本发明人的新发现，本发明提供了NRG1-ErbB4分子信号通路在癫痫病中的作用机理和用途，用于制备预防、改善或治疗癫痫的药物，或用于筛选预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。 

基于本发明人的新发现，本发明还提供了特异性细胞学靶点，用于筛选调节NRG1的表达及其受体ErbB4的活性、改善大脑兴奋性、防治其它与脑兴奋性相关的疾病的潜在物质。由于NRG1和ErbB4对细胞的增殖、分化和存活等方面具有重要的营养支持作用，因此，NRG1-ErbB4信号通路或其调节剂(例如激动剂、促进剂、上调剂、抑制剂、拮抗剂、阻断剂等)可更好地地实现抗癫痫作用而产生尽可能少的副作用。 

任何适合的NRG1蛋白或ErbB4蛋白均可用于本发明。所述的NRG1蛋白或ErbB4蛋白包括它们的序列全长形式或其生物活性片段。优选的，所述的NRG1蛋白的氨基酸序列可以与GenBank登录号NM_013956.3所示的序列或与GenBank登录号NM_013956.3中第176-246位(含NRG1的EGF功能区)序列基本上相同；只要其保留有NRG1的EGF功能区及该结构域的活性。优选的，所述的ErbB4蛋白的氨基酸序列可以与GenBank登录号NM_005235.2所示的序列基本上相同。尽管上述GenBank登录号代表了来自于人(人源)的NRG1蛋白或ErbB4蛋白，但是鉴于NRG1蛋白或ErbB4蛋白在不同动物中的高度保守性，来自于其它动物的NRG1蛋白或ErbB4蛋白也被包含在本发明中。由本发明的研究结果也可见，人源的NRG1蛋白或ErbB4蛋白在鼠(如大鼠、小鼠)体内的表达特征接近，发挥相同的功能，可见其在人、鼠或其它动物中的通用性。 

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的NRG1蛋白或ErbB4蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。所述的NRG1蛋白保留有NRG1的EGF功能区。NRG1蛋白或ErbB4蛋白或它们的生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。 

任何一种NRG1蛋白或ErbB4蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，NRG1蛋白或ErbB4蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其 仍然能保持全长蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。 

本发明也可采用经修饰或改良的NRG1蛋白或ErbB4蛋白，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的NRG1蛋白或ErbB4蛋白。所述经过修饰或改良的蛋白可以是与天然存在的蛋白具有较小的共同点，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响NRG1蛋白或ErbB4蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中。 

NRG1及ErbB4的调节剂 

如本文所用，所述的“上调剂”、“促进剂”、“激动剂”、“激活剂”可互换使用。任何可上调NRG1或其ErbB4受体的表达或活性状态、促进NRG1和ErbB4蛋白成熟和剪切、诱导ErbB4受体的活性、提升NRG1和ErbB4的稳定性、激活NRG1和ErbB4所介导的信号通路、增强NRG1和ErbB4之间的结合力、延长NRG1和ErbB4之间的有效作用时间、或调节(提高)NRG1和ErbB4的转录或翻译的物质均可用于本发明，作为制备抗癫痫的药物的有效物质。 

作为本发明的优选方式，所述的NRG1的激动剂、促进剂或上调剂包括(但不限于)：人工重组NRG1蛋白、可表达NRG1蛋白的重组表达质粒、激活或促进NRG1功能或活性的特异性多肽、可促进NRG1与ErbB4受体发生特异性结合或相互作用的物质。 

作为本发明的优选方式，所述的ErbB4受体的激动剂、促进剂或上调剂包括(但不限于)：人工重组NRG1蛋白、激活或促进ErbB4活性的特异性多肽、ErbB4的特异性配体或功能类似物、ErbB4胞内端活性区域、可促进NRG1与ErbB4受体发生特异性结合或相互作用的物质。 

在本发明的优选实施方式中，所述的ErbB4胞内端活性区域为其酪氨酸激酶活性区域。尽管在该优选实施方式中列举了具体的酪氨酸磷酸化位点，然而，本领域人员应理解，只要是能够用于选择性地提高ErbB4的活性或表达、或增强其与胞内信号分子发生相互作用的ErbB4的变异体均是可用的。此外，本领域人员熟知的是，还可以采用多种常用的方法来增强或提高ErbB4的活性或表达，例如可设计针对ErbB4的过表达DNA载体等。 

任何可特异性地调节PV阳性神经元上ErbB4的各种活性机制的物质也可用于本发明，作为抗癫痫和抑制癫痫所致的脑兴奋性程度的物质。 

筛选抗癫痫的潜在物质的方法 

在得知了所述的NRG1及其受体ErbB4对于癫痫的发生或发展的影响作用后，可以采用本领域熟知的多种方法来筛选抗癫痫的潜在物质。可从所述的潜在物质中找到可用于制备抗癫痫的药物的物质。 

因此，本发明提供一种筛选抗癫痫的潜在物质的方法，包括以下步骤：(a)将候选物质与表达NRG1和/或ErbB4的体系接触；(b)检测NRG1的表达或活性，若所述候选物质在统计学上提高NRG1的表达或活性，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质；和/或检测ErbB4的磷酸化水平，若所述候选物质在统计学上提高ErbB4的磷酸化水平，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。 

鉴于所述的NRG1和ErbB4发生相互作用与癫痫的相关性，所述的筛选方法可以通过观察两者的相互作用进行。该方法包括：检测NRG1和ErbB4相互作用情况，若所述候选物质在统计学上促进NRG1和ErbB4的相互作用，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人员熟知的技术。 

ErbB4的胞内端有许多可发生酪氨酸磷酸化位点，鉴于其在脑内的广泛表达，其磷酸化位点的特异性可能介导着不同的功能。因此，本发明人鉴定了ErbB4蛋白氨基酸序列上不同酪氨酸磷酸化位点与癫痫疾病的相关性，结果发现该蛋白第1056位点(相应于GenBank登录号NM_005235.2的氨基酸序列的第1056位)的磷酸化与癫痫疾病密切相关。因此可通过观察候选物质对于该位点上酪氨酸磷酸化的调节作用来进行筛选，若该位点的磷酸化水平在统计学上提高，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。 

本发明人还研究了NRG1-ErbB4对于下游的信号通路的影响情况，结果发现NRG1可以诱导ErbB4(Tyr1056)磷酸化的显著升高，并激活AKT使其磷酸化水平显著升高。因此可通过观察候选物质对于NRG1-ErbB4的下游AKT信号通路的影响作用来进行药物的筛选。若AKT信号通路被激活或者AKT蛋白的磷酸化水平在统计学上提高，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。 

在本发明中，所述的体系选自(但不限于)：溶液体系、细胞体系、亚细胞体系、组织体系、器官体系、或动物体系。 

作为本发明的优选实施例，所述的细胞体系选自(但不限于)：海马细胞、 皮层细胞、PV阳性中间神经元细胞；所述的动物体系为癫痫动物模型，选自(但不限于)：点燃癫痫动物模型、或匹罗卡品癫痫动物模型。 

所述的体系中可含有NRG1或ErbB4，用于在其中加入候选物质，观察候选物质对NRG1或ErbB4表达或活性的影响；或者，所述的体系中可同时含有NRG1、ErbB4及其下游信号通路分子，用于在其中加入候选物质，同时观察候选物质对于NRG1-ErbB4信号通路活性的影响。 

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于预防、缓解或治疗癫痫真正有用的物质。 

另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的抗癫痫的潜在物质。 

这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于预防或治疗癫痫有用的物质。 

组合物 

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.00001-10wt％)的所述的神经调节素1(NRG1)的全长或功能区肽段的蛋白，以及药学上或食品学上可接受的载体。 

本发明的多肽或其类似物可直接用于癫痫或癫痫相关疾病的预防或治疗。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。 

本发明提供了一种治疗癫痫的方法，包括给予受试者有效量的NRG1(如0.00001-0.1克/60千克体重/天；优选的，为0.0001-0.005克/60千克体重/天)。 

应理解，当用于预防或治疗哺乳动物癫痫疾病时，所用的NRG1的有效剂量可随待治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据受试者的个体情况来决定，这些因素均在熟练医师或营养师可以判断的范围内。 

在得知了所述NRG1的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的NRG1或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将NRG1通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将NRG1的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的NRG1，具体情况需视所述的NRG1的制备质量和形式而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。 

本发明还提供了一种治疗癫痫的方法，包括给予受试者有效量的NRG1-ErbB4信号通路的激动剂、激活剂、促进剂或上调剂等。 

应理解，当用于预防或治疗哺乳动物癫痫疾病时，所用的NRG1-ErbB4信号通路的激动剂、促进剂、激活剂或上调剂的有效剂量可随待治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据受试者的个体情况来决定，这些因素均在熟练医师或营养师可以判断的范围内。 

在得知了所述NRG1-ErbB4信号通路的激动剂、促进剂或上调剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的NRG1-ErbB4信号通路的激动剂、促进剂、上调剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将NRG1-ErbB4信号通路的激动剂、激活剂、促进剂或上调剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将NRG1-ErbB4信号通路的激动剂、激活剂、促进剂或上调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的NRG1-ErbB4信号通路的激动剂、激活剂、促进剂或上调剂，具体情况需视所述的激动剂、激活剂、促进剂或上调剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。 

检测试剂或试剂盒 

基于本发明人的上述新发现，可以将NRG1或ErbB4作为诊断癫痫的标志物：(i)进行癫痫的鉴别诊断和/或易感性分析；(ii)评估相关人群的癫痫治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法；(iii)早期评估相关人群癫痫患病风险，早期监测早期防治。比如，可分离出由NRG1或ErbB4基因表达异常而导致癫痫的人群，从而可进行更有针对性地治疗。 

因此，本发明提供了NRG1或ErbB4基因或蛋白的用途，用于制备诊断(或检测)癫痫的试剂或试剂盒。 

可采用各种本领域已知的技术来检测NRG1或ErbB4的存在与否以及表达情况、磷酸化水平，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如Southern印迹法、Western印迹法、DNA序列分析、PCR等，这些方法可结合使用。 

本发明还提供了用于在分析物中检测NRG1或ErbB4的存在与否以及表达情况的试剂。优选的，当进行基因水平的检测时，可以采用特异性扩增NRG1或ErbB4的引物；或特异性识别NRG1或ErbB4的探针来确定NRG1或ErbB4的存在与否；当进行蛋白水平的检测时，可以采用特异性结合NRG1蛋白或ErbB4蛋白的抗体或配体来确定NRG1蛋白或ErbB4蛋白的表达情况。 

针对NRG1或ErbB4的引物或特异性探针的设计是本领域人员熟知的技术， 例如，制备一种探针，其可与NRG1或ErbB4基因上特定位点发生特异性结合，而不与NRG1或ErbB4基因以外的其它基因特异性结合，且所述探针带有可检测信号。 

利用特异性结合NRG1蛋白或ErbB4蛋白(如磷酸化的蛋白)的抗体来检测分析物中NRG1蛋白或ErbB4蛋白表达情况的方法也是本领域人员熟知的技术。 

本发明还提供了用于在分析物中检测NRG1或ErbB4的存在与否以及表达情况的试剂盒，该试剂盒包括：特异性扩增NRG1或ErbB4基因的引物；特异性识别NRG1或ErbB4基因的探针；或特异性结合NRG1蛋白或ErbB4蛋白(如磷酸化的蛋白)的抗体或配体。 

此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。 

此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。 

本发明的主要优点在于： 

首次发现神经调节素1(NRG1)及其ErbB4受体参与到癫痫发生或发展过程中并起到强烈的抑制性作用，为癫痫的预防或治疗提供了更具针对性的药物靶点。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。 

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。 

I.材料和方法 

海马神经细胞原代培养 

无菌条件下，从胚胎期18天的孕鼠中取出胎鼠，体视镜下分离海马组织、 剪碎、进行胰酶消化，经吹打及离心后将海马细胞悬浮于含有B27(GiBco)、0.5mM L-谷氨酰胺、20mM HEPES、100U/ml庆大霉素(pH 7.4)的神经细胞无血清培养基Neurobasal中，然后铺于经过0.0025％(w/v)多聚赖氨酸(PDL)处理的六孔盘中，置37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养。于第5天，加入10μM氟尿苷(FUDR)抑制胶质细胞的增殖。在体外培养的神经元生长至第14天时，分别给予不同处理(如与NRG1、ecto-ErbB4、PD158780等分别孵育)，然后进行后续实验。 

电刺激点燃癫痫模型(kindling model)和检测癫痫发作 

动物在0.6％戊巴比妥钠麻醉下(250-350mg/kg，i.p.)将其头部固定于脑立体定位仪上，常规手术消毒、定位、钻孔、止血，然后在右杏仁核埋入双极刺激电极(大鼠：前囟后AP 2.80mm，旁开4.9em，深度硬脑膜下8.6mm；小鼠：前囟后1.2mm，旁开2.8mm，硬脑膜下4.9mm)。四颗螺丝钉埋入颅骨但不穿透骨膜用于支撑和记录脑电图(EEG)。左侧后方螺钉连接不锈钢丝作为参考电极(大鼠：前囟后6.0mm，旁开3.0mm；小鼠：前囟后4.0mm，旁开2.0mm)。大鼠在脑室给药的药理学实验中，同时在动物侧脑室植入给药套管(Plastic one；大鼠：前囟后0.9mm，旁开1.4mm，硬脑膜下4.0mm；小鼠：前囟后0.3mm，旁开1.0mm，硬脑膜下2.2mm)。电极、套管和螺丝以牙科水泥浇灌固定在颅骨上。动物术后恢复至少7天。电极的位置正确与否在电刺激实验结束后通过脑片Nissl和甲绿派络宁-Y染色来确认。 

动物在接受电极埋植手术恢复一周后，先测试各自的脑电图癫痫放电的刺激阈值(Electrographic seizure threshold，EST)。测定EST时的刺激频率60Hz，串长1s，波宽1ms，从60μA开始，每隔2min刺激强度增加20μA，直到刺激引起脑电图上出现放电发作且其持续时间长于3s，此时所需的最低刺激电流即为EST。此后，给予实验动物每天一次阈值强度大小的电刺激，观察动物的行为学和脑电图学上的癫痫发作情况。癫痫行为学的指标参照Racine标准分级法：1级，面部、胡须或嘴角抽搐；2级，点头、咀嚼伴面部抽搐或节律性眨眼；3级，单侧前肢抬起，阵挛；4级，直立伴有双侧前肢的阵挛；5级，直立失衡摔倒、全身性痉挛抽搐或僵直。动物如果连续3次行为学发作达到Racine5级标准即被定义为完全点燃(Fully kindled)。完全点燃的动物根据实验目的的不同，或停止刺激，或休息一段时间后用于后续实验。电刺激过程中对动物的药理学处理和基因型均按双盲法进行操作。在条件性敲除(Conditional  knockout，cKO)小鼠的点燃模型实验中，以携带有正常ErbB4等位基因的同窝ErbB4-floxed和Cre小鼠作为对照。 

NRG1(10μM；GenBank登录号NM_013956.3中第176-246位)、ecto-ErbB4(1μg/μL；Woo，R.S.，et al.Neuregulin-1 enhances depolarization-induced GABA release.Neuron 2007，54：599-610)、PD158780(2mM；购自德国Calbiochem公司)的脑室内注射在刺激前30分钟进行，通过埋置的不锈钢套管，将连接微量注射器的埋植套管配套内芯***套管，完全***后将药物缓慢注入侧脑室(大鼠总量5μL，速度0.5μL/min；小鼠2μL，速度0.2μl/min)，注药完毕后留针10分钟。对照组大鼠则接受侧脑室内注射等量的溶剂或相应的性能失活的重组多肽(NRG1或ecto-ErbB4)。 

在监控自发性癫痫的实验中，通过闭路电视监控和脑电图监测***，动物在电刺激点燃实验结束后开始每周被监测40个小时(8h/天，5天/周)以记录自发性癫痫的出现。癫痫发作级别参照Racine标准分级法(见前述)。鉴于闭路电视监控的分辨率限制，只有行为发作达到4级以上的动物才被考虑在本研究中。 

匹罗卡品癫痫模型 

实验动物称重后腹腔注射匹罗卡品(340mg/kg体重，购自美国Sigma公司)诱发癫痫前30分钟预先给予注射东莨菪碱(Scopolamine methylbromide，2mg/kg，购自美国Sigma公司)以拮抗匹罗卡品引起的外周***胆碱能作用。对照组给予同等剂量的生理盐水取代匹罗卡品。注射匹罗卡品后密切观察动物的行为变化，记录其癫痫发作级别(同上)。自动物的癫痫发作达3级起计时，发作1个小时后腹腔注射安定(4mg/kg，购自美国Sigma公司)中止癫痫发作，以标准化癫痫的发作程度。腹腔注射给药时用1ml注射器在局部皮肤酒精消毒后进行。为了检测NRG1-ErbB4信号通路活性的改变，大鼠在发生癫痫后3、6、24小时分别被取脑进行观察。 

在脑内埋管给药的实验中，侧脑室埋管的参数和给药方法同电刺激点燃模型。脑室注射后NRG130分钟进行匹罗卡品注射诱发癫痫。对照组给予溶剂注射。 

本发明的SD大鼠、C57BL/6小鼠、条件性基因敲除小鼠及其对照小鼠均在中科院神经科学研究所实验动物房的SPF级屏障***内繁育。实验前将成年动物(2-4月龄)从屏障***转入标准动物房饲养。动物手术后恢复及电刺激点燃过程中也均在标准鼠房饲养。每笼饲养5只，自由饮食，12小时制光照/黑暗循环。 室温维持在25±1℃。所有涉及动物的实验均在中国科学院上海生命科学院动物管理和使用委员会的许可下进行。各种转基因或基因敲除小鼠的来源分别如下：心脏组织特异性重表达的ErbB4敲除杂合子小鼠(ErbB4^+/-)来自于瑞士巴塞尔大学的Martin Gassmann教授实验室，其制备方法如文献所述(Stoll，S.W.，et al.Differential utilization and localization of ErbB receptor tyrosine kinases in skin compared to normal and malignant keratinocytes.Neoplasia 2001，3，339-350)，纯合子小鼠(ErbB4^-/-)由用杂合子小鼠交配后筛选得到。 

关于各系条件性敲除鼠，运用专业人士所熟知的Cre/LoxP介导的基因敲出策略来得到(Gu，H.，Marth，J.D.，Orban，P.C.，Mossmann，H.&Rajewsky，K.Deletion of a DNA-Polymerase-Beta Gene Segment in T-Cells Using Cell-Type-Specific Gene Targeting.Science1994，265，103-106)。其中，LoxP-flanked ErbB4小鼠(ErbB4-floxed)来自美国印第安纳大学的Cary Lai教授实验室(Sutula，T.，Cascino，G.，Cavazos，J.，Parada，I.&Ramirez，L.Mossy fiber synaptic reorganization in the epileptic human temporal lobe.Ann Neurol 1989，26，321-330)；PV-Cre小鼠来自于瑞士巴塞尔大学的Silva Arber教授实验室(Hippenmeyer，S.，et al.A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.Plos Biology 3，878-890(2005).)；携带有CaMkIIα启动子驱动表达的ERiCreER(CaMKIIα-CreER)(Casanova，E.，et al.ER-based double iCre fusion protein allows partial recombination in forebrain.Genesis 2002，34，208-214)或增强型Cre重组酶(CaMKIIα-iCre)(Casanova，E.，et al.A CamKII alpha iCre BAC allows brain-specific gene inactivation.Genesis2001，31，37-42)的小鼠均由德国肿瘤研究中心的Günther Schütz教授提供。各种条件性基因敲除鼠用相应的Cre小鼠与Floxed小鼠杂交后筛选而得，在本实施例中用到的有PV-Cre；ErbB4^-/-、CaMKIIα-iCre；ErbB4^-/-和CaMKIIα-CreER；ErbB4^-/-(在成年期由它莫西芬诱导实现)等小鼠。 

CaMKIIα-iCre；ErbB4^-/-小鼠的制备：通过CaMKIIα-iCre小鼠与ErbB4^-/-小鼠杂交获得。 

CaMKIIα-CreER；ErbB4^-/-小鼠的制备：通过CaMKIIα-CreER小鼠与ErbB4^-/-小鼠杂交获得。 

在PV阳性神经元中特异性地敲除ErbB4的小鼠(PV-Cre；ErbB4^-/-)的制备：通过PV-Cre小鼠与ErbB4^-/-小鼠杂交获得。 

各种转基因鼠均通过对鼠尾基因组的PCR实验来进行基因型鉴定，实验完 毕后以脑切片进行特异性免疫染色再次确认。根据中科院上海生命科学研究院和美国国立卫生研究院的相关伦理学法则，所有的实验已尽力减轻对动物的伤害。 

它莫西芬诱导 

它莫西芬可以诱导携有CreER基因的条件性敲除小鼠细胞内的Cre入核并剪切目的基因。每20mg它莫西芬(Tamoxifen，购自美国Sigma公司)用振荡器混匀溶解于1ml的葵花籽油中，然后分装、冷冻贮存于-80℃。用前取出它莫西芬溶液在37℃预热15分钟之后再行腹腔注射。成年小鼠的它莫西芬用量为80mg/kg体重，每天一次，连续注射5天。最后一次注射后5天，小鼠取脑检测ErbB4蛋白的表达水平或开始用于后续实验。为了排除可能的副作用，对照组小鼠也接受等量的它莫西芬注射。经观察，它莫西芬注射的小鼠在行为上和体重上与溶剂注射组小鼠之间没有差别性变化。 

反转录polymerase chain reaction(PCR)和荧光实时半定量PCR 

用于在体观察NRG1mRNA的表达情况。实验动物在给予电刺激或匹罗卡品诱发癫痫后，在不同时间点(3、6、24小时)给予过量的***，快速断头，在冰上解剖出海马组织，在冰上快速分离并于TRIzol试剂中(每10mg组织0.1ml)匀浆，以提取RNA。提取出的组织总RNA溶解于无核酸酶的去离子水中。每例样品取2μg总RNA按照M-MLV反转录试剂盒的说明书合成cDNA(20μl体系)，最后用1μl作为模板按照Takara公司提供的标准体系说明书进行PCR反应。PCR实所验用到引物信息请见表1。PCR产物经1％琼脂糖胶电泳后用Image Quant 5.1软件进行分析。 

表1 

荧光实时半定量PCR根据使用说明书用SYBR Green I Premix Ex Taq kit配制反应液，在ABI Prism 7000PCR仪上进行。所用引物除大鼠NRG1-type I的以外其余均与RT-PCR实验中相同。用于大鼠NRG1-type I (GenBank登录号NM-031588)荧光定量PCR的引物为5’-TCAACAGAAGGCGCAAACAC-3’(正向)和5’-TGACAGGTCCTTCACCGTGA-3’(反向)。PCR扩增后进行溶解曲线分析来观察非特异性扩增和引物二聚体是否存在。PCR分析的结果用对照组来标准化。 

HEK293细胞培养和重组蛋白的制备 

ErbB4胞外端重组多肽(ecto-ErbB4)的制备方法参考自文献(Woo，R.S.，et al.Neuregulin-1enhances depolarization-induced GABA release.Neuron 2007，54：599-610)所述。简言之，常规方法培养HEK293细胞系，然后将表达ErbB4整个胞外端序列(GenBank登录号NM_005235.2；氨基酸序列1-659)并融合有F_C片段的pC4-B4Ex/Fc质粒与含有新霉素抗性基因的pEGFP-C1质粒(Clontech)以10∶1的比例共同转染HEK293细胞。用G418(0.4mg/ml)筛选抗性阳性的细胞，对其进行扩增，在2％的低免疫球蛋白胎牛血清中培养细胞，收集培养基，用以提纯培养基中分泌出的ecto-ErbB4。收集好的培养统一冻存在-80℃冰箱，待足量后使用HiTrap G蛋白柱(Amersham公司)进行层析纯化。纯化后的ecto-ErbB4经测定浓度后储存于-80℃条件下。 

重组的NRG1功能多肽氨基酸序列参见GenBank登录号NM_013956.3中第176-246位(含NRG1的EGF功能区)。 

脑片原位杂交(in situ hybridization) 

用RT-PCR的方法克隆针对大鼠Nrg1mRNA(Genbank号NM031588)的特异性序列，产物被***到pGEM-T Easy载体中。接着以线性化(PstI或NcoI酶线性化)后的质粒为模板，用SP6/T7体外转录试剂盒制备正义(核苷酸序列945-1903)和反义链(核苷酸序列945-1903)的RNA探针。原位杂交过程如下：切片粘贴于无RNase的玻片上晾干，根据贴片质量于50℃烤箱内烤片1-4小时，接着将脑片置于4％多聚甲醛溶液(DEPC-PBS配制)中室温固定20分钟，以DEPC-PBS洗2遍以去除PFA(每遍5分钟)，随后再置于50μg/ml的蛋白酶K(PKbuffer配制)溶液中反应15分钟，之后再用DEPC-PBS洗1次，时间5分钟。此后，用4％PFA再次固定15分钟。切片在预杂交液中孵育3-4小时后转入杂交液在60℃条件下杂交过夜。杂交液的成分：50％甲酰胺、5x SSC、0.3mg/ml酵母tRNA、100ug/ml肝素、1×Denhardt’s溶液(0.02％牛血清白蛋白(BSA)，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％Ficoll 400)，0.1％吐温-20，0.1％CHAPS和5mM乙二胺四乙酸。 

杂交后的切片经2×SSC在37℃条件下洗两遍(每遍20分钟)，随后以0.1μg/ml的RNAse A(用2×SSC配制)37℃处理30分钟，然后分别在2×SSC(室温10分钟)、0.2×SSC(60℃，2次，每次30分钟；室温，1次，15分钟)中依次洗涤。切片在5％BSA中孵育2-3h降低非特异性背景，随后与含5％BSA的预吸收抗地高辛抗体中(1∶2000，购自德国Roche公司)4℃孵育过夜。最后，切片经洗涤后，在NBT(硝基四氮唑蓝)/BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸盐)的显色液(以碱性磷酸酶缓冲液配置)中避光反应2-20小时。封片后的原位杂交脑片在Nikon E600FN显微镜上用Neurolucida软件进行采图和拼接。 

蛋白免疫印迹(Western blot) 

用于判断ErbB4的表达和磷酸化活性状态的水平。 

在离体实验中，海马神经元与不同剂量的NRG1孵育10min，给予神经元不同剂量的ecto-ErbB4预处理10min后再给予孵育NRG1(终浓度10nM)10min后提取细胞总蛋白，或给予神经元不同剂量的ErbB4磷酸化抑制剂PD158780(购自德国Calbiochem公司)预处理10min后再给予孵育NRG1(终浓 度10nM)10min，之后用SDS裂解液4℃收集细胞总蛋白进行9％的SDS-PAGE电泳。电泳结束后将蛋白转移到PVDF膜上，以含5％脱脂奶粉的TBST室温封闭1小时以消减非特异性反应。接着，将印有蛋白的PVDF膜与一抗(兔多克隆抗p-ErbB4，1∶500，Sant Cruz；兔多克隆抗p-ErbB4，1∶500，Cell Signaling Technology；兔单克隆抗ErbB4，1∶2000，Epitomics；兔多克隆抗ErbB4，1∶500，Santa Cruz Technology；GAPDH抗体，1∶6000，康成生物)在4℃孵育过夜，经TBST洗3遍(每遍10分钟)后与HRP偶联的二抗室温孵育1-2小时，经TBST洗涤后用ECL反应液显影，用化学发光法使X光胶片感光。用Fermentas公司的预染标志蛋白作为蛋白大小的参照上样。扫描照片用分析软件Image-Quant5.0进行分析，以光密度值表示各组的蛋白相对表达量。蛋白条带的浓度用Image-Quant 5.2软件测量，对照组为标准化参照。 

在体实验中，动物接受电刺激点燃或匹罗卡品药物诱导造模，或是预先给予NRG1、ecto-ErbB4或PD 158780之后再给予癫痫造模，或是只给予上述药物注射而不造模，随后在不同时间点(3、6、24小时)提取动物的海马，在RIPA裂解缓冲液中匀浆，提取组织总蛋白，用Bradford法测定蛋白浓度，根据需要取定量蛋白进行SDS-PAGE电泳。接着，将印有蛋白的PVDF膜与一抗在4℃孵育过夜随后按前述步骤进行Western免疫印迹实验和分析。 

免疫组织化学 

动物在戊巴比妥钠深度(60mg/kg，i.p.)麻醉后，经心脏进行灌注固定，快速开胸，暴露心脏及主动脉，经左心室插管至升主动脉，快速以生理盐水灌注冲洗5分钟，然后以冰浴的4％多聚甲醛(用0.1mol/L PB液配制；pH＝7.4)灌注。灌注完成后去除鼠颅顶骨，按照Paxinos和Watson鼠脑图谱进行立体定位取脑，将其放置于4℃冰箱内后固定过夜，随后在梯度蔗醣溶液(15％、30％；以0.1mol/LPB配制；pH 7.4)中依次进行脱水沉淀。脱水后的脑组织在恒冷式冰冻切片机上作连续冠状冰冻切片，片厚为20-30μm。 

在SABC法免疫组织化学实验中，脑片经PBS充分漂洗，随后浸入3％(v/v)的H₂O₂中漂洗10min以清除内源性过氧化物酶，然后用1×PBS洗两次，在10％(v/v)马血清/3％(v/v)牛血清白蛋白(BSA)/0.25％％(v/v)Triton X-100中室温孵育60分钟以降低非特异性背景，接下来在4℃条件下一抗孵育12-24小时；PBS漂洗3遍，每次10min；再用生物素标记的二抗室温孵育2小时；PBS漂洗三次；标准SABC溶液孵育1小时，随后用PBS漂洗三次，接着用DAB显 色反应液(含0.003％(v/v)H₂O₂、0.05M Tris-HCl、0.05％(v/v)DAB；pH＝7.6)显色。 

在免疫荧光组织化学染色实验中，切片直接在封闭液中室温孵育1小时后，分别与一抗抗体在4℃条件下进行单孵育或共孵育，时间为24-48小时。二抗则用Alexa-488、Alexa-546或Alexa-647标记的抗体孵育过夜，待PBS漂洗后用Vectashield试剂封片在Nikon A1R共聚焦荧光显微镜下观察拍照。Hoechst33342(2μg/mL)用于标记细胞核，孵育时间为30分钟。 

在免疫细胞化学实验中，体外培养的细胞经PBS快速清洗3遍之后以4％PFA/5％蔗糖溶液(以PBS配制)在4℃固定30分钟。然后洗去固定液(1遍，5分钟)，以0.25％Triton X-100/5％BSA/PBS混合封闭液在室温封闭1小时以阻断非特异性反应。随后将细胞与一抗进行孵育(Mouse monoclonal ErbB4，1∶500，购自Neomarks公司；rabbit polyclonal anti-ErbB4-sc33040，1∶200，购自Sant Cruz公司；mouse monoclonal anti-PV，1∶500，购自Abcam；mouse monoclonal anti-CaMKIIa，1∶1000，购自Abcam公司；Rabbit polyclonal anti-CaMKIIa，1∶1000，购自LifeScience公司；mouse monoclonal anti-GAD67，1∶1000，购自Millipore公司)，4℃条件下12小时以上。用PBS洗去多余一抗(3遍，每遍5分钟)，将细胞与Alexa-488或546标记的驴源性荧光二抗(购自Invitrogen公司，含有2μg/mLHoechst33342)在室温混合孵育2小时，最后以PBS洗涤3遍后沥干，以荧光封片剂封片。封片后的细胞在Nikon A1R共聚焦荧光显微镜下以60倍油镜观察并采图。Hoechst33342购自碧云天公司。 

酶联免疫吸附测定(ELISA) 

NRG1是一种分泌性蛋白，用ELISA试剂盒可以检测其表达水平。具体过程如下：将各组实验动物的脑组织裂解样品用碳酸盐包被缓冲液等比例稀释后加入到预先包被有NRG1抗体(购自Uscnlife Company)的96孔板内，4℃孵育过夜；倾去蛋白液，以清洗液洗涤孔板后，加入封闭液在摇床上室温孵育1小时；经清洗后加入NRG1一抗(购自Uscnlife Company)孵育液于4℃过夜；对各孔进行清洗然后加入HRP耦合的羊抗兔抗体(购自Uscnlife Company)室温孵育1小时。此后，用TMB显色液进行显色10分钟，以1N HCl终止显色反应，将96板置于酶标仪中在460nm波长下检测吸光度值。将试剂盒伴随提供的纯化标准品梯度稀释后进行平行试验绘制标准曲线。为了反映实验组NRG1蛋白 水平的变化，同一批次中各实验组的结果与对照组进行标准化以便于比较。 

Timm染色 

Timm染色主要是用来观察癫痫的形成过程中海马齿状回内分子层是否发生轴突重构——苔藓纤维发芽。 

实验动物在戊巴比妥钠深度麻醉下经心脏依次灌注0.9％的生理盐水、0.1％的硫化钠溶液和4％多聚甲醛溶液，然后取出脑组织进行后固定过夜，经15％和30％蔗糖在4℃梯度脱水，包埋后在冰冻切片机上切片。 

制好的切片置于梯度酒精溶液中(100％，15min；70％，2min；50％，2min；0％，2min)进行水化，然后浸入新鲜配置的Timm染色液中，在室温下避光孵育10-50分钟。显色液的成分为按12∶6∶2∶1混合的***树胶(50％w/v)、对苯二酚(5.67％w/v)、柠檬酸/柠檬酸钠溶液(26％，w/v；24％，w/v)和硝酸银溶液(17％w/v)。将染好的切片脱水、透明、封片后在显微镜下采集图像，用ImagePro-Plus软件分析。Timm指数代表苔藓纤维发芽所占的面积除以DG区的总面积，其大小是判断苔藓纤维发芽轻重程度的指标。每个动物的Timm指数是3张连续切片的平均值。 

Fluoro-Jade B和Nissl染色 

癫痫引起的细胞死亡用Fluoro-Jade B和Nissl染色两种方法检测，Fluoro-Jade B染色特异性标出死细胞，Nissl染色主要显示存活的细胞。 

Fluoro-Jade B染色步骤如下：切片在梯度酒精溶液中进行水化(100％，3分钟；70％，1分钟；50％，1分钟；0％，1分钟)，然后转移到0.06％高锰酸钾溶液中浸泡10分钟，经水洗三次后在fluoro-jade B(FJB)染色液中孵育30分钟，然后通过低浓度到高浓度的酒精脱水，二甲苯透明后封片。染色后的切片在Olympus LSM-GB200共聚焦显微镜下以绿色荧光进行扫描拍片。 

Nissl染色步骤如下：切片在室温晾干，置于1∶1的酒精/氯仿混合液中，浸泡30分钟，然后在梯度酒精溶液中依次进行水化(100、95、80、70、60、50和0％，每步3分钟)。随后，将切片放入甲酚紫溶液中染色10-30分钟，然后进行梯度酒精脱水、二甲苯透明，封片观察。尼氏染色的图片在Nikon E600FN正置显微镜下采图，用Image Pro-Plus软件为染色细胞记数。统计细胞数时，以每张切片上视野里的细胞数除以视野面积。 

统计分析 

所有统计分析都在双盲情况下进行，用SPSS 13.0软件进行成对或不成对的t检验、one-way ANOVA(post hoc Dunnett’s test)、two-way ANOVA(post hoc Bonferroni test)、卡方检验或Fisher精确性检验。P值低于0.05被认为有显著性差异。 

II.实施例 

实施例1、癫痫发作活动对NRG1-ErbB4信号通路的影响 

癫痫活动可以由多种刺激性因素所诱发，例如结构损伤、电刺激或化学试剂，进而触发一系列信号级联反应，最终可引起大量的基因表达，这不仅包括一些即早基因，而且还有一些营养因子，它们都可进一步影响大脑的结构和功能特性。本发明人首先观察颞叶癫痫活动是否上调Nrg1的基因转录水平。在大鼠电刺激点燃模型上诱导癫痫发作，之后用逆转录PCR、荧光实时定量PCR和原位杂交的方法检测Nrg1的mRNA水平的变化，结果发现，大鼠海马组织的Nrg1mRNA水平在癫痫发作后明显增加，在刺激后3小时达到高峰，约为本底水平的1.50±0.04倍，24小时后又基本恢复到本底水平(图1a；左半部分)。因为NRG1是分泌性蛋白，接着本发明人对癫痫模型大鼠的NRG1蛋白水平用ELISA的方法进行测定。结果显示，电刺激诱导的癫痫发作可以引起海马内NRG1蛋白表达水平的升高，在3小时后达到高峰，约为本底水平的1.93±0.09倍(图1b)。脑片原位杂交实验结果显示Nrg1mRNA在边缘叶脑区广泛地表达上调，其中最明显的部位是海马CA1和CA3区、齿状回、边缘叶皮层、梨状皮质、杏仁核(图1c)，而这些脑区在颞叶癫痫的病人和动物模型上都已被证实与癫痫活动具有很密切的关系。由于Nrg 1mRNA的三种最主要的亚型Nrg1-type I、II、和III(EGF样的结构域是各型NRG1激活受体酪氨酸激酶的必要条件，是保守区域；实施例中药理实验中所使用的人工体外重组NRG1即包含有整个EGF样结构域的活性多肽(GeneBank登录号NM_013956.3，氨基酸序列第176-246位))都在脑内有广泛的表达，所以本发明人对它们分别进行了分析观察。结果显示，这三个亚型的水平在癫痫活动后也都有不同程度的升高，其中以I型和II型上升最为明显(图2)。 

另外，本发明人还使用了匹罗卡品(Pilocarpine，即毛果芸香碱，购自Sigma公司)诱发癫痫的动物模型进行观察。该模型的特点是匹罗卡品能快速诱导动物出现剧烈的，持续性的肢体的紧张和惊厥，这种状态被称之为癫痫持续状态 (Status epilepticus，SE)，能维持数小时。结果发现匹罗卡品诱导的癫痫发作也能使NRG1在基因转录和蛋白表达都呈现明显的增加(图1和2)，说明NRG1的表达上调在癫痫的发病过程中是一种普遍的现象。 

本发明人随后通过检测脑内的磷酸化ErbB4(p-ErbB4)水平来判断癫痫活动是否改变NRG1信号通路的活性。结果发现，在点燃模型中，大鼠海马磷酸化ErbB4的水平在癫痫发作3小时后升高到了本底水平的4倍；在皮罗卡品模型中，其在癫痫发作6小时后升高到原来的7倍(图1d，e)。然而，在这两种癫痫动物模型中，总的ErbB4蛋白表达水平在癫痫发作前后都是不变的(图1d，e)。在小鼠模型中得到的结果与大鼠中的相一致(图3)，说明了以上发现在啮齿类动物中普遍存在。 

综上，分别从大鼠、小鼠的电刺激点燃和匹罗卡品诱导癫痫两种动物模型得到了一致的结果，充分说明了NRG1的基因表达和ErbB4的激活能响应癫痫发作活动，提示了与癫痫病的潜在关系。 

实施例2、NRG1、ecto-ErbB4和PD158780对ErbB4磷酸化的影响 

本发明人采用三种不同策略对实验动物的NRG1-ErbB4信号***进行药理学干预以测试其在癫痫病形成过程中的作用：其一脑室内注射人工重组的NRG1功能多肽(含NRG1的EGF功能区)以增加脑内NRG1活性形式的水平；其二是利用ecto-ErbB4(ErbB4受体胞外段的体外重组多肽)来结合脑内的内源性NRG1，以中和消减脑内的NRG1，防止其继续结合和激活体内的内源性受体；其三是用ErbB4磷酸化抑制剂PD158780来抑制ErbB4的激酶活性(详见实施例3和4)。首先，本发明人分别在体外和体内使用NRG1重组蛋白、ecto-ErbB4和ErbB4抑制剂PD 158780验证了它们的效应。 

本发明人在体外培养的海马神经元上，用不同浓度的NRG1重组多肽均能增高ErbB4磷酸化的水平(图4a)，1μg/ml以上浓度的ecto-ErbB4可以明显阻断这个作用(图4b)，而2mM以上浓度的PD158780则完全阻断ErbB4的磷酸化(图4c)。本发明人还在正常动物和癫痫模型动物脑内埋植给药套管，对动物在体实施脑内给药。结果发现，无论在对照还是电刺激点燃模型大鼠身上，侧脑室注射NRG1(10μM，5μl)、ecto-ErbB4(1μg/μl，5μl)或PD158780(2mM，5μl)都能明显影响脑内ErbB4的激活状态(图5)。 

综上，离体和在体实验都显示，NRG1、ecto-ErbB4和PD158780对ErbB4磷酸化干预的有效性。 

实施例3、NRG1对癫痫病生成过程的影响 

电刺激点燃模型是不断重复地给予动物脑内一个亚惊厥刺激强度的电刺激，最终却会导致该动物表现出行为发作级别上的不断增强和脑电图上癫痫样放电时间(Electrographic seizure duration)的逐步延长。该模型可以很好地模拟人类颞叶癫痫病的很多特征，能够再现一个正常的大脑是如何演变成癫痫的大脑的过程。与其他模型相比，电刺激点燃模型能够从癫痫发作的行为学和脑电图电生理学等方面更好地对癫痫病发生的过程进行评价。 

本发明人首先在点燃癫痫模型中检测注射外源性NRG1对癫痫病生成的作用，设置注射NRG1组、注射溶剂对照组和注射热变性失活NRG1对照组，三组的处理流程见图6a。评判的标准主要是观察在整个点燃过程中达到同样癫痫行为级别各组所需要的电刺激次数、相同次数的电刺激所引发的癫痫发作的强度和脑电图上相应记录到的癫痫放电的时程。与注射溶剂对照组和热变性失活NRG1组相比，每次电刺激前30分钟脑室内给予NRG1重组多肽能显著性地延迟点燃癫痫模型中癫痫的发展进程(图6b)，表现在行为学发作级别上的进程减慢、脑电图后发放时间(ESD)延伸的速度降低、诱发特定级别的发作所需的电刺激次数增多等方面(图6b，e)。到第十次电刺激时，溶剂对照组和变性失活NRG1处理组的大鼠表现出的发作级别分别为2.7±0.4、3.4±0.4，脑电图后发放时间分别为首次刺激的316±49％、385±56％；与此形成明显对比的是，NRG1处理组的大鼠表现出的发作级别仅为1.3±0.6而其脑电图后发放时间仅为首次刺激的154±58％。在NRG1作用下，大鼠被完全点燃(连续3次都出现5级癫痫发作)所需要的电刺激次数为21.1±1.3，明显高于溶剂对照组(16.6±0.8)和变性失活NRG1处理组(16.0±1.6)。这些发现证明，脑内注射NRG1蛋白能抑制点燃模型中癫痫的发展进程。 

在匹罗卡品模型动物身上，脑室内注射NRG1也能显著延迟癫痫发作的出现(图7a)，降低癫痫发作的强度(图7b)，说明了NRG1对不同癫痫模型均有作用。 

为了确定内源性的NRG1是否参与调节癫痫发生过程，本发明人使用ecto-ErbB4来中和消减体内的NRG1，观察其对癫痫发生的影响。在脑室内注射ecto-ErbB4(1μg/μl，5μl，i.cv.)后，癫痫发作进程大大加快，提示了内源性NRG1在癫痫病发生发展中的作用。ecto-ErbB4处理组的大鼠达到完全点燃状态所需要的电刺激次数急剧降低，为11.5±1.7；而溶剂对照或变性失活 ecto-ErbB4组的大鼠则分别为17.5±1.0和16.8±1.0次。同时，ecto-ErbB4处理组大鼠的脑电图后发放时间也显著延长(图6c，e)。例如，在第7次刺激时，与两对照组大鼠的248±55％(溶剂组)或276±34％(变性ecto-ErbB4组)脑电图后发放时程的增加幅度相比，ecto-ErbB4处理组大鼠表现出高达783±146％的增幅。 

综上，这些现象说明了NRG1与癫痫病的发展过程相关。 

实施例4、ErbB4参与介导NRG1的抗癫痫作用 

无论在对照还是电刺激点燃模型大鼠身上，侧脑室给予NRG1重组多肽(10μM每5μl)都能明显提高脑内ErbB4的磷酸化水平(图5a)，而给予ecto-ErbB4阻断内源性NRG1则降低了ErbB4的磷酸化水平(图5b)。因为ErbB4是唯一的既与NRG1配体有高亲和力且同时又拥有可激活的酪氨酸激酶区域的ErbB受体，其磷酸化介导NRG1许多方面的生理功能，有可能是NRG1抗癫痫作用的主要介导方式。为了验证这一点，本发明人在点燃前30分钟给予大鼠脑内注射PD158780(2mM，5μL，i.c.v.)来抑制ErbB4磷酸化活性(图5c；图4c)。与溶剂对照组相比，PD 158780大大加快了癫痫发作行为学级别的进展速度，显著延长了其脑电图后发放时间，降低了达到特定发作级别所需要的电刺激次数(图6d，e)。结合ecto-ErbB4实验的结果，以上数据表明ErbB4受体酪氨酸激酶活性(磷酸化)对NRG1的抗癫痫效应是非常必需的。 

当然，由于PD158780不是ErbB4的选择性激酶活性抑制剂，因而其它ErbB家族亚型如ErbB3等的受体激酶活性也可能同时被阻断。本发明人接着采用ErbB4敲除小鼠(为了避免全身性敲除ErbB4所带来的胚胎期致死，其心脏组织中特异性地重表达ErbB4)(图8a)来制作点燃模型以验证ErbB4作用的特异性。Western免疫印迹实验证实，纯合子小鼠的海马内检测不到ErbB4和磷酸化ErbB4的表达(图8b)。但是，ErbB4在大脑中的敲除不影响小鼠对脑电图反应的电刺激阈值(基因敲除的纯合子197±15μA；杂合子，168±14μA；野生型，190±30μA；图8c)，这表明ErbB4的移除不改变小鼠在基底状态下对电刺激的敏感度。然而，在电刺激点燃的过程中，基因敲除的纯合子小鼠的癫痫发生进程明显加快，其中达到完全点燃状态所需要的电刺激次数相比野生型小鼠降低了一半(图8d)；与此同时，其脑电图癫痫放电的时程在整个电刺激过程中也比对照组小鼠平均延长了约一倍(图8e)。 

以上结果证明：ErbB4受体磷酸化介导了NRG1的抗癫痫效应。 

实施例5、锥体神经元中NRG1-ErbB4信号***与癫痫病的发生发展无关 

实施例1-4的结果表明，NRG1通过激活ErbB4受体的酪氨酸磷酸化进而对癫痫发生起到了抑制性作用。为了探讨这一作用的细胞学机制，本发明人用Cre/LoxP介导的条件性基因敲除方法来选择性地在不同神经元中敲除ErbB4。 

本发明人还确定了兴奋性锥体神经元中的ErbB4是否参与NRG1对癫痫病的抑制作用。为此，本发明人构建了CaMKIIα-iCre；ErbB4^-/-小鼠，即在CaMKIIα阳性的兴奋性锥体神经元中特异性地敲除ErbB4基因(图9a-c)。免疫组化结果显示Cre重组酶在CaMKIIα-iCre；ErbB4^-/-小鼠的脑内高表达(图9a)，而且特异性表达在CaMKIIα阳性的神经元中(图9b)。经Western免疫印迹分析，与同窝对照组小鼠相比，条件性敲除的纯合子小鼠脑中的ErbB4表达量明显降低(图9c，d)，这提示ErbB4在成年脑内的兴奋性神经元中有很高的表达水平。但是，对于条件性敲除的纯合子小鼠而言，无论在电刺激点燃的阈值(图10a)、行为学发作强度(图10b)、脑电图放电发作持续时间(图10c)还是达到相同的发作级别所需要的电刺激次数(图10d)等方面与对照组小鼠(CaMKIIα-iCre和ErbB4-floxed)相比都没有统计学差异。此外，脑内注射NRG1(10μM，2μL，i.c.v.)仍然能够对CaMKIIα-iCre；ErbB4^-/-小鼠的癫痫发生起到抑制作用(图13c，d)。在CaMKIIα阳性锥体神经元中的敲除ErbB4也不影响电刺激点燃造成的癫痫大脑神经元的过度兴奋状态(图14)。为了避免这些突变小鼠可能存在的发育补偿等方面的潜在影响因素，本发明人还构建了CaMKIIα-CreER；ErbB4^-/-小鼠，使得CaMKIIα阳性神经元中ErbB4基因的敲除可以由它莫昔芬诱导来控制在成年期内进行(图9e，f)。免疫组化结果表明Cre重组酶也特异性地表达在这种小鼠的CaMKIIα阳性神经元中，而且他莫昔芬处理能足够地诱导Cre入核并剪切Erbb4基因(图9e，f)。Western免疫印迹实验结果显示，注射它莫西芬可以在在很大程度上敲除CaMKIIα-CreER；ErbB4^-/-小鼠脑内ErbB4的表达。与CaMKIIα-iCre；ErbB4^-/-小鼠相似，CaMKIIα-CreER；ErbB4^-/-小鼠在癫痫发作进展上与同窝对照小鼠相比没有明显差别(图10e-h)的。从这两种条件性敲除小鼠的观察可以得出结论，CaMKIIα阳性神经元中的ErbB4存在与否并不影响电刺激点燃造成的癫痫发生。 

实施例6、NRG1主要通过激活PV阳性中间神经元中的ErbB4来抑制癫痫发生 

篮状细胞和枝状细胞是两类可以表达小清蛋白(Parvalbumin，PV)的γ氨基丁酸能抑制性神经神经元。二者都能调控脑内神经环路中锥体神经元的兴奋性输出。因此，本发明人观察了在PV阳性神经元中特异性地敲除ErbB4的小鼠(PV-Cre；ErbB4^-/-)(图11)。值得注意的是，在点燃过程中，与同窝的PV-Cre和ErbB4-floxed小鼠相比，PV-Cre；ErbB4^-/-小鼠的癫痫发生进程显著加快(图12a-d)，出现了与ErbB4^-/-小鼠类似的表型(图8)，具体如下：第1点，在初次刺激时所诱发出的行为学发作级别(图12b)和脑电图放电时程(图12c)上都存在显著差异；第2点，PV-Cre；ErbB4^-/-小鼠仅仅需要6.6±0.7次刺激即可达到完全点燃状态，大约是对照组小鼠所需刺激次数的一半(图12d)；第3点，PV-Cre；ErbB4^-/-小鼠只需7次刺激其癫痫放电持续时间即可达到达到50秒以上，而此时两组对照组小鼠在整个点燃过程中最多只达到30秒(图12c)。以上发现确认了PV阳性神经元中的ErbB4与癫痫病的发展过程紧密相关。接着，本发明人对PV-Cre；ErbB4^-/-小鼠进行侧脑室注射NRG1，结果发现NRG1(10μM，2μl，i.c.v.)对癫痫发生的抑制作用在这种小鼠身上消失(图13a，b)。这些结果表明，PV阳性中间神经元中的ErbB4主要介导着NRG1的抗癫痫作用。 

实施例7、PV阳性中间神经元中的NRG1-ErbB4信号通路影响电刺激点燃引起的大脑过度兴奋性 

正如Goddard等所发现的，持续的电刺激点燃会在动物脑部产生持久的过度兴奋状态，这种状态甚至会持续终生。为了确定NRG1信号通路是否会影响这种高兴奋性状态，不同基因型的小鼠在完全点燃后，经过2周的休息时间，再接受一个相同强度的电刺激，然后评估诱发出的脑电图放电持续时间。结果显示，ErbB4^-/-和PV-Cre；ErbB4^-/-小鼠的放电时程均超过50秒，远远大于各自的对照组小鼠(25-35秒；图14)。这些结果揭示，PV阳性中间神经元中的NRG1-ErbB4信号通路不仅可以减弱点燃过程中癫痫发作的程度，而且还能缓解癫痫大脑过度兴奋性状态的形成。 

实施例8、PV阳性中间神经元中的NRG1-ErbB4信号通路对点燃引起的自发性癫痫发生率的影响 

结合闭路电视持续监控和脑电图记录等手段在电刺激结束后对小鼠行为和EEG两方面进行长期观测，本发明人发现，PV-Cre；ErbB4^-/-小鼠更容易表现出自发性癫痫发作(图12e-g)。在两个月内，有70％的PV-Cre；ErbB4^-/-小鼠出现 自发性癫痫(图12e)。与之相比，点燃的PV-Cre和ErbB4-floxed小鼠自发癫痫的发生率分别只有10％和11％。EEG的监测从电生理方面进一步证实这一发现(12f)。因此，PV阳性神经元中的NRG1-ErbB4信号通路与自发性癫痫的易感性也有关。 

实施例9、NRG1-ErbB4信号通路对苔藓纤维发芽病理特征的影响 

人类癫痫病有一个重要的慢性病理特征是苔藓纤维发芽，与癫痫的发病过程密切相关。因此本实施例验证NRG1及其ErbB4受体的活性是否也能对苔藓纤维发芽这一异常病理现象有抑制作用。 

大鼠一般在反复的癫痫发作后数周出现苔藓纤维发芽。在本实施例中，点燃结束2个月后在大鼠脑内的海马齿状回的颗粒细胞层和内分子层能检测到苔藓纤维发芽现象(用Timm染色指数表示程度)。NRG1处理组大鼠的癫痫纤维发芽低于对照组大鼠；相比之下，PD158780处理组大鼠的苔藓纤维发芽则明显高于对照组大鼠(图15a，b)。另外，点燃引起的苔藓纤维发芽在ErbB4^+/-以及PV-Cre；ErbB4^-/-小鼠身上都要比各自的同窝对照小鼠要明显严重(图15c，d)。这些结果表明，NRG1-ErbB4信号与癫痫发作造成的神经环路的长期改变也有关。 

实施例10、以NRG1和ErbB4为靶点的抗癫痫潜在物质的筛选方法 

细胞模型：表达有NRG1和ErbB4的海马神经元细胞。 

测试组：用候选物质处理的上述细胞的培养物； 

对照组：不用候选物质处理的上述细胞的培养物。 

检测两组中情况。如果与对照组相比，测试组中的NRG1蛋白的表达显著上调20％以上，则说明该候选物质是潜在的缓解癫痫的物质。 

或者，检测两组中ErbB4的磷酸化情况。如果与对照组相比，测试组中的ErbB4蛋白的磷酸化比例显著上调20％以上，则说明该候选物质是潜在的缓解癫痫的物质。采用上述方法，将重组的NRG1功能多肽(含NRG1的EGF功能区)作为候选物质1，处理所述细胞模型。结果发现，候选物质1可以提高ErbB4的磷酸化水平20％以上，其是缓解癫痫的潜在有效药物。 

采用上述方法，将ecto-ErbB4作为候选物质2处理细胞，结果发现，ecto-ErbB4不能提高NRG1蛋白的表达或活性，也不能提高ErbB4的磷酸化水平，其不能作为缓解癫痫的潜在有效药物。 

采用上述方法，将PD158780(购自Calbiochem公司)作为候选物质3处理 细胞，结果发现，PD158780不能提高NRG1蛋白的表达或活性，也不能提高ErbB4的磷酸化水平，其不能作为缓解癫痫的潜在有效药物。 

实施例11、以NRG1和ErbB4为靶点的抗癫痫潜在物质的另一筛选方法 

动物模型：表达有NRG1和ErbB4的正常动物或癫痫动物模型。 

测试组：用候选物质对动物进行脑内注射； 

对照组：用不含候选物质的溶剂对动物进行脑内注射； 

检测两组中情况。如果与对照组相比，测试组动物整个脑内的NRG1蛋白的表达显著上调20％以上，则说明该候选物质是潜在的缓解癫痫的物质。 

或者，检测两组中ErbB4的磷酸化情况。如果与对照组相比，测试组中的ErbB4蛋白的磷酸化比例显著上调20％以上，则说明该候选物质是潜在的缓解癫痫的物质。采用上述方法，将重组的NRG1功能多肽(NM_013956.3；氨基酸序列176-246；含NRG1的EGF功能区)作为候选物质1，分别注射入正常大鼠的脑内和癫痫大鼠模型的脑内。结果发现，候选物质1可以提高海马内ErbB4的磷酸化水平20％以上，其是缓解癫痫的潜在有效药物。 

采用上述方法，将ecto-ErbB4作为候选物质2分别注射入正常大鼠的脑内和癫痫大鼠模型的脑内。结果发现，ecto-ErbB4不能提高NRG1蛋白的表达或活性，也不能提高海马组织内ErbB4的磷酸化水平，其不能作为缓解癫痫的潜在有效药物。 

采用上述方法，将PD158780(购自Calbiochem公司)作为候选物质3分别注射入正常大鼠的脑内和癫痫大鼠模型的脑内。结果发现，PD158780不能提高海马组织内NRG1蛋白的表达或活性，也不能提高ErbB4的磷酸化水平，其不能作为缓解癫痫的潜在有效药物。 

实施例12、以NRG1和ErbB4为靶点的抗癫痫潜在物质的另一筛选方法 

组织模型：表达有NRG1和ErbB4的海马组织。 

测试组：用候选物质处理上述组织； 

对照组：用不含候选物质的溶剂处理上述组织； 

检测两组中情况。如果与对照组相比，测试组中海马组织内的NRG1蛋白的表达显著上调20％以上，则说明该候选物质是潜在的缓解癫痫的物质。 

或者，检测两组中ErbB4的磷酸化情况。如果与对照组相比，测试组中的ErbB4蛋白的磷酸化比例显著上调20％以上，则说明该候选物质是潜在的缓解 癫痫的物质。采用上述方法，将重组的NRG1功能多肽(NM_013956.3；氨基酸序列176-246；含NRG1的EGF功能区)作为候选物质1，注射入表达有NRG1和ErbB4的海马组织。结果发现，候选物质1可以提高海马内ErbB4的磷酸化水平20％以上，其是缓解癫痫的潜在有效药物。 

采用上述方法，将ecto-ErbB4(作为候选物质2分别注射入表达有NRG1和ErbB4的海马组织。结果发现，ecto-ErbB4不能提高NRG1蛋白的表达或活性，也不能提高海马组织内ErbB4的磷酸化水平，其不能作为缓解癫痫的潜在有效药物。 

采用上述方法，将PD158780(购自Calbiochem公司)作为候选物质3分别注射入表达有NRG1和ErbB4的海马组织。结果发现，PD158780不能提高海马组织内NRG1蛋白的表达或活性，也不能提高ErbB4的磷酸化水平，其不能作为缓解癫痫的潜在有效药物。 

实施例13、ErbB4在第1056氨基酸序列位点的酪氨酸磷酸化参与介导NRG1的抗癫痫效应 

ErbB4的胞内端有许多可发生酪氨酸磷酸化位点，鉴于其在脑内的广泛表达，其磷酸化位点的特异性可能介导着不同的功能。本发明人在前述实施例中证明PV阳性的抑制性神经元介导着NRG1对癫痫发生的抑制作用。那么鉴定出在抑制性神经元中特异性表达和上调的磷酸化位点，将有助于探明具体是ErbB4上哪些位点的磷酸化在癫痫发生中起作用。为了寻找这些特异性位点，本发明人在离体培养的神经元上进行实验来鉴定筛选。由于在实施例5和6中证明在CaMKIIa阳性神经元中的ErbB4不对癫痫起作用，PV阳性的抑制性神经元中的ErbB4对癫痫起作用。本发明人首先在体外用不同方法再次验证这些ErbB4是否的确存在兴奋性神经元表达，结果发现，大部分的ErbB4与CaMKIIa共标，说明存在于这些神经元中(图16a)。接着，本发明人使用了一个针对性检测ErbB4在1284位氨基酸位点的酪氨酸磷酸化的抗体来进行标记，发现ErbB4在1284位置的磷酸化在所有ErbB4阳性细胞表达(图16b，上排)，进一步地，发现这个位点的磷酸化大多数表现在兴奋性神经元中(CaMKIIa阳性；图16下排)，排除了这个位点的磷酸化在癫痫中的作用。这也说明癫痫的在特定位点而不是所有位点的磷酸化会参与抑制癫痫发生的作用。接着本发明人使用了针对ErbB4在氨基酸序列第1056位(基于GenBank登录号NM_005235.2的ErbB4氨基酸序列)磷酸化的抗体进行检测，这个抗体也是在前述实施例中大小鼠模型实验中所用的那 个磷酸化抗体。结果发现，在一部分ErbB4阳性的神经元中呈现第1056位点的磷酸化(图16c，左)，这个位点的；磷酸化可以被NRG1所诱导上调，并且上调后也还是只表达在一部分ErbB4阳性神经元中(图16c，右)。进一步的发现揭示，1056位点的ErbB4酪氨酸磷酸化存在于GAD67(抑制性神经元)阳性神经元中，且只在其中一部分细胞内表达(图16d，上排)。由于PV阳性神经元只占抑制性神经元的一部分。所以，缩小范围进行鉴定，最后确认ErbB4在1056位点的磷酸化活性存在于PV阳性的神经元中。结合前述在体实验的证明，这些发现提示ErbB4在1056位点处的磷酸化上特异性介导着NRG1-ErbB4信号通路在癫痫发生过程中的抑制作用，是NRG1抗癫痫效应的一个精确靶点，也是筛选抗癫痫药物的一个敏感检测位点。 

实施例14、AKT信号通路介导着NRG1-ErbB4***的抗癫痫效应 

NRG1与ErbB4受体结合激起ErbB4磷酸化后，可以激活一系列的细胞内下游信号通路如Ras-MEK-ERK，PI3K-Akt-S6K等等。哪些通路介导着NRG1的抗癫痫效应也是一个关键的问题。本发明人通过在离体培养PV-Cre；ErbB4^-/-小鼠的海马神经元来观察那些分子信号通路与NRG1-ErbB4的抗癫痫作用有关。野生型小鼠和PV-Cre；ErbB4-/-小鼠的神经元被体外分离培养，在DIV14天(分化14天)开始分别接受KCl刺激、NRG1刺激或两者联合刺激，刺激时间为5分钟或15分钟，然后检测PI3K-Akt-S6K通路中的活性，以AKT磷酸化水平作为指标。结果发现(图17)，在离体培养的野生型对照细胞中，加入高钾进行刺激以模拟在体癫痫模型中癫痫发作所引起的神经元兴奋性活动，或者NRG1均可以诱导ErbB4(Tyr1056)磷酸化的显著升高(下部)，并激活AKT使其磷酸化水平大幅度升高，而总的AKT表达量不变(上部)。而在PV-Cre；ErbB4-/-小鼠的培养细胞中，特异性地在PV阳性中间神经元里敲除ErbB4，培养神经元中的总体ErbB4磷酸化水平明显下降，并且不响应NRG1的刺激诱导(下部)，此时AKT磷酸化活性明显被抑制，加入NRG1刺激也不能再上调AKT的磷酸化水平(上部)。作为对照，本发明人发现，检测PV-Cre；ErbB4^-/-小鼠脑内ERK磷酸化可以照常上调，其上调幅度与野生型小鼠的差别不大，(其中的细微差距是由于PV-Cre；ErbB4^-/-小鼠脑内本身活性依赖的兴奋性较强，会在稳态上对ERK活性有所调节影响，但这不影响主要结论，这一点相关领域的专业人士都可明白)，排除了这个通路的在NRG1抗癫痫效应上起主要作用的可能性。同时，鉴于PI3K-Akt-S6K在神经环路中的作用，以上结果说明了PI3K-Akt-S6K通路是癫痫发生的过程中PV阳性神 经元中的NRG1-ErbB4信号***的下游靶点。 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

Claims (17)

1.一种神经调节素1或其上调剂的用途，用于制备预防、改善或治疗癫痫的组合物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的神经调节素1通过与鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4相互作用，促进鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4磷酸化，预防、改善或治疗癫痫。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物用于：

延缓癫痫的形成；和/或

抑制癫痫持续状态；和/或

提高鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4磷酸化的水平；和/或

减弱癫痫发作引起的脑兴奋性程度；和/或

抑制苔藓纤维发芽；和/或

调控下游的PI3K-Akt-S6K通路；和/或

促进AKT蛋白的磷酸化水平。

4.一种鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4磷酸化促进剂的用途，用于制备预防、改善或治疗癫痫的组合物。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化促进剂选自：鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的特异性配体，鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化激酶区域激活剂。

6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的特异性配体选自：神经调节素1。

7.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的组合物用于：

延缓癫痫的形成；和/或

抑制癫痫持续状态；和/或

减弱癫痫发作引起的脑兴奋性程度；和/或

抑制苔藓纤维发芽。

8.一种神经调节素1和/或鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的用途，用于筛选预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。

9.一种筛选预防、改善或治疗癫痫的潜在物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)将候选物质与表达神经调节素1和/或鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的体系接触；

(b)检测神经调节素1的表达或活性，若所述候选物质在统计学上提高神经调节素1的表达或活性，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质；和/或

检测鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化水平，若所述候选物质在统计学上提高鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化水平，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述的体系表达神经调节素1和鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4，两者发生相互作用；

步骤(b)中，检测神经调节素1和鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4相互作用情况，若所述候选物质在统计学上促进神经调节素1和鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的相互作用，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述的检测鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化水平包括：检测鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4氨基酸序列中第1056位的酪氨酸的磷酸化水平，若该位点的磷酸化水平在统计学上提高，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。

12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的表达神经调节素1和/或鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的体系中还包括AKT信号通路；步骤(b)中，所述方法还包括：

检测AKT信号通路的激活状况或检测AKT蛋白的磷酸化水平，若AKT信号通路被激活或者AKT蛋白的磷酸化水平在统计学上提高，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。

13.一种神经调节素1的用途，用于制备检测癫痫的试剂。

14.一种特异性识别神经调节素1或其编码基因的试剂的用途，用于制备检测癫痫的试剂或试剂盒。

15.一种检测癫痫的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有：特异性识别神经调节素1或其编码基因的试剂。

16.一种特异性检测鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4磷酸化水平的试剂的用途，用于制备检测癫痫的试剂或试剂盒。

17.一种检测癫痫的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有：特异性检测鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4磷酸化水平的试剂。

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