CN107535482A - 一种大块卵巢组织玻璃化冷冻载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了提供一种大块卵巢组织玻璃化冷冻载体，所述载体由载体内芯和外套管组成，所述载体内芯与外套管螺纹连接，既保持良好的密封性，防止卵巢组织的交叉感染；同时也方便使用者操作；所述载体内芯由上至下依次由手持部、帽部、支持部和承载部组成，所述承载部由支持部夹持固定；使用时，大块卵巢组织置于远离支持部的承载部的一个端部，所述端部即大块卵巢组织装载区；经实验验证，使用本发明所述载体，不仅提高冷冻剂渗透效率，而且操作简单、价格低廉、便于大块卵巢组织的批量储存，适于推广应用。

Description

一种大块卵巢组织玻璃化冷冻载体及其应用

技术领域

本发明属于医疗器械领域，具体涉及一种大块卵巢组织玻璃化冷冻载体及其应用。

背景技术

卵巢组织冷冻保存对于待放化疗治疗的成年女性是最快且最有效保存生育力的方法，对于***前的女性来说，卵巢组织冷冻是保存生育能力的唯一途径。传统的卵巢组织冷冻技术采取程序化冷冻，目前已通过该技术已帮助多名女性获得自己的孩子。但程序化冷冻技术因仪器价格昂贵、冷冻时间长、操作繁琐等缺点限制卵巢冷冻技术的临床推广。玻璃化冷冻技术是未来细胞/组织低温冷冻的趋势，具备操作简单、成本低廉、冷冻效率高等优势，目前已在人***和胚胎冷冻保存领域中基本完全替代了程序化冷冻。玻璃化冷冻技术是利用将细胞/组织放到特殊冷冻载体，直接投入液氮，使冷冻保护剂瞬间由液体变为玻璃样固态，避免细胞内形成冰晶。

尽管玻璃化冷冻已逐渐开始应用于卵巢组织冷冻区域，但冷冻组织体积大多维持在1mm×(1-5)mm×(1-5)mm，其主要原因是组织块过大会引起冷冻保护剂短时间无法浸透中央区域，而长时间冷冻剂暴露会造成严重的细胞毒性损伤。小块卵巢组织(≤50mm³)由于移植组织中仅含有少量卵泡，移植后内分泌功能维持时间较短(1-3年)。而大块卵巢皮质(≥80mm³)因为含有丰富的原始卵泡库存，能够使激素维持时间更长，在女性生育力保存领域具有广阔的应用前景。因此，如何实现大块卵巢组织玻璃化冷冻过程中卵巢中央区域保护剂的充分渗透是成功的关键。

冷冻载体是玻璃化承载细胞/组织的装置，是玻璃化冷冻成功的关键因素之一。目前卵巢冷冻使用的玻璃化冷冻载体主要包括冷冻麦管、冷冻环、细胞筛网、针刺式载体等，其中冷冻麦管和冷冻环仅能装载较小体积的卵巢组织，针刺式载体会造成卵巢组织不可逆机械损伤，细胞筛网放入液氮罐储存时占用体积过大，不易批量储存。因此，上述载体在卵巢组织冷冻保存的临床应用推广中面临很多困难，尚未被广泛接受。目前市面上卵巢组织载体仅见KITAZATO公司的Ova Cryo Device Type M载体，不仅价格昂贵(约300元/支)，而且在卵巢组织装载过程中钢针与皮质接触面积小，易脱落，在临床及科研工作中难以普及。

发明内容

针对上述现有技术中大块卵巢组织玻璃化冷冻载体的设计之不足，发明人经长期的技术与实践探索，提供一种简单高效、价格低廉的大块卵巢玻璃化冷冻载体。经实验验证，使用本发明所述载体，不仅提高冷冻剂渗透效率，而且操作简单、价格低廉、便于大块卵巢组织的批量储存，适于推广应用。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供了一种大块卵巢组织玻璃化冷冻载体，所述载体由载体内芯和外套管组成，所述载体内芯与外套管螺纹连接，既保持良好的密封性，防止卵巢组织的交叉感染；同时也方便使用者操作；

所述载体内芯由上至下依次由手持部、帽部、支持部和承载部组成，所述承载部由支持部夹持固定；使用时，大块卵巢组织置于远离支持部的承载部的一个端部，所述端部即大块卵巢组织装载区；

优选的，所述承载部为金属筛网，进一步优选的，所述金属筛网为80-120目304不锈钢金属筛网，本发明特别选用特定目数的不锈钢材质金属筛网作为承载部，一方面能够满足冷冻保护剂对卵巢组织的渗透需求，同时兼顾卵巢冷冻载体的软硬度，方便卵巢组织冷冻复苏操作，同时其还具有价格便宜、不生锈、坚固耐用等优势；

优选的，所述载体内芯与外套管连接处设置有密封圈，从而加强密封作用，避免卵巢组织的交叉感染；

优选的，所述手持部直径小于帽部直径，方便使用者取用，进一步优选的，所述手持部设置有多个防滑凸起，更便于使用者取用；

优选的，所述支持部外径小于外套管的内径，且载体内芯是通过支持部上设置的外螺纹与外套管上设置的内螺纹与外套管进行螺纹连接；

优选的，所述外套管底部设置有一至多个稳定架，防止保藏时载体倾斜。

本发明的第二个方面，公开了所述载体在卵巢组织玻璃化冷冻和玻璃化复苏中的应用。

具体的，所述卵巢组织为大块卵巢组织，优选的，所述大块卵巢组织体积为1mm×(0.5-1)cm×(0.8-1.5)cm；本发明通过精心设计，从而提高了卵巢组织玻璃化冷冻保护剂渗透率，提高玻璃化冷冻效率，从而实现对大块卵巢组织的玻璃化冷冻。

所述应用具体方法为：

玻璃化冷冻：将大块卵巢组织先在平衡液中室温平衡，然后置于玻璃化冷冻液中冷冻处理一段时间；待吸干卵巢组织表面液体后，持手持部将大块卵巢组织平铺在承载部组织装载区，装载后迅速将载体帽部以下部位置于液氮并搅动，而后将载体内芯放入已装有液氮中的外套管中，并拧紧，放入冻存盒中长期保存；

玻璃化复苏：从冷冻盒中取出载体，在液氮表面将载体内芯旋开，持手持部将平铺的卵巢组织移入已预热的复苏液I中平衡，再将卵巢组织移入复苏液II中进行室温平衡，最后移至G-mops处理液中平衡即完成玻璃化复苏，而后可进行形态分析和培养后激素测定。

其中，平衡液组分为：基础液+7.5％二甲基亚砜+7.5％乙二醇；

玻璃化冷冻液组分为：基础液+20％二甲基亚砜+20％乙二醇+0.5M蔗糖；

复苏液I组分为：基础液+1M蔗糖；

复苏液II组分为：基础液+0.5M蔗糖；

上述基础液组分为G-mops处理液+5％人血清白蛋白(HSA)；

与现有技术相比，本发明有益效果为：

(1)成本低，操作简单，本发明制备的大块卵巢组织玻璃化冷冻载体选用材料来源广、价格低；操作过程可在室温下操作，避免了传统冷冻法中使用程序冷冻仪的高额费用及繁琐程序；

(2)本发明中载体外套管装载有液氮，使得液氮与固定在金属筛网上的卵巢组织直接接触，且金属筛网具有良好的导热性能，从而加快冷冻速度，延长冷冻时间，并减少样品的冷冻时间；同时，需要说明的是，本发明中液氮置于外套管中，当载体内芯与外套管通过螺纹连接闭合后，即与卵巢组织形成了独立封闭接触，避免卵巢组织受到潜在其他病原微生物、病毒污染，且闭合进行冷冻保存时，旋紧后的金属筛网即维持固定状态，防止卵巢组织样品因晃动脱离金属网，从而更加方便卵巢组织样品存取；

(3)使用本发明所述载体操作，可将卵巢组织表面附着的冷冻保护剂体积降至最低，从而有效提高降温速率和降低玻璃化冷冻液残留的不利影响，同时，由于玻璃化冷冻降温速率的明显提高，因此可以采用较低浓度的玻璃化冷冻液进行脱水处理，因此进一步降低玻璃化冷冻液毒性风险；

(4)采用本发明所述载体及使用方法，可以良好保存卵泡的形态和活力，同时本发明设计的载体可以直接冷冻较大块的卵巢组织，从而进一步提高了卵巢组织存活率；

(5)本发明设计载体在不影响甚至增加使用方便性的基础上，减少卵巢组织冷冻所占用的空间，大幅度节约了冷冻储存所需占地面积，便于批量储存，适于卵巢组织库的建立及临床推广应用。

附图说明

图1为本发明中冷冻载体内芯结构示意图，其中图1(a)为正视图，图1(b)为侧视图；

图2为本发明中冷冻载体内芯仰视图；

图3为本发明中冷冻载体外套管剖面图；

图4为本发明中冷冻载体外套管仰视图；

图5为使用本发明进行大块卵巢组织玻璃化冷冻复苏后形态观察图；

图6为使用本发明进行大块卵巢组织玻璃化冷冻复苏后激素水平测定。

其中，1-手持部，2-帽部，3-密封圈，4-支持部，5-外螺纹，6-承载部，7-卵巢组织装载区，8-内螺纹，9-外套管，10-稳定架。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

在本发明中，术语如“上”、“下”、“左”、“右”、“前”、“后”、“竖直”、“水平”、“侧”、“底”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，只是为了便于叙述本发明各部件或元件结构关系而确定的关系词，并非特指本发明中任一部件或元件，不能理解为对本发明的限制。

正如背景技术所介绍的，现有技术中对卵巢冷冻使用的玻璃化冷冻载体主要包括冷冻麦管、冷冻环、细胞筛网、针刺式载体，但普遍存在冷冻卵巢组织过小，冷冻效果不佳，对卵巢组织有损伤，价格高昂等各种问题；

有鉴于此，本发明的一个典型实施方式中，提供一种大块卵巢组织玻璃化冷冻载体，所述载体由载体内芯和外套管(9)组成，所述载体内芯与外套管(9)螺纹连接；

所述载体内芯由上至下依次由手持部(1)、帽部(2)、支持部(4)和承载部(6)组成，所述承载部(6)由支持部(4)夹持固定；使用时，大块卵巢组织置于远离支持部(4)的承载部(6)的一个端部，所述端部即大块卵巢组织装载区(7)；

其中，所述承载部(6)为金属筛网，进一步优选的，所述金属筛网为80-120目304不锈钢金属筛网；

所述载体内芯与外套管(9)连接处设置有密封圈(3)，从而加强密封作用，避免卵巢组织的交叉感染；

所述手持部(1)直径小于帽部(2)直径，所述手持部(1)设置有多个防滑凸起，更便于使用者取用；

所述支持部(4)外径小于外套管(9)的内径，且载体内芯是通过支持部(4)上设置的外螺纹(5)与外套管(9)上设置的内螺纹(8)与外套管进行螺纹连接；

所述外套管底部设置有一至多个稳定架(10)，防止保藏时载体倾斜。

本发明的又一具体实施方式中，公开了所述载体在卵巢组织玻璃化冷冻和玻璃化复苏中的应用。

具体的，所述卵巢组织为大块卵巢组织，所述大块卵巢组织体积为1mm×(0.5-1)cm×(0.8-1.5)cm；

所述应用具体方法为：

玻璃化冷冻：卵巢组织切成1mm×(0.5-1)cm×(0.8-1.5)cm大小组织块，在平衡液中室温平衡25min，在玻璃化冷冻液中15min；待吸干卵巢组织表面液体后，持手持部(1)将大块卵巢组织平铺在承载部(6)卵巢组织装载区(7)，装载后迅速将载体帽部(1)以下部位置于液氮并搅动，而后将载体内芯放入已装有液氮中的外套管(9)中，并拧紧，放入冻存盒中长期保存；

玻璃化复苏：从冷冻盒中取出载体，在液氮表面将载体内芯旋开，持手持部(1)将平铺的卵巢组织移入已预热的37℃复苏液I中平衡1分钟，再将卵巢组织移入复苏液II中进行室温平衡5分钟，最后移至G-mops处理液中平衡10分钟即完成玻璃化复苏，而后可进行形态分析和培养后激素测定。

其中，平衡液组分为：基础液+7.5％二甲基亚砜+7.5％乙二醇；

玻璃化冷冻液组分为：基础液+20％二甲基亚砜+20％乙二醇+0.5M蔗糖；

复苏液I组分为：基础液+1M蔗糖；

复苏液II组分为：基础液+0.5M蔗糖；

上述基础液组分为G-mops处理液+5％人血清白蛋白(HSA)；

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。

实施例

参见图1-4，本发明提供一种大块卵巢组织玻璃化冷冻载体，其中包括载体内芯和外套管。载体内芯由手持部(1)、帽部(2)以及夹持金属筛网的支持部(4)组成。内芯设有外螺纹(5)，外套管设有内螺纹(8)，密封效果好，避免卵巢组织的交叉感染。其中载体内芯各部件一体成型，大块卵巢组织位于载体内芯所含金属筛网的卵巢组织装载区(7)。

本发明金属筛网选用80-120目304不锈钢金属筛网，既满足冷冻保护剂对组织的渗透需求，又兼顾冷冻载体的软硬度，方便卵巢组织冷冻复苏操作，还具有价格便宜、不生锈等优势。卵巢组织在投入液氮进行玻璃化冷冻前，用无菌纱布吸干卵巢组织表面液体，然后将卵巢组织平铺在金属筛网上，保证进入液氮后能够快速降温。

本发明采用手持部代替传统内陷式冷冻管帽，手持部(1)的长度为1-2cm，方便卵巢组织装载操作，避免镊子加持不稳的弊端，直接通过手持在液氮面上方即可轻松的将载体内芯装进外套管并拧紧。

本发明还提供一种大块卵巢组织冷冻保存的方法，该方法使用以上冷冻载体，获得部分实验结果见图5和图6。实验人员通过该示例，可明白该发明提供的大块卵巢组织玻璃化冷冻载体的使用效果。

玻璃化冷冻试剂：

基础液：G-mops+5％HSA(G-mops购自Vitrolife公司)

平衡液：基础液+7.5％二甲基亚砜+7.5％乙二醇

玻璃化冷冻液：基础液+20％二甲基亚砜+20％乙二醇+0.5M蔗糖

复苏液I：基础液+1M蔗糖

复苏液II：基础液+0.5M蔗糖

操作步骤：

玻璃化冷冻：卵巢组织切成1mm×(0.5-1)cm×(0.8-1.5)cm大小组织块，在平衡液中室温平衡25min，在玻璃化冷冻液中15min。吸干卵巢组织表面液体后，手持(1)将卵巢组织平铺在组织装载区(7)，装载后迅速将帽部(2)以下部位放入液氮并搅动，将载体内芯装入已在液氮中的外套管(9)中，并拧紧，放入冻存盒中长期保存。

玻璃化复苏：用镊子冷冻管夹住，在液氮表面用手将载体内芯旋开，持(1)将卵巢组织移入预热的37℃复苏液I中平衡1min，再将卵巢组织移入复苏液II中，室温平衡5min，移至G-mops中平衡10min后，进行形态分析和培养后激素测定。

图5为使用本发明进行大块卵巢组织玻璃化冷冻复苏后形态观察图，其中对照组(Control)为新鲜卵巢组织，实验组(Vitrification)为玻璃化冷冻复苏后卵巢组织，可见经过冷冻复苏后的卵巢组织始基卵泡基膜完整，***核膜清晰，颗粒细胞均匀，形态正常，与新鲜卵巢组织无显著性差异；

图6为使用本发明进行大块卵巢组织玻璃化冷冻复苏后激素水平测定，其中对照组(Control)为新鲜卵巢组织激素分泌水平，实验组(Vitrification)为玻璃化冷冻复苏后卵巢组织激素分泌水平，其***(E2)和孕酮(P)分泌水平与新鲜卵巢组织无显著性差异。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种大块卵巢组织玻璃化冷冻载体，其特征在于，所述载体由载体内芯和外套管组成，所述载体内芯与外套管螺纹连接；

所述载体内芯由上至下依次由手持部、帽部、支持部和承载部组成，所述承载部由支持部夹持固定；使用时，大块卵巢组织置于远离支持部的承载部的一个端部，所述端部即大块卵巢组织装载区。

2.如权利要求1所述的一种载体，其特征在于，所述承载部为金属筛网，优选的，所述金属筛网为80-120目304不锈钢金属筛网。

3.如权利要求1所述的一种载体，其特征在于，所述载体内芯与外套管连接处设置有密封圈。

4.如权利要求1所述的一种载体，其特征在于，所述手持部直径小于帽部直径，优选的，所述手持部设置有多个防滑凸起。

5.如权利要求1所述的一种载体，其特征在于，所述支持部外径小于外套管的内径，且载体内芯通过支持部上设置的外螺纹与外套管上设置的内螺纹与外套管进行螺纹连接。

6.如权利要求1所述的一种载体，其特征在于，所述外套管底部设置有一至多个稳定架。

7.权利要求1-6任一项所述载体在卵巢组织玻璃化冷冻和玻璃化复苏中的应用。

8.如权利要求7所述应用，其特征在于，所述卵巢组织为大块卵巢组织，优选的，所述大块卵巢组织体积为1mm×(0.5-1)cm×(0.8-1.5)cm。

9.如权利要求7或8所述应用，其特征在于，所述应用具体方法为：

玻璃化冷冻具体应用方法为：将大块卵巢组织先在平衡液中室温平衡，然后置于玻璃化冷冻液中冷冻处理一段时间；待吸干卵巢组织表面液体后，持手持部将大块卵巢组织平铺在承载部组织装载区，装载后迅速将载体帽部以下部位置于液氮并搅动，而后将载体内芯放入已装有液氮中的外套管中，并拧紧，放入冻存盒中长期保存；

玻璃化复苏具体应用方法为：从冷冻盒中取出载体，在液氮表面将载体内芯旋开，持手持部将平铺的卵巢组织移入已预热的复苏液I中平衡，再将卵巢组织移入复苏液II中进行室温平衡，最后移至G-mops处理液中平衡即完成玻璃化复苏，而后可进行形态分析和培养后激素测定。

10.如权利要求9所述应用，其特征在于，

所述平衡液组分为：基础液+7.5％二甲基亚砜+7.5％乙二醇；

所述玻璃化冷冻液组分为：基础液+20％二甲基亚砜+20％乙二醇+0.5M蔗糖；

所述复苏液I组分为：基础液+1M蔗糖；

所述复苏液II组分为：基础液+0.5M蔗糖；

所述基础液组分为G-mops处理液+5％人血清白蛋白。