CN108739795A - 一种脂肪干细胞冻存液及其冻存方法 - Google Patents

一种脂肪干细胞冻存液及其冻存方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108739795A
CN108739795A CN201810540613.2A CN201810540613A CN108739795A CN 108739795 A CN108739795 A CN 108739795A CN 201810540613 A CN201810540613 A CN 201810540613A CN 108739795 A CN108739795 A CN 108739795A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dmso
stock solution
frozen stock
cow
glycerine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810540613.2A
Other languages
English (en)
Inventor
徐智峰
张新
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Shaai Biological Technology Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Shaai Biological Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Shaai Biological Technology Co ltd filed Critical Guangzhou Shaai Biological Technology Co ltd
Priority to CN201810540613.2A priority Critical patent/CN108739795A/zh
Publication of CN108739795A publication Critical patent/CN108739795A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明具体公开了一种脂肪干细胞冻存液，所述冻存液包括以下组分：DMEM培养液、F12培养液、二甲基亚砜(DMSO)、牛血清、羟乙基淀粉、人血清白蛋白和甘油；所述各组分的重量百分数如下：DMEM培养液30％‑60％，F12培养液10％‑30％，二甲基亚砜(DMSO)5％‑15％，牛血清2％‑8％，羟乙基淀粉1％‑10％，人血清白蛋白2％‑8％，甘油3％‑10％。本发明的冻存液结合传统冻存液配制方法，在原有的基础上进行了改进，降低了二甲基亚砜的用量，新添加了羟乙基淀粉和细胞稳定剂。经过反复摸索，采用了甘油和人血清白蛋白混合液经不同比例混合后加到上述冷冻液中作为细胞稳定剂，经过对比试验，效果满意。

Description

一种脂肪干细胞冻存液及其冻存方法
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，具体地，涉及一种脂肪干细胞冻存液及其冻存方法。
背景技术
脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是一种能够高度自我分化成各种细胞并且大量存在于脂肪组织中的细胞群体。它能够在特定的条件下分化成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞等不同种类的细胞。由于脂肪干细胞分化条件和方向的不确定性，目前临床上采用颗粒脂肪移植，主要应用在美容整形等方面。
然而移植脂肪高吸收率、低存活率的问题一直困扰着整形外科医师，若想达到长期满意效果，常需进行二次手术移植。如一次吸脂后将移植后多余的脂肪颗粒体外冻存，二次移植时复温后再注射，这样可以尽量减少吸脂手术次数，同时减少患者的时间成本和健康成本。
因此，急需开发一种冻存效率高的细胞冻存液，提高整形美容的效率。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明提供一种脂肪干细胞冻存液及其冻存方法，以解决上述的技术问题。
本发明是通过以上技术方案予以实现的：
一种脂肪干细胞冻存液，所述冻存液包括以下组分：DMEM培养液、F12培养液、二甲基亚砜(DMSO)、牛血清、羟乙基淀粉、人血清白蛋白和甘油；所述各组分的重量百分数如下：DMEM培养液30％-60％，F12培养液10％-30％，二甲基亚砜(DMSO)5％-15％，牛血清2％-8％，羟乙基淀粉1％-10％，人血清白蛋白2％-8％，甘油3％-10％。
优选地，所述各组分的重量百分数如下：DMEM培养液40％-60％，F12培养液20％-30％，二甲基亚砜(DMSO)10％-15％，牛血清4％-8％，羟乙基淀粉5％-10％，人血清白蛋白2％-6％，甘油5％-8％。
更优选地，所述各组分的重量百分数如下：DMEM培养液50％，F12培养液25％，二甲基亚砜(DMSO)12％，牛血清8％，羟乙基淀粉7％，人血清白蛋白5％，甘油6％。
优选地，所述牛血清为胎牛血清或小牛血清中的一种或两种。
一种利用以上所述的储存液冻存细胞的方法，包括以下步骤：
S1.将培养好的细胞悬液收集到15ml的离心管中，4℃，1000rpm，离心2-10min，上下加速度均调为0；
S2.去除上清液体部分，每个离心管分别加入2ml权利要求所述的冻存液，使用无菌吸头轻轻吸打，直至变成均匀的细胞悬液；
S3.去无菌的1.5ml离心管，每管加入500-800ul细胞悬液，每个样品冻存3管；
S4.第0-5h将冻存管置于-20℃冰箱中；
S5.第6-12h将冻存管置于-80℃冰箱中；
S6.第13h开始将冻存管置于-196℃的液氮罐中长期保存。
相对于现有技术，本发明的有益效果：
本发明的冻存液结合传统冻存液配制方法，在原有的基础上进行了改进，降低了二甲基亚砜的用量，新添加了羟乙基淀粉和细胞稳定剂。经过反复摸索，采用了甘油和人血清白蛋白混合液经不同比例混合后加到上述冷冻液中作为细胞稳定剂，经过对比试验，效果满意。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
一种脂肪干细胞冻存液，所述冻存液包括以下组分：DMEM培养液、F12培养液、二甲基亚砜(DMSO)、牛血清、羟乙基淀粉、人血清白蛋白和甘油；所述各组分的重量百分数如下：DMEM培养液30％-60％，F12培养液10％-30％，二甲基亚砜(DMSO)5％-15％，牛血清2％-8％，羟乙基淀粉1％-10％，人血清白蛋白2％-8％，甘油3％-10％。
优选地，所述各组分的重量百分数如下：DMEM培养液40％-60％，F12培养液20％-30％，二甲基亚砜(DMSO)10％-15％，牛血清4％-8％，羟乙基淀粉5％-10％，人血清白蛋白2％-6％，甘油5％-8％。
更优选地，所述各组分的重量百分数如下：DMEM培养液50％，F12培养液25％，二甲基亚砜(DMSO)12％，牛血清8％，羟乙基淀粉7％，人血清白蛋白5％，甘油6％。
优选地，所述牛血清为胎牛血清或小牛血清中的一种或两种。
冻存剂分为穿透性(二甲基亚砜、甘油)和非穿透性(海藻糖等)，其作用是降低细胞内冰晶的形成从而降低细胞损伤。二甲基亚砜(DMSO)发挥冻存作用较快，保护效果最佳，也最广泛应用于实验及临床中。冻存剂对生物组织和细胞均有一定的毒性作用，所以解冻后需要从冷冻保存的细胞或组织中快速移除。低温保护剂能明显保持冷冻脂肪颗粒活力，但不同冻存温度下其最适宜的低温保护剂有差异。
实施例2
一种利用以上所述的储存液冻存细胞的方法，包括以下步骤：
S1.将培养好的细胞悬液收集到15ml的离心管中，4℃，1000rpm，离心2-10min，上下加速度均调为0；
S2.去除上清液体部分，每个离心管分别加入2ml权利要求所述的冻存液，使用无菌吸头轻轻吸打，直至变成均匀的细胞悬液；
S3.去无菌的1.5ml离心管，每管加入500-800ul细胞悬液，每个样品冻存3管；
S4.第0-5h将冻存管置于-20℃冰箱中；
S5.第6-12h将冻存管置于-80℃冰箱中；
S6.第13h开始将冻存管置于-196℃的液氮罐中长期保存。
实施例3
脂肪干细胞冻存液A，所述各组分的重量百分数如下：DMEM培养液30％，F12培养液30％，二甲基亚砜(DMSO)15％，牛血清5％，羟乙基淀粉5％，人血清白蛋白8％，甘油10％。
脂肪干细胞冻存液B，所述各组分的重量百分数如下：DMEM培养液45％，F12培养液20％，二甲基亚砜(DMSO)5％，牛血清2％，羟乙基淀粉2％，人血清白蛋白2％，甘油3％。
脂肪干细胞冻存液B，所述各组分的重量百分数如下：DMEM培养液50％，F12培养液25％，二甲基亚砜(DMSO)12％，牛血清8％，羟乙基淀粉7％，人血清白蛋白5％，甘油6％。
实施例4
使用实施例3配制的3种不同的脂肪干细胞冻存液对相同的样本进行冻存，冻存后进行复苏，然后考察细胞的活性，包括细胞完整性，细胞拒染率。
1、细胞完整性
根据慢冻速融原则，取出冻存管后。样本从液氮罐取出，将其置于37℃水浴箱解冻，轻柔晃动(避免剧烈晃动，以免使细胞损伤)，待冻存液完全溶解后，及时吸除低温保护剂(混合物静置后分3层，上层为无形的液态脂滴，中层为淡黄色的颗粒脂肪，下层为冻存液)。用PBS缓冲液洗涤3次，洗去残余冻存液，加F12培养液，待用。
HE染色
(1)取复温后脂肪颗粒于离心管中，用多聚甲醛固定20min后，转移至10％蔗糖溶液于水平摇床震荡2～3h，转30％蔗糖震荡脱水8h；
(2)取脱水后脂肪颗粒适量，用OCT包埋于1X1cm包埋盒后快速冷冻，冰冻切片机调至适温后修片，每个标本取前、中、后3部分分别切片贴于防脱载玻片上，每张载玻片至少贴6个切片，于-80°冰箱进行保存待用；
(3)取冰冻切片，烤片后用PBS洗去包埋剂；
(4)苏木紫染细胞核核15min后，伊红染背景色5min；
(5)梯度酒精脱水后，二甲苯固定两遍；
(6)晾干后中性树脂封片，显微镜下观察。
HE染色后，在显微镜下观察细胞完整性，细胞完整性计算公式如下：
完整脂肪干细胞率＝完整脂肪干细胞/脂肪干细胞总数*100％
统计结果如表1所示：
表1HE染色完整脂肪干细胞百分比(％)
HE染色后，在40倍显微镜下可以看到脂肪细胞细胞轮廓完整。200倍下观察到各组脂肪细胞整体呈蜂窝状，体积稍小，细胞膜及细胞间质清晰、完整，脂滴在脱水、固定过程中被溶解呈空泡状，细胞核呈深紫色、扁圆形居于边缘，细胞近圆形，形态较统一。表1数据表明，各组的脂肪干细胞的完整率随着冻存时间的延长而递减，在1-30天期间递减比较缓慢，在冻存90天以后，细胞的完整性下降25％左右，但是3种冻存液配方的细胞，其细胞完整性均在70％以上，说明本发明的细胞冻存液比较适合脂肪干细胞冻存，并且在1-30天细胞的完整性较好。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.一种脂肪干细胞冻存液，其特征在于，所述冻存液包括以下组分：DMEM培养液、F12培养液、二甲基亚砜(DMSO)、牛血清、羟乙基淀粉、人血清白蛋白和甘油；所述各组分的重量百分数如下：DMEM培养液30％-60％，F12培养液10％-30％，二甲基亚砜(DMSO)5％-15％，牛血清2％-8％，羟乙基淀粉1％-10％，人血清白蛋白2％-8％，甘油3％-10％。
2.根据权利要求1所述的脂肪干细胞冻存液，其特征在于，所述各组分的重量百分数如下：DMEM培养液40％-60％，F12培养液20％-30％，二甲基亚砜(DMSO)10％-15％，牛血清4％-8％，羟乙基淀粉5％-10％，人血清白蛋白2％-6％，甘油5％-8％。
3.根据权利要求2所述的脂肪干细胞冻存液，其特征在于，所述各组分的重量百分数如下：DMEM培养液50％，F12培养液25％，二甲基亚砜(DMSO)12％，牛血清8％，羟乙基淀粉7％，人血清白蛋白5％，甘油6％。
4.根据权利要求3所述的脂肪干细胞冻存液，其特征在于，所述牛血清为胎牛血清或小牛血清中的一种或两种。
5.一种利用权利要求1所述的储存液冻存细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将培养好的细胞悬液收集到15ml的离心管中，4℃，1000rpm，离心2-10min，上下加速度均调为0；
S2.去除上清液体部分，每个离心管分别加入2ml权利要求所述的冻存液，使用无菌吸头轻轻吸打，直至变成均匀的细胞悬液；
S3.去无菌的1.5ml离心管，每管加入500-800ul细胞悬液，每个样品冻存3管；
S4.第0-5h将冻存管置于-20℃冰箱中；
S5.第6-12h将冻存管置于-80℃冰箱中；
S6.第13h开始将冻存管置于-196℃的液氮罐中长期保存。
CN201810540613.2A 2018-05-30 2018-05-30 一种脂肪干细胞冻存液及其冻存方法 Pending CN108739795A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810540613.2A CN108739795A (zh) 2018-05-30 2018-05-30 一种脂肪干细胞冻存液及其冻存方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810540613.2A CN108739795A (zh) 2018-05-30 2018-05-30 一种脂肪干细胞冻存液及其冻存方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108739795A true CN108739795A (zh) 2018-11-06

Family

ID=64004411

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810540613.2A Pending CN108739795A (zh) 2018-05-30 2018-05-30 一种脂肪干细胞冻存液及其冻存方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108739795A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107258766A (zh) * 2017-06-18 2017-10-20 广东博溪生物科技有限公司 一种细胞冻存方法及细胞冻存液
CN109662091A (zh) * 2019-03-01 2019-04-23 米楠 一种脂肪颗粒组织冻存液及其配制方法和冻存方法
CN109845726A (zh) * 2019-02-27 2019-06-07 李冲杰 一种间充质干细胞超低温冻存保护剂
CN110771599A (zh) * 2019-11-25 2020-02-11 深圳科学之门生物工程有限公司 一种干细胞的冷冻液及其冷冻方法
CN111990396A (zh) * 2020-09-09 2020-11-27 江苏育瑞康生物科技有限公司 一种用于间充质干细胞的冷冻液及制备方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101990888A (zh) * 2009-08-31 2011-03-30 深圳市北科生物科技有限公司 干细胞冻存液及干细胞的冻存方法
EP2721930A1 (en) * 2012-10-19 2014-04-23 Serumwerk Bernburg AG Solution for cryopreservation, method of manufacturing the same, and its use
CN103849597A (zh) * 2012-12-05 2014-06-11 上海坤爱生物科技有限公司 脂肪干细胞的规模化生产工艺
WO2016063208A1 (en) * 2014-10-20 2016-04-28 Stempeutics Research Pvt. Ltd. A cryopreservation composition and methods thereof
CN107027743A (zh) * 2017-06-14 2017-08-11 深圳市泰华细胞工程有限公司 细胞冻存液及细胞冻存方法
CN107258766A (zh) * 2017-06-18 2017-10-20 广东博溪生物科技有限公司 一种细胞冻存方法及细胞冻存液

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101990888A (zh) * 2009-08-31 2011-03-30 深圳市北科生物科技有限公司 干细胞冻存液及干细胞的冻存方法
EP2721930A1 (en) * 2012-10-19 2014-04-23 Serumwerk Bernburg AG Solution for cryopreservation, method of manufacturing the same, and its use
CN103849597A (zh) * 2012-12-05 2014-06-11 上海坤爱生物科技有限公司 脂肪干细胞的规模化生产工艺
WO2016063208A1 (en) * 2014-10-20 2016-04-28 Stempeutics Research Pvt. Ltd. A cryopreservation composition and methods thereof
CN107027743A (zh) * 2017-06-14 2017-08-11 深圳市泰华细胞工程有限公司 细胞冻存液及细胞冻存方法
CN107258766A (zh) * 2017-06-18 2017-10-20 广东博溪生物科技有限公司 一种细胞冻存方法及细胞冻存液

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
蔡绍京等编著: "《细胞生物学与医学遗传学实验指南》", 31 August 2002, 上海：第二军医大学出版社 *
郭云良等编著: "《神经生物学技术》", 31 January 2005, 青岛：中国海洋大学出版社 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107258766A (zh) * 2017-06-18 2017-10-20 广东博溪生物科技有限公司 一种细胞冻存方法及细胞冻存液
CN109845726A (zh) * 2019-02-27 2019-06-07 李冲杰 一种间充质干细胞超低温冻存保护剂
CN109662091A (zh) * 2019-03-01 2019-04-23 米楠 一种脂肪颗粒组织冻存液及其配制方法和冻存方法
CN109662091B (zh) * 2019-03-01 2021-04-13 米楠 一种脂肪颗粒组织冻存液及其配制方法和冻存方法
CN110771599A (zh) * 2019-11-25 2020-02-11 深圳科学之门生物工程有限公司 一种干细胞的冷冻液及其冷冻方法
CN111990396A (zh) * 2020-09-09 2020-11-27 江苏育瑞康生物科技有限公司 一种用于间充质干细胞的冷冻液及制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108739795A (zh) 一种脂肪干细胞冻存液及其冻存方法
AU2006329195B2 (en) Viable cells from frozen umbilical cord tissue
CN108617638B (zh) 组织和/或细胞冻存保护液及其制备与应用
ES2605160T3 (es) Medio de congelación libre de suero que comprende un alto contenido de KSR y el establecimiento de una librería de células madre derivadas de tejido adiposo
CN107006453A (zh) 一种脐带间充质干细胞冻存液及其使用方法
CN104145943A (zh) 一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液及其制备与应用
CN109744227A (zh) 一种细胞冻存液及其应用
CN104488853A (zh) 一种牛胚胎玻璃化冷冻甩管解冻和直接移植方法
EP2605644B1 (en) Method of forming vitrification droplets
Baust et al. Modulation of the cryopreservation cap: elevated survival with reduced dimethyl sulfoxide concentration
EP2271208A1 (en) Mehtod, system, and apparatus for hypothermic collection, storage, transport and banking of birth tissue
CN111789104B (zh) 一种冷冻保存液在干细胞冻存中的应用
KR20120117209A (ko) 줄기세포 동결보존액 및 이를 이용하는 줄기세포 동결보존방법
CN108184818A (zh) 一种人胎盘间充质干细胞悬液保护剂
CN107396918A (zh) 一种用于长期保存藏羊***的稀释液及其制备方法
CN113261557A (zh) 一种干细胞冻存液及干细胞冻存方法
Bui-Xuan-Nguyen et al. Direct freezing of cattle embryos after partial dehydration at room temperature
CN107232182A (zh) 一种骨髓间充质干细胞细胞冻存剂
CN105432597A (zh) 冷冻保存诱导多能干细胞的试剂盒及方法
CN104472474A (zh) 一种人脂肪间充质干细胞冻存液
CN107372469A (zh) 一种内皮祖细胞的冻存液及冻存方法
Yao et al. Hydrogel microencapsulation enhances cryopreservation of red blood cells with trehalose
CN108782544A (zh) 一种大量冻存间充质干细胞的冻存液及方法
CN108260586A (zh) 一种原代小鼠肝实质细胞的冻存方法
CN113907067B (zh) 一种过冷状态下无冰晶低温保存方法和复苏方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20181106