CN106596938B - 一种循环肿瘤细胞快速检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种循环肿瘤细胞快速检测试剂盒，组成包括：细胞密度梯度分离液、多孔隔膜分离管、5mL容积的离心管、表皮类肿瘤标志物抗体和间质类肿瘤标志物抗体。本试剂盒利用密度梯度离心法去除了血液中绝大多数的红细胞及白细胞背景干扰，同时对血液中的循环肿瘤细胞进行富集。之后使用以表皮类和间质类两大类共4种肿瘤标志物的荧光抗体对循环肿瘤细胞进行荧光标记，最后在通用的流式细胞仪中完成对循环肿瘤细胞检出并计数，本发明的试剂盒考虑到了肿瘤细胞的表皮间质转换过程，增加了捕获间质类的循环肿瘤细胞，增加了检测阳性符合率，精确度高，方便快速，成本较低且耗时较短，检测计数由流式细胞仪自动完成，重复性强。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤预后检测技术领域，具体涉及一种循环肿瘤细胞快速检测试剂盒。
背景技术
在我国，恶性肿瘤的发病率呈逐年上升趋势，现今已经成为严重影响人们健康的公共卫生问题。由于对肿瘤的生物学特性尚未完全明确，除了传统的影像学和病理学方法外，目前在临床上缺乏简单、快速、非入侵性地对肿瘤的手术或放化疗的预后进行评价的方法，以及对病人的复发和病情进展进行追踪的有效手段。
循环肿瘤细胞(CTCs)是恶性肿瘤原发灶或转移灶脱落进入外周血循环的肿瘤细胞，它具有肿瘤特异性抗原、基因特征等生物学特性，并且能在外周血中长期存活，它们是肿瘤组织远端转移的重要途径和细胞来源。循环肿瘤细胞的检测和分析是最近几年中肿瘤领域研究的一个热点问题，目前已经有大量的文献证明了肿瘤病人血液中的循环肿瘤细胞数量的多少和病人肿瘤恶性程度、病情进展以及预后的总生存期有着明确的相关性，并且证实血液中的循环肿瘤细胞和肿瘤原发病灶肿瘤组织在耐药性、突变位点等生物学特性方面存在较高的一致性。因此临床上循环肿瘤细胞的检测对明确转移过程、辅助诊断、监测疗效、指导个体化治疗、判断预后等方面具有重要的临床应用价值。同时这种体外诊断的方法简单快速并且对病人没有创伤，能够有效解决地肿瘤病人预后评价困难的问题。
循环肿瘤细胞在血液里是非常稀少的，5mL全血中有约十亿个红细胞(RBCs)和约五百万个白细胞(WBCs)，仅有数个到几十个循环肿瘤细胞。使得在如此大的背景下获得纯的循环肿瘤细胞具有极大的挑战。
大部分循环肿瘤细胞检测技术涉及去除RBCs的全血前处理，比如RBCs裂解液处理等，这样的处理会造成部分循环肿瘤细胞损失，并且往往存在分析过程复杂、效率低、特异性和灵敏度低等缺陷。目前，临床上应用的获得美国FDA和中国药监局批准的唯一的检测CTC的方法是强生公司的CellSearch方法，这是一种使用表皮细胞特异性蛋白作为肿瘤标志物，同时利用免疫磁珠的方法将循环肿瘤细胞富集并最后进行免疫荧光显微观察检测的一种半自动的循环肿瘤细胞计数方法。这种方法存在检测阳性符合率较低的问题。同时由于其***较为昂贵、单个检测样本成本较高、耗时较长，应用较为困难。因此，临床上迫切需要一种特异性灵敏度高、成本低且操作简单的循环肿瘤细胞检测技术。
发明内容
为了解决现有循环肿瘤细胞检测技术的缺陷，本发明提供了一种从外周血中同时提取循环肿瘤细胞检测试剂盒。
本发明的技术方案具体如下：
一种循环肿瘤细胞快速检测试剂盒，组成包括：
细胞密度梯度分离液；
多孔隔膜分离管；
5mL容积的离心管；
表皮类肿瘤标志物抗体；
间质类肿瘤标志物抗体。
本试剂盒利用密度梯度离心法去除了血液中绝大多数的红细胞及白细胞背景干扰，同时对血液中的循环肿瘤细胞进行富集。之后使用以表皮类和间质类两大类共4种肿瘤标志物的荧光抗体对循环肿瘤细胞进行荧光标记，最后在通用的流式细胞仪中完成对循环肿瘤细胞检出并计数，本发明的试剂盒考虑到了肿瘤细胞的表皮间质转换过程，增加了捕获间质类的循环肿瘤细胞，增加了检测阳性符合率，精确度高。
优选地，上述循环肿瘤细胞快速检测试剂盒，所述细胞密度梯度分离液为德国Geriner公司的产品Oncoquick肿瘤细胞密度梯度分离液。
优选地，上述循环肿瘤细胞快速检测试剂盒，所述表皮类肿瘤标志物为EpCAM、CK7和CK8。
优选地，上述循环肿瘤细胞快速检测试剂盒，所述表皮类肿瘤标志物抗体中CK7和CK8抗体为美国BD公司的产品Alexa 488MouseAnti-CK7/CK8。MouseAnti-CK7/CK8是一个抗体，能识别这两种抗原。
优选地，上述循环肿瘤细胞快速检测试剂盒，所述表皮类肿瘤标志物抗体中EpCAM抗体为美国BD公司的产品BB515MouseAnti-Human CD326抗体。
优选地，上述循环肿瘤细胞快速检测试剂盒，所述间质类肿瘤标志物为N-Cadherin。
优选地，上述循环肿瘤细胞快速检测试剂盒，所述间质类肿瘤标志物抗体为美国eBioscience公司的产品Anti-Human CD325(N-Cadherin)PE。
优选地，上述循环肿瘤细胞快速检测试剂盒，所述多孔隔膜分离管为武汉海吉力生物科技有限公司的产品：多孔隔膜分离管，容积为15ml。本离心管避免了加样时样本和离心介质的预混合，降低了由于离心机不稳定造成的污染，消除了取样时人为扰动造成试验结果干扰，提高了试验成功率和细胞回收率。
优选地，上述循环肿瘤细胞快速检测试剂盒，所述多孔隔膜分离管数量为10个。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.跟现有的CTC检测方法相比，本试剂盒需要的样品量少(本方法仅需5ml外周血，而Cell Search方法需要7.5ml)；操作简单，快速，易于临床人员掌握(本试剂盒仅需简单离心、孵育，单次共耗时不足90分钟，而世面上的其它技术一般耗时在2个半小时左右)，细胞计数由流式细胞自动完成，方便操作、结果客观。
2.本试剂盒单次检测成本低，并且可以适配市面上大多数型号的流式细胞仪，使用者无需单独购买仪器，降低了病人的负担。
3.市面上的绝大多数针对CTC的产品都要对细胞进行固定从而丧失了细胞的活性，而由本试剂盒富集检测出的CTC细胞保持了较好的细胞活性，可以用来进行进一步的下游分析，如：单细胞测序、细胞表面特异性抗原分析、肿瘤细胞药敏分析等。
4.本试剂盒灵敏度特异性较高，可以较好地实现对肿瘤发生的早期筛查、肿瘤复发预警、以及肿瘤治疗疗效评估等多种临床用途，为医生提供了用药和治疗的参考。
5.本试剂盒使用方法方便快速，成本较低且耗时较短，检测计数由流式细胞仪自动完成，精确度高、重复性强。为医生提供了一种可操作性较好的循环肿瘤细胞检测方法，填补了目前同类产品的空白。
附图说明
图1、实施例1试剂盒检测过程流程图；
图2、实施例2离心前后样本的状态变化；
图3、实施例3健康人和肿瘤病人外周血样本数据组成；
图4、实施例3正常人群和肿瘤病人人群检测结果比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：试剂盒组成及使用方法。
(1)试剂盒组份主要包括：
①Oncoquick肿瘤细胞密度梯度分离液4ml(Geriner，Germany)；
②15mL容积的多孔隔膜分离管10个(武汉海吉力生物科技有限公司)；
③5mL容积的离心管10个(Eppendorf，Germany)；
④488Mouse Anti-CK7/CK8(BD，USA)；
⑤BB515MouseAnti-Human CD326抗体(BD，USA)；
⑥Anti-Human CD325(N-Cadherin)PE(eBioscience，USA)。
(2)具体检测过程如下(参见图1、试剂盒检测过程流程图)：
①采血5mL全血EDTA抗凝(4度保存并预冷；24小时内检测)
②取5mL肿瘤患者外周血加入有分离液的离心管中，在1200g重力加速度上离心25分钟。离心后外周血分为血浆层和红细胞层，血浆层在分离液上面，红细胞层在分离液下面，肿瘤细胞处于血浆与分离液层界面上，取出约80％体积血浆单独保存(注意：不要吸到CTC细胞层，以免造成细胞的丢失)。
③取出分离管多孔隔膜上的目的细胞层以及分离液，加入到5ml离心管中与2mlPBS缓冲液混匀。
④200g重力加速度离心，去上清，将细胞沉淀用300μLPBS重悬。
⑤混匀细胞加入抗体混合物，避光孵育30分钟。
⑥流式细胞检测计数，检测时间约10分钟。
实施例2：健康人外周血掺入肿瘤细胞系的模拟样本的检测分析
本实施例是使用健康人外周血掺入梯度稀释的MCF-7细胞，并以此为模拟样本对其进行检测分析，以此来评价试剂盒的肿瘤细胞富集效率以及试剂盒的回收率等性能，具体详述如下：
1、样本制备
将培养皿中的MCF-7细胞消化并制成单细胞悬液，利用红细胞计数板将其计数，使用PBS将其稀释至合适浓度。向EDTA抗凝的5mL健康人外周血中添加不同浓度的MCF-7细胞，其浓度分别为800个/管、400个/管、100个/管、20个/管、5个/管、0个/管。每个浓度均设置5组重复。
2、样本检测
(1)将模拟血样轻柔颠倒数次混匀。
(2)取出预装了Oncoquick分离液的多孔隔膜分离管，使用前将快速分离管200g，离心1min，以保证离心液完全处于多孔隔膜的下层。
(3)向5mL的血液样本中加入500μL的PBS溶液，混匀，转移至分离管的隔膜上层，4℃，1600g，离心20min(设置离心机的加速度最大、减速度最低)。
(4)离心完成后，分离管中由上至下应分为四层。第一层为血浆层，第二层为含有目的细胞的离心液层，第三层为白细胞层，第四层为红细胞层(见附图2)。动作轻柔，去掉70％-80％淡黄色的血浆层，切忌枪头触碰目的细胞层(由于不同人血液中血浆所占的比例有所差异，可根据实际情况适当调整去掉的血浆体积)，取出隔膜上层剩余全部液体，置于5mL离心管中待用。
(5)向分离管加入1.5mL的PBS溶液，清洗分离管壁和隔膜上层，取出PBS清洗液与含有目的细胞的溶液混合，200g，离心10min，去除上清液，再加入300μL的PBS溶液重悬细胞。
(6)向细胞悬液中加入10μL抗体混合物(实施例1中的试剂盒成分④、⑤和⑥)，轻轻混匀，室温避光孵育30min。
(7)流式细胞仪上机检测，进行细胞计数。
其检测结果如下表1：
表1.平均回收率和回收率线性
线性回归方程为：Y＝0.918x-0.875(R2＝0.992)，平均回收率为：91.8％。
本实施例结果表明，本试剂盒对肿瘤细胞有较好的特异性地回收能力，在富集过程中能够有效去除血细胞的背景干扰，在低细胞浓度条件下线性良好。
实施例3：循环肿瘤细胞DNA单独样本提取分析
1、样本制备
选取100例健康人外周血、79例乳腺癌病人外周血、80例肺癌病人外周血、30其它原发位置肿瘤病人外周血为测试样本(附图3)。
2、样本检测：
实验过程如实施例2。
3、检测结果：参见附图4。
正常人群检测中位值为：1.8；
肿瘤病人人群检测中位值为：7.9；
两组之间存在显著性差异(P<0.0001)。
表2.肿瘤病人人群检测阳性符合率表
选择5为cutoff值时，由ROC曲线模型得出：灵敏度73.8％，特异性为91％。I期II期检测特异性53％；III期IV期检测特异性81％，总特异性为73.8％。
由以上的实验结果可以看出本试剂盒能够有效地分区肿瘤病人人群和正常人群，产品灵敏度高、特异性强，且对不同种类的肿瘤均有较好的检测效果。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (6)
1.一种循环肿瘤细胞快速检测试剂盒，其特征在于，组成包括：
细胞密度梯度分离液；
多孔隔膜分离管：武汉海吉力生物科技有限公司的产品多孔隔膜分离管，容积为15ml；
5mL容积的离心管；
表皮类肿瘤标志物抗体：EpCAM、CK7和CK8；
间质类肿瘤标志物抗体N-Cadherin。
2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞快速检测试剂盒，其特征在于，所述细胞密度梯度分离液为德国Geriner公司的产品Oncoquick肿瘤细胞密度梯度分离液。
3.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞快速检测试剂盒，其特征在于，所述表皮类肿瘤标志物抗体中CK7和CK8抗体为美国BD公司的产品Alexa 488 Mouse Anti-CK7/CK8。
4.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞快速检测试剂盒，其特征在于，所述表皮类肿瘤标志物抗体中EpCAM抗体为美国BD公司的产品BB515Mouse Anti-Human CD326抗体。
5.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞快速检测试剂盒，其特征在于，所述间质类肿瘤标志物抗体为美国eBioscience公司的产品Anti-Human CD325(N-Cadherin)PE。
6.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞快速检测试剂盒，其特征在于，所述多孔隔膜分离管数量为10个。
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