CN107513094B - 一种从甜茶中提取纯化齐墩果酸和熊果酸的工艺方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从甜茶中提取纯化齐墩果酸和熊果酸的工艺方法，包括采用无水乙醇超声波提取、抽滤；浓缩合并后的提取液得浸膏，所得的浸膏用氯仿溶解，浓缩回收氯仿后得褐色浸膏；浸膏用5%氢氧化钠碱溶酸沉、沉淀物用硅胶柱层析分离等方法得到高纯度的齐墩果酸和熊果酸，采用高效液相色谱法进行含量测定，齐墩果酸和熊果酸的纯度均在90%以上，齐墩果酸的得率在20mg/100g以上，熊果酸的得率在90mg/100g以上。本发明工艺方法，所需设备简单、操作方便、提取时间短、提取效率高、节能、节约原料、条件温和，不破坏活性组分等特点，为从天然植物中提取齐墩果酸及熊果酸提供了一种可行性来源，提高了甜茶的附加值，具有重要的应用价值和经济社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及植物有效成分提取纯化方法，具体是一种从甜茶中提取纯化齐墩果酸和熊果酸的工艺方法。
背景技术
广西甜茶（Rubus Suavissimus S.Lee）为蔷薇科悬钩子属，是广西特有的甜味植物，在民间常作茶饮用，含有甜茶素、黄酮、茶多酚等主要活性成分，具有清热止渴、补肾、降血压和治疗糖尿病等功效。文献报道通过提取分离及波谱学方法鉴定甜茶中含有齐墩果酸及熊果酸。现代研究表明齐墩果酸具有抗HIV、抗菌、抗癌、抗溃疡、治疗骨质疏松症等广泛的药理作用和生物活性，作为保肝药物已经用于临床。熊果酸具有抗肿瘤、护肝、心血管、糖尿病、抗炎、抗病毒等多种生物活性，在国内外受到了广泛的研究。齐墩果酸及熊果酸市场需求量大，人工合成较复杂，目前仍依赖从天然植物中提取得到。因此，对甜茶中齐墩果酸及熊果酸提取纯化工艺的研究具有重要的意义。经文献查阅，甜茶中齐墩果酸及熊果酸提取纯化工艺的研究未见报道。本发明采用超声波提取及硅胶柱层析分离方法对甜茶中齐墩果酸和熊果酸提取及纯化工艺进行研究，为甜茶的综合利用奠定基础。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种从甜茶中提取纯化齐墩果酸和熊果酸的工艺方法。
本发明提供的技术方案是：
一种从甜茶中提取纯化齐墩果酸和熊果酸的工艺方法，包括如下步骤：
（1）取甜茶样品捣碎，称取捣碎后的样品，加入其重量2～4倍量的无水乙醇在25～40℃下超声波提取10 ～20min，提取液抽滤；
再用乙醇洗涤抽滤后的残渣，再抽滤，抽滤液与第一次的提取液合并，浓缩合并后的提取液得浸膏，所得的浸膏用氯仿溶解，浓缩回收氯仿后得褐色浸膏；
（2）将步骤（1）得到的浸膏用5%氢氧化钠溶液煮沸，趁热抽滤，将滤液置于冰箱在5～10℃冷藏1h，抽滤，用水洗至中性；
抽滤后的残渣加水煮沸，用盐酸调至pH 为1～2，放冷析出，抽滤，用热水洗涤沉淀物；
将沉淀物用硅胶柱层析分离，用石油醚:氯仿=1:2洗脱，TLC检测，弃去洗脱液；再用氯仿:乙酸乙酯=18:1洗脱，每100mL收集一份，收集30份，TLC检测，合并5-15份，浓缩洗脱液得高纯度齐墩果酸样品；
合并17-30份，浓缩洗脱液得高纯度熊果酸样品；
将所得的齐墩果酸和熊果酸样品，分别在101℃～105℃下干燥至恒重；
（3）将步骤（2）纯化干燥后的齐墩果酸和熊果酸样品，采用高效液相色谱法进行含量测定，齐墩果酸和熊果酸的纯度均在90%以上，齐墩果酸的得率在20mg/100g以上，熊果酸的得率在90mg/100g以上。
本发明与公开号为CN 105348364 B的发明专利《一种从女贞子中提取齐墩果酸方法》及硕士毕业论文《广西甜茶叶的化学成分的研究》相比，具有一定的优点。《一种从女贞子中提取齐墩果酸方法》专利中超声波提取后采用D101大孔树脂分离洗脱进行粗纯化，再采用Sephadex LH-20凝胶柱进一步纯化，纯化过程操作复杂，耗时、耗试剂，且因与本发明原料不同，只能提取纯化齐墩果酸，未包括熊果酸。硕士毕业论文《广西甜茶叶的化学成分的研究》中采用氯仿加热回流方式提取齐墩果酸及熊果酸，提取时间长，能耗高，效率低。提取后未采用简单方法进行粗纯化，而用不同的有机溶剂混合洗脱体系反复采用硅胶柱层析进行分离纯化，同样操作复杂，耗时，且消耗大量有机溶剂，不经济环保。该法未对齐墩果酸及熊果酸的纯度及提取得率进行考核，纯化的齐墩果酸及熊果酸仅用于成分鉴定。本发明采用超声波进行提取，采用碱溶酸沉、水洗沉淀等简单方法进行粗纯化，通过硅胶柱层析分离分别得到高纯度的齐墩果酸及熊果酸，并对纯度及提取得率进行了研究，齐墩果酸及熊果酸的纯度均在90%以上，齐墩果酸的得率在20mg/100g以上，熊果酸的得率在90mg/100g以上。本发明工艺简单，操作方便、纯化过程简单，提取时间短、提取效率高、条件温和、不破坏活性组分，易于操作。
附图说明
图1为实施例齐墩果酸、熊果酸标准溶液的HPLC图；
图2为实施例纯化干燥后齐墩果酸样品的HPLC图；
图3为实施例纯化干燥后熊果酸样品的HPLC图。
图中，1.为齐墩果酸 2.为熊果酸。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明内容作进一步的阐述，但不作为对本发明的限定。
实施例1
从甜茶中提取纯化齐墩果酸和熊果酸的工艺方法，包括如下步骤：
（1）取甜茶样品用捣碎机捣碎，称取样品150g，加入其重量2倍量的无水乙醇在25℃下超声波提取10min，提取液抽滤；再用300 mL乙醇洗涤抽滤后的残渣1次，再抽滤，抽滤液与第一次的提取液合并，浓缩合并后的提取液得浸膏，所得的浸膏用30mL氯仿溶解，浓缩回收氯仿后得褐色浸膏；
（2）得到的浸膏加30mL5%氢氧化钠溶液煮沸10min，趁热抽滤，将滤液置于冰箱在中5～10℃冷藏1h，抽滤，用水洗至中性；抽滤后的残渣加30 mL水煮沸10min，用盐酸调至pH为1，放冷析出，抽滤，用热水洗涤沉淀物3次；将沉淀物用硅胶柱层析分离，用石油醚:氯仿=1:2洗脱1000mL，TLC检测，弃去洗脱液；再用氯仿:乙酸乙酯=18:1洗脱，每100mL收集一份，收集30份，TLC检测，合并5-15份，浓缩洗脱液得高纯度齐墩果酸样品；合并17-30份，浓缩洗脱液得高纯度熊果酸样品；将所得的齐墩果酸和熊果酸样品，分别在101℃下干燥至恒重；
（3）纯化干燥后的齐墩果酸和熊果酸样品，采用高效液相色谱法进行含量测定。
色谱条件如下：
色谱柱：赛默飞世尔Hypersil Gold C18（250 mm×4.6 mm，5 µm），流动相为甲醇-0.2%乙酸铵水溶液（83：17），流速：0.6 mL/min，柱温：30℃，检测波长：210 nm，进样体积：20µL，光谱扫描范围：190 nm～600 nm。
分别准确称取标准物质齐墩果酸0.1110 g，熊果酸0.0950 g置于50mL容量瓶中，用乙醇溶解并定容至刻度，浓度分别为2.220、1.900mg/mL。分别准确量取一定体积的该标准混合液用70%乙醇水（体积比）逐级稀释至不同浓度系列，齐墩果酸浓度为2.22、4.44、11.1、22.2、44.4、111 µg/mL，熊果酸浓度为1.90、3.80、9.50、19.0、38.0、95.0 µg/mL，绘制标准曲线。分别准确称取实施例1纯化干燥后的齐墩果酸和熊果酸样品各20mg，用无水乙醇溶解定容至25.0 mL，取该溶液用70%乙醇水稀释20倍后按照上述液相色谱条件进行测定，采用外标法以峰面积计算其纯度。
经检测，齐墩果酸、熊果酸的线性关系良好，齐墩果酸的纯度为93.3%，得率为23.3mg/100g；熊果酸的纯度为94.2%，得率为94.9mg/100g。
实施例2
从甜茶中提取纯化齐墩果酸和熊果酸的工艺方法，包括如下步骤：
（1）取甜茶样品用捣碎机捣碎，称取样品150g，加入3倍量重量的无水乙醇在35℃下超声波提取15min，提取液抽滤，再用300 mL乙醇洗涤抽滤后的残渣1次，再抽滤，抽滤液与第一次的提取液合并，浓缩合并后的提取液得浸膏，所得的浸膏用30mL氯仿溶解，浓缩回收氯仿后得褐色浸膏；
（2）得到的浸膏加30mL5%氢氧化钠溶液煮沸10min，趁热抽滤，将滤液置于冰箱在中5～10℃冷藏1h，抽滤，用水洗至中性；抽滤后的残渣加30 mL水加热煮沸10min，用盐酸调至pH 为2，放冷析出，抽滤，用热水洗涤沉淀物3次；将沉淀物用硅胶柱层析分离，用石油醚:氯仿=1:2洗脱1000mL，TLC检测，弃去洗脱液；再用氯仿:乙酸乙酯=18:1洗脱，每100mL收集一份，收集30份，TLC检测，合并5-15份，浓缩洗脱液得高纯度齐墩果酸样品；合并17-30份，浓缩洗脱液得高纯度熊果酸样品；将所得的齐墩果酸和熊果酸样品，分别在103℃下干燥至恒重；
（3）纯化干燥后的齐墩果酸和熊果酸样品，按照实施例1中的高效液相色谱法进行含量测定。
经检测，齐墩果酸的纯度为93.1%，得率为24.1mg/100g；熊果酸的纯度为94.1%，得率为94.0mg/100g。
实施例3
从甜茶中提取纯化齐墩果酸和熊果酸的工艺方法，包括如下步骤：
（1）取甜茶样品用捣碎机捣碎，称取样品150g，加入4倍量重量的无水乙醇在40℃下超声波提取20min，提取液抽滤，再用300 mL乙醇洗涤抽滤后的残渣1次，再抽滤，抽滤液与第一次的提取液合并，浓缩合并后的提取液得浸膏，所得的浸膏用30mL氯仿溶解，浓缩回收氯仿后得褐色浸膏；·
（2）得到的浸膏加30mL5%氢氧化钠溶液煮沸10min，趁热抽滤，将滤液置于冰箱在中5～10℃冷藏1h，抽滤，用水洗至中性；抽滤后的残渣加30 mL水加热煮沸10min，用盐酸调至pH 为2，放冷析出，抽滤，用热水洗涤沉淀物3次；将沉淀物用硅胶柱层析分离，用石油醚:氯仿=1:2洗脱1000mL，TLC检测，弃去洗脱液；再用氯仿:乙酸乙酯=18:1洗脱，每100mL收集一份，收集30份，TLC检测，合并5-15份，浓缩洗脱液得高纯度齐墩果酸样品；合并17-30份，浓缩洗脱液得高纯度熊果酸样品；将所得的齐墩果酸和熊果酸样品，分别在1在105℃下干燥至恒重；
（3）纯化干燥后的齐墩果酸和熊果酸样品，按照实施例1中的高效液相色谱法进行含量测定。
经检测，齐墩果酸的纯度为93.0%，得率为22.8mg/100g；熊果酸的纯度为94.4%，得率为93.6mg/100g。
Claims (1)
1.一种从甜茶中提取纯化齐墩果酸和熊果酸的工艺方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取甜茶样品捣碎，称取捣碎后的样品，加入其重量2～4倍量的无水乙醇在25～40℃下超声波提取10 ～20min，提取液抽滤；
再用乙醇洗涤抽滤后的残渣，再抽滤，抽滤液与第一次的提取液合并，浓缩合并后的提取液得浸膏，所得的浸膏用氯仿溶解，浓缩回收氯仿后得褐色浸膏；
（2）将步骤（1）得到的浸膏用5%氢氧化钠溶液煮沸，趁热抽滤，将滤液置于冰箱在5～10℃冷藏1h，抽滤，用水洗至中性；
抽滤后的残渣加水煮沸，用盐酸调至pH 为1～2，放冷析出，抽滤，用热水洗涤沉淀物；
将沉淀物用硅胶柱层析分离，用石油醚:氯仿=1:2洗脱，TLC检测，弃去洗脱液；再用氯仿:乙酸乙酯=18:1洗脱，每100mL收集一份，收集30份，TLC检测，合并5-15份，浓缩洗脱液得齐墩果酸样品；
合并17-30份，浓缩洗脱液得熊果酸样品；
将所得的齐墩果酸和熊果酸样品，分别在101℃～105℃下干燥至恒重；
（3）将步骤（2）纯化干燥后的齐墩果酸和熊果酸样品，采用高效液相色谱法进行含量测定，齐墩果酸和熊果酸的纯度均在90%以上，齐墩果酸的得率在20mg/100g以上，熊果酸的得率在90mg/100g以上。
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| 广西甜茶叶的化学成分研究;谭冬明;《广西师范大学硕士学位论文》;20111215;全文 |
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| 甜茶果实化学成分的研究;罗达伟;《广西师范大学硕士学位论文》;20110115;全文 |
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