CN107474108B - Suc-Ile-Glu(γ-Pip)-Gly-Arg-pNA·HCl的制备方法 - Google Patents

Suc-Ile-Glu(γ-Pip)-Gly-Arg-pNA·HCl的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于多肽合成领域，具体涉及Suc‑Ile‑Glu(γ‑Pip)‑Gly‑Arg‑pNA·HCl的制备方法。该方法采用双烯丙氧羰基(bis‑Alloc)对精氨酸的胍基进行保护，从而使其不受酸碱的影响；先将对苯二胺连接在氨基酸上，然后再以过氧化氢和三氟乙酸酐对其氧化，从而提高了对硝基苯胺与氨基酸缩合的收率、安全性和环保性。对各氨基酸采用适宜的保护基，从而提高了反应过程的稳定性。本发明提供的方法具有工艺环保、安全、收率高、制备成本相对较低等优点，适合于大批量制备。

Description

Suc-Ile-Glu(γ-Pip)-Gly-Arg-pNA·HCl的制备方法
技术领域
本发明属于多肽合成领域，具体涉及Suc-Ile-Glu(γ-Pip)-Gly-Arg-pNA·HCl的制备方法。
背景技术
Suc-Ile-Glu(γ-piperidyl)-Gly-Arg-pNA·HCl是一种人工合成可以被活化X因子(factor Xa)催化水解的多肽化合物，其简称为S-2732，常作为发色底物。该底物可用于凝血因子Xa和肝素抗Xa活性的定量检测，因此其在科研和临床上都有着广泛的用途。
现有文献未发现有关S-2732合成的报道，查阅其他相关的合成文献，可以发现将发色基团对硝基苯胺连接到氨基酸上是S-2732合成的关键点之一。这是因为对硝基苯胺上的硝基具有强吸电子作用，导致对硝基苯胺的亲核性非常差，通过一般的酰胺缩合方法，其产物收率往往很低。为了解决这一难题，有研究采用三氯氧磷作为缩合剂，将对硝基苯胺高效率地连接到氨基酸上。但是这种方法有着自身的缺陷：一是对硝基苯胺的毒性很大，在使用过程中对人体或者环境具有重大安全隐患；二是所用的缩合剂三氯氧磷的毒性也很大，这显然对大批量生产产生不利的影响。
精氨酸的胍基具有强亲核性和碱性，在多肽合成中须加以保护。从现在文献中可以找到的许多胍基保护基团：叔丁氧羰基、硝基、甲苯磺酰基、三氟乙酰基、苄氧甲酰基保护以及固相合成中使用较多的苯磺酰基类等。精氨酸具有多个活性基团，因此需要多个保护基团。但上面提到的保护基团都具有在酸性或者碱性条件下脱除的性质，这显然是不利于多肽合成。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供发色底物S-2732的制备方法，本发明提供的方法收率高，纯度大。
本发明提供的Suc-Ile-Glu(γ-Pip)-Gly-Arg-pNA·HCl的制备方法包括：
过氧化氢、三氟乙酸酐与Fmoc-Arg(Alloc)2-pPDA反应，制得Fmoc-Arg(Alloc)2-pNA；
Fmoc-Arg(Alloc)2-pNA依次与Gly、Ile-Glu(γ-pip)和琥珀酸酐缩合后，经脱保护、成盐制得Suc-Ile-Glu(γ-Pip)-Gly-Arg-pNA·HCl。
本发明实施例中，所述过氧化氢和三氟乙酸酐与Fmoc-Arg(Alloc)2-pPDA的摩尔比为(5～6)：(6～7)：(1～1.5)。
本发明实施例中，所述反应的溶剂为二氯甲烷，所述过氧化氢为质量分数为90％的过氧化氢水溶液；所述反应具体包括：过氧化氢与三氟乙酸酐在冰浴的二氯甲烷中混合，室温搅拌30min后，滴加Fmoc-Arg(Alloc)2-pPDA的二氯甲烷溶液，加热回流1h。
由于硝基的强吸电子作用，亲核性非常差，一般的酰胺键合成方法很难缩合成功。同时对硝基苯胺属于高毒性物质，不利于生产和制备。本发明先将对苯二胺连接在氨基酸上，然后再对其氧化，从而将发色基团对硝基苯胺连接到精氨酸上，这种缩合方式比较环保、安全，收率在80％以上。
本发明实施例中，所述Fmoc-Arg(Alloc)2-pPDA的制备方法为将Fmoc-Arg(Alloc)2-OH以HOBt、DIEA和EDCI活化后，与对苯二胺室温反应8～12h。
本发明实施例中，所述Gly的氨基采用Fmoc保护；Fmoc-Arg(Alloc)2-pNA与Gly的缩合包括：脱除Fmoc-Arg(Alloc)2-pNA的Fmoc保护，以HOBt、DIEA和EDCI活化后，添加Fmoc-Gly-OH于-5～0℃反应1h；然后室温反应12～16h；制得Fmoc-Gly-Arg(Alloc)2-pNA。
本发明实施例中，所述Ile-Glu(γ-pip)中Ile的氨基采用Fmoc保护，Glu的羧基采用tBu保护；所述与Ile-Glu(γ-pip)缩合包括：H-Gly-Arg(Alloc)2-pNA与Fmoc-Ile-Glu(γ-pip)-OH混合，以HOBt、DIEA和EDCI活化后，于-5～0℃反应1h；然后室温反应12～16h，制得Fmoc-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg(Alloc)2-pNA。
本发明实施例中，所述Fmoc-Ile-Glu(γ-pip)-OH的制备方法为：
将Fmoc-Glu-OtBu在HOBt、DIEA和EDCI存在条件下与哌啶于-5～0℃反应1h；然后室温反应12～16h，制得Fmoc-Glu(γ-pip)-OtBu；
Fmoc-Glu(γ-pip)-OtBu脱除Fmoc保护后，在HOBt、DIEA和EDCI存在条件下与Fmoc-Ile-OH于-5～0℃反应1h；然后室温反应12～16h，再脱除OtBu保护基，制得Fmoc-Ile-Glu(γ-pip)-OH。
本发明实施例中，所述与琥珀酸酐缩合包括：以1,4-二氧六环为溶液，H-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg(Alloc)2-pNA与琥珀酰酐混合，冰浴30min后，升温至室温，搅拌反应1h，制得Suc-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg(Alloc)2-pNA。
精氨酸胍基的保护是必要的，而且胍基的保护基团很多。本发明精氨酸胍基采用双烯丙氧羰基(bis-Alloc)进行保护，最后使用钯催化脱去。由于采用的烯丙氧羰基作为精氨酸胍基保护基，使其不受酸碱的影响，从而有利于获得较高的产率。
本发明实施例中，所述脱保护为在Pd(PPh3)4催化下，脱除Arg的胍基保护基。
本发明实施例中，所述成盐采用浓度为6mol/L的HCl的乙酸乙酯溶液，5～10℃下反应2～3h。
本发明提供的S-2732的制备方法中，采用双烯丙氧羰基(bis-Alloc)对精氨酸的胍基进行保护，从而使其不受酸碱的影响；先将对苯二胺连接在氨基酸上，然后再以过氧化氢和三氟乙酸酐对其氧化，从而提高了缩合的收率、安全性和环保性。对各氨基酸采用适宜的保护基，从而提高了反应过程的稳定性。因此，本发明本发明与现有技术相比，制备环保、安全和收率高，制备成本相对较低，适合实验室大批量制备。
附图说明
图1示本发明制得S-2732的氢谱。
具体实施方式
本发明提供了发色底物S-2732的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明中，如无特殊说明，室温指18～30℃，冰浴指0～4℃。
本发明提供的S-2732的制备方法包括：
过氧化氢、三氟乙酸酐与Fmoc-Arg(Alloc)2-pPDA反应，制得Fmoc-Arg(Alloc)2-pNA；
Fmoc-Arg(Alloc)2-pNA依次与Gly、Ile-Glu(γ-pip)和琥珀酸酐缩合后，经脱保护、成盐制得S-2732。
本发明实施例中，所述过氧化氢和三氟乙酸酐与Fmoc-Arg(Alloc)2-pPDA的摩尔比为(5～6)：(6～7)：(1～1.5)。
一些实施例中，所述过氧化氢和三氟乙酸酐与Fmoc-Arg(Alloc)2-pPDA的摩尔比为0.52：0.62：0.129。
本发明实施例中，过氧化氢、三氟乙酸酐与Fmoc-Arg(Alloc)2-pPDA反应的溶剂为二氯甲烷，所述过氧化氢为质量分数为90％的过氧化氢水溶液；所述反应具体包括：过氧化氢与三氟乙酸酐在冰浴的二氯甲烷中混合，室温搅拌30min后，滴加Fmoc-Arg(Alloc)2-pPDA的二氯甲烷溶液，加热回流1h。反应结束后，向反应液中加入冷水，然后再以二氯甲烷萃取。有机层依次用饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤。无水Na2SO4干燥，旋干，硅胶柱纯化，制得Fmoc-Arg(Alloc)2-pNA。
由于硝基的强吸电子作用，亲核性非常差，一般的酰胺键合成方法很难缩合成功。同时对硝基苯胺属于高毒性物质，不利于生产和制备。本发明先将对苯二胺连接在氨基酸上，然后再对其氧化，从而将发色基团对硝基苯胺连接到精氨酸上，这种缩合方式比较环保、安全，收率在80％以上。
本发明实施例中，除琥珀酸酐缩合步骤，其他缩合反应采用碳二亚胺型缩合试剂。具体的，缩合试剂为HOBt、DIEA和EDCI的混合物，其中HOBt、DIEA和EDCI的摩尔比为1：1：1。对琥珀酸酐的缩合时，琥珀酸酐与异亮氨酸氨基直接缩合，不需要使用缩合剂，也能得到很高的产率。
本发明实施例中，所述Fmoc-Arg(Alloc)2-pPDA的制备方法为将Fmoc-Arg(Alloc)2-OH以HOBt、DIEA和EDCI活化后，与对苯二胺室温反应8～12h。
Arg的胍基采用双烯丙氧羰基(bis-Alloc)作为保护基团，并在完成琥珀酸酐的缩合后用钯催化脱去。Arg的氨基采用9-芴甲氧羰基(Fmoc)作为保护基团，并在完成保护后，以碱脱去。
Fmoc-Arg(Alloc)2-pPDA的制备以Fmoc-Arg(Alloc)2-OH为原料，以二氯甲烷为溶液，氮气保护下反应。Fmoc-Arg(Alloc)2-OH与对苯二胺的摩尔比为1:4。所述活化的温度为室温，时间为30min。将活化好的Fmoc-Arg(Alloc)2-OH滴加入对苯二胺的二氯甲烷溶液(浓度为1.13mol/L)中，反应结束后，往反应液加饱和食盐水，然后用二氯甲烷萃取。有机层依次用10％柠檬酸、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤。无水Na2SO4干燥，旋干，硅胶柱纯化，得到Fmoc-Arg(Alloc)2-pPDA。
本发明实施例中，所述Gly的氨基采用Fmoc保护；Fmoc-Arg(Alloc)2-pNA与Gly的缩合包括：脱除Fmoc-Arg(Alloc)2-pNA的Fmoc保护，以HOBt、DIEA和EDCI活化后，添加Fmoc-Gly-OH于-5～0℃反应1h；然后室温反应12～16h；制得Fmoc-Gly-Arg(Alloc)2-pNA。
脱除Fmoc-Arg(Alloc)2-pNA的Fmoc保护采用碱脱除，具体的Fmoc-Arg(Alloc)2-pNA溶解于DMF后，与哌啶于15℃～25℃反应20～30min。反应结束，向反应液加水，然后用二氯甲烷萃取。去除哌啶后有机层经无水硫酸钠干燥后30℃以下旋干，得到固体。将固体捣碎，加入石油醚(沸程：60-90℃)，搅拌2～3h。过滤，滤饼用石油醚(沸程：60～90℃)漂洗后抽干。将滤饼捣碎后重新投入单口瓶，加入石油醚(沸程：60～90℃)，室温下搅拌过夜。过滤，滤饼用石油醚(沸程：60～90℃)漂洗后抽干。晾干后得到H-Arg(Alloc)2-pNA。
H-Arg(Alloc)2-pNA与Fmoc-Gly-OH缩合反应的摩尔比为1:1。反应完全后向反应液加水，然后再以二氯甲烷萃取。所得有机层依次用水、10％柠檬酸、饱和NaHCO3洗、饱和食盐洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥后30℃以下旋干，得到Fmoc-Gly-Arg(Alloc)2-pNA。
本发明实施例中，所述Ile-Glu(γ-pip)中Ile的氨基采用Fmoc保护，Glu的羧基采用tBu保护；所述与Ile-Glu(γ-pip)缩合包括：H-Gly-Arg(Alloc)2-pNA与Fmoc-Ile-Glu(γ-pip)-OH混合，以HOBt、DIEA和EDCI活化后，于-5～0℃反应1h；然后室温反应12～16h，制得Fmoc-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg(Alloc)2-pNA。缩合反应的溶剂为二氯甲烷。H-Gly-Arg(Alloc)2-pNA与Fmoc-Ile-Glu(γ-pip)-OH的摩尔比为1：1。反应完全后，往反应液加水，然后再加入二氯甲烷萃取。所得有机层依次用水、10％柠檬酸、饱和NaHCO3、饱和食盐水洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥后30℃以下旋干，得到Fmoc-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg(Alloc)2-pNA。
本发明实施例中，所述Fmoc-Ile-Glu(γ-pip)-OH的制备方法为：
将Fmoc-Glu-OtBu在HOBt、DIEA和EDCI存在条件下与哌啶于-5～0℃反应1h；然后室温反应12～16h，制得Fmoc-Glu(γ-pip)-OtBu；
Fmoc-Glu(γ-pip)-OtBu脱除Fmoc保护后，在HOBt、DIEA和EDCI存在条件下与Fmoc-Ile-OH于-5～0℃反应1h；然后室温反应12～16h，再脱除OtBu保护基，制得Fmoc-Ile-Glu(γ-pip)-OH。
一些实施例中，HOBt、DIEA和EDCI的摩尔比为1：1：1，哌啶与DMF的体积比为1:5。与哌啶缩合后，往反应液加水，然后再加入二氯甲烷萃取。所得有机层依次用水、10％柠檬酸、饱和NaHCO3洗、饱和食盐洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥后30℃以下旋干，得到Fmoc-Glu(γ-pip)-OtBu。
Fmoc-Glu(γ-pip)-OtBu脱除Fmoc保护采用碱脱除，具体的Fmoc-Glu(γ-pip)-OtBu溶解于DMF后，与哌啶于15℃～25℃反应20～30min。反应结束，向反应液加水，然后用二氯甲烷萃取。去除哌啶后有机层经无水硫酸钠干燥后30℃以下旋干，得到固体过硅胶柱纯化，得到H-Glu(γ-pip)-OtBu。
H-Glu(γ-pip)-OtBu与Fmoc-Ile-OH缩合反应中，H-Glu(γ-pip)-OtBu与Fmoc-Ile-OH的摩尔比为1：1，HOBt、DIEA和EDCI的摩尔比为1：1：1，Fmoc-Ile-OH与EDCI的摩尔比为1：1.5。反应完全后，向反应液加水，然后以二氯甲烷萃取。所得有机层依次用水、10％柠檬酸、饱和NaHCO3、饱和食盐洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥后30℃以下旋干，所得物质经过硅胶柱纯化，得到Fmoc-Ile-Glu(γ-pip)-OtBu。
脱除OtBu保护基采用酸脱除，具体的，用三氟乙酸脱除OtBu保护。
本发明实施例中，所述与琥珀酸酐缩合包括：以1,4-二氧六环为溶液，H-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg(Alloc)2-pNA与琥珀酰酐混合，冰浴30min后，升温至室温，搅拌反应1h，制得Suc-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg(Alloc)2-pNA。所述H-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg(Alloc)2-pNA与琥珀酰酐的摩尔比为1:1.09。反应完成后，在低于30℃条件下减压旋干溶剂，再用二氯甲烷萃取，有机相经无水硫酸钠干燥后旋干得到Suc-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg(Alloc)2-pNA。
精氨酸胍基的保护是必要的，而且胍基的保护基团很多。本发明精氨酸胍基采用双烯丙氧羰基(bis-Alloc)进行保护，最后使用钯催化脱去。由于采用的烯丙氧羰基作为精氨酸胍基保护基，使其不受酸碱的影响，从而有利于获得较高的产率。本发明实施例中，所述脱保护为在Pd(PPh3)4催化下，脱除Arg的胍基保护。所述脱保护具体的包括：将Suc-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg(Alloc)2-pNA与1,3-二甲基巴比妥酸、四氢呋喃、Pd(PPh3)4在氩气保护、常温条件下搅拌2h。反应完成后，加入饱和的NaHCO3，并用***萃取，有机层经无水硫酸钠干燥后旋干，过硅胶柱纯化，得到Suc-Ile-Glu(γ-piperidyl)-Gly-Arg-pNA。
本发明实施例中，所述成盐采用浓度为6mol/L的HCl的乙酸乙酯溶液，5～10℃下反应2～3h。Suc-Ile-Glu(γ-piperidyl)-Gly-Arg-pNA与浓度为6mol/L的HCl的乙酸乙酯溶液反应。Suc-Ile-Glu(γ-piperidyl)-Gly-Arg-pNA与HCl的摩尔比为1:46。反应完全后，反应液在30℃条件以下旋干，加入乙酸乙酯，搅拌1h。过滤，滤饼用乙酸乙酯漂洗后抽干，所得物质通过Sephadex G-15纯化，用1％醋酸溶液洗脱，收集组分冻干，得到Suc-Ile-Glu(γ-piperidyl)-Gly-Arg-pNA·HCl
本发明提供的S-2732的制备方法中，采用双烯丙氧羰基(bis-Alloc)对精氨酸的胍基进行保护，从而使其不受酸碱的影响；先将对苯二胺连接在氨基酸上，然后再以过氧化氢和三氟乙酸酐对其氧化，从而提高了缩合的收率。对各氨基酸采用适宜的保护基，从而提高了反应过程的稳定性。故而，本申请提供的制备方法具有较高的收率和纯度，经验证，总收率可达39.3％；纯度可达96％。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例
一、Fmoc-Glu(γ-pip)-OtBu
往干燥的500mL三口烧瓶中加入Fmoc-Glu-OtBu(48.0g,112.9mmol)、HOBt(22.9g,169.6mmol)、二氯甲烷(200mL)和DIEA(28.0mL,169.6mmol)、哌啶(13.4mL,135.6mmol)，氮气置换气3次，原料溶解后降温至-5℃。氮气保护，快速加入EDCI(32.5g,169.6mmol)，加完后在-5～0℃反应1h，然后自然升至室温，反应12～16h。反应完全后，往反应液加150mL水，然后再加入200mL二氯甲烷萃取。所得有机层依次用水、10％柠檬酸、饱和NaHCO3洗、饱和食盐洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥后30℃以下旋干，得到透明液体52.9g。
二、H-Glu(γ-pip)-OtBu
往干燥的500mL单口烧瓶中加入化合物Fmoc-Glu(γ-pip)-OtBu(52.9g,107.3mmol)和DMF(265mL)。原料溶解后加入哌啶(53mL)，15～25℃下反应20～30min。反应完全后，将反应液加入1500mL水中，然后用1500mL二氯甲烷萃取。所得有机层多次水洗，至哌啶基本上被洗净。有机层经无水硫酸钠干燥后30℃以下旋干，得到浅黄色固体。过硅胶柱纯化，得到淡黄色液体28.0g，实验一和二的总收率91.7％。
收率计算公式：
收率＝产物H-Glu(γ-pip)-OtBu摩尔数/原料Fmoc-Glu-OtBu摩尔数×100％。
三、Fmoc-Ile-Glu(γ-pip)-OtBu
往干燥的1000mL三口烧瓶中加入化合物H-Glu(γ-pip)-OtBu(28.0g,103.6mmol)、Fmoc-Ile-OH(36.6g,103.6mmol)、HOBt(21.0g,145.4mmol)、二氯甲烷(500mL)和DIEA(25mL,145.4mmol)，氮气置换气3次，原料溶解后降温至-5℃。加入EDCI(30.0g,145.4mmol)，加完后在-5～0℃反应1h，然后自然升至室温，反应12～16h。反应完全后，往反应液加1500mL水，然后再加入400mL二氯甲烷萃取。所得有机层依次用水、10％柠檬酸、饱和NaHCO3、饱和食盐洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥后30℃以下旋干，得到浅黄色固体99.0g。过硅胶柱纯化，得到微黄色固体52.0g，收率：83.0％。
收率计算公式：
收率＝产物Fmoc-Ile-Glu(γ-pip)-OtBu摩尔数/原料H-Glu(γ-pip)-OtBu摩尔数×100％。
四、Fmoc-Ile-Glu(γ-pip)-OH
往干燥的500mL单口烧瓶中加入化合物Fmoc-Ile-Glu(γ-pip)-OtBu(52.0g，85.8mmol)和二氯甲烷(104mL)，溶解后，5℃时加入三氟乙酸(104mL)，15-25℃搅拌6h。反应完全后，将反应液减压旋干得到红色粘稠液体106.1g，加入二氯甲烷溶解，饱和食盐水洗涤，有机相经无水Na2SO4干燥后，旋干得类白色固体50.0g。把固体捣碎，加入180mL石油醚搅拌4h，过滤，用石油醚洗涤滤饼；滤饼捣碎，再加入180mL石油醚搅拌过夜，烘干后得到类白色粉状固体45.9g，收率97.3％。
收率计算公式：
收率＝产物Fmoc-Ile-Glu(γ-pip)-OH摩尔数/原料Fmoc-Ile-Glu(γ-pip)-OtBu摩尔数×100％。
五、Fmoc-Arg(Alloc)2-pPDA
往干燥的500mL三口烧瓶中加入化合物Fmoc-Arg(Alloc)2-OH(80.0g,141.7mmol)、HOBt(28.7g,212.5mmol)、二氯甲烷(300mL)和DIEA(35mL,212.5mmol)，再加入EDCI(40.7g,212.5mmol)氮气置换气3次，常温下活化30min。接着往干燥的2000mL三口烧瓶中加入化合物对苯二胺(61g,566.8mmol)、二氯甲烷(500mL)。搅拌均匀后，将活化好的Fmoc-Arg(Alloc)2-OH溶解逐滴滴加到对苯二胺溶液中，滴加完成后，保持常温、反应过夜。反应完成后，往反应液加饱和食盐水，然后用二氯甲烷萃取。有机层依次用10％柠檬酸、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤。无水Na2SO4干燥，旋干，硅胶柱纯化，得到固体类白色固体84.6g，收率91.2％。
收率计算公式：
收率＝产物Fmoc-Arg(Alloc)2-pPDA摩尔数/原料Fmoc-Arg(Alloc)2-OH摩尔数×100％。
六、Fmoc-Arg(Alloc)2-pNA
往干燥的2000mL三口烧瓶中加入二氯甲烷300mL，90％过氧化氢(14.0mL，516.8mmol)。然后将烧瓶放置在冰浴中降温，等温度稳定后开始搅拌，然后加入三氟乙酸酐(86.2mL，620.2mmol)。添加完成后，将烧瓶从冰浴中移除，并在室温条件下搅拌30min。接着将Fmoc-Arg(Alloc)2-pPDA(84.6g,129.2mmol)溶解在800mL二氯甲烷中，并逐滴滴加到前面制备的溶液中。滴加完成后，在烧瓶上方***回流装置，并加热回流1h。反应完成后，向反应液中加入冷水(300mL)。然后再加600mL二氯甲烷萃取。有机层依次用饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤。无水Na2SO4干燥，旋干，硅胶柱纯化，得到微黄色固体79.2g，收率89.5％。
收率计算公式：
收率＝产物Fmoc-Arg(Alloc)2-pNA摩尔数/原料Fmoc-Arg(Alloc)2-pPDA摩尔数×100％。
七、H-Arg(Alloc)2-pNA
往干燥的1000mL单口烧瓶中加入Fmoc-Arg(Alloc)2-pNA(79.2g，115.6mmol)和DMF(400mL)。原料溶解后加入哌啶(80mL)，15～25℃下反应20～30min。反应完全后，往反应液加800mL水，然后用500mL二氯甲烷萃取。所得有机层多次水洗，至哌啶基本上被洗净(TLC检测)。有机层经无水硫酸钠干燥后30℃以下旋干，得到固体。将固体捣碎，加入800mL石油醚(沸程：60-90℃)，搅拌2～3h。过滤，滤饼用石油醚(沸程：60-90℃)漂洗后抽干。将滤饼捣碎后重新投入单口瓶，加入800mL石油醚(沸程：60-90℃)，室温下搅拌过夜。过滤，滤饼用石油醚(沸程：60-90℃)漂洗后抽干。晾干后得到类白色固体45.5g，分离收率85.0％。
收率计算公式：
收率＝产物H-Arg(Alloc)2-pNA摩尔数/原料Fmoc-Arg(Alloc)2-pNA摩尔数×100％。
八、Fmoc-Gly-Arg(Alloc)2-pNA
往干燥的1000mL三口烧瓶中加入H-Arg(Alloc)2-pNA(45.5g,98.4mmol)、Fmoc-Gly-OH(29.3g,98.4mmol)、HOBt(20.0g,147.6mmol)、二氯甲烷(500mL)和DIEA(19.1g,147.6mmol)，氮气置换气3次，原料溶解后降温至-5℃。氮气保护，加入EDCI(28.3g,147.6mmol)，加完后在-5～0℃反应1h，然后自然升至室温，反应12～16h。反应完全后，往反应液加1000mL水，然后再加入500mL二氯甲烷萃取。所得有机层依次用水、10％柠檬酸、饱和NaHCO3洗、饱和食盐洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥后30℃以下旋干，得到浅黄色固体98.5g。
九、H-Gly-Arg(Alloc)2-pNA
往干燥的1000mL单口烧瓶中加入Fmoc-Gly-Arg(Alloc)2-pNA(98.5g，132.8mmol)和DMF(500mL)。原料溶解后加入哌啶(100mL)，15～25℃下反应20～30min。反应完全后，将反应液倒入2500mL蒸馏水中搅拌，用二氯甲烷(2000mL)萃取。所得有机层多次水洗，至哌啶基本上被洗净。有机层经无水硫酸钠干燥后30℃以下旋干，得到浅黄色固体113.6g。过硅胶柱纯化，得到类白色晶体55.8g，实验八和九的总分离收率91.6％。
收率计算公式：
收率＝产物H-Gly-Arg(Alloc)2-pNA摩尔数/原料Fmoc-Gly-OH摩尔数×100％。
十、Fmoc-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg(Alloc)2-pNA
往干燥的1000mL三口烧瓶中加入Fmoc-Ile-Glu(γ-pip)-OH(45.9g,83.5mmol)、H-Gly-Arg(Alloc)2-pNA(43.4g,83.5mmol)、HOBt(16.9g,125.3mmol)、二氯甲烷(450mL)和DIEA(16.2mL,125.3mmol)，原料溶解后降温至-5℃。加入EDCI(24.0g,125.3mmol)，加完后在-5～0℃，反应1h，然后自然升至室温，反应12～16h。反应完全后，往反应液加1500mL水，然后再加入500mL二氯甲烷萃取。所得有机层依次用水、10％柠檬酸、饱和NaHCO3、饱和食盐水洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥后30℃以下旋干，得到浅黄色固体117g。过硅胶柱纯化，得到类白色晶体67.2g，收率76.5％。
收率计算公式：
收率＝产物Fmoc-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg(Alloc)2-pNA摩尔数/原料H-Gly-Arg(Alloc)2-pNA摩尔数×100％。
十一、H-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg(Alloc)2-pNA
往干燥的1000mL单口烧瓶中加入化合物Fmoc-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg(Alloc)2-pNA(67.2g，63.9mmol)和DMF(280mL)。原料溶解后加入哌啶(70mL)，15～25℃下反应5h。反应完全后，将反应液在低于30℃条件下减压旋干溶剂，得黄色固体。加入二氯甲烷(1000mL)和水(1000mL)萃取，所得有机层多次水洗，至哌啶基本上被洗净。有机层经无水硫酸钠干燥后30℃以下旋干，得到浅黄色固体。过硅胶柱纯化，得到类白色固体50.0g，收率94.3％。
收率计算公式：
收率＝产物H-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg(Alloc)2-pNA摩尔数/原料Fmoc-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg(Alloc)2-pNA摩尔数×100％。
十二、Suc-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg(Alloc)2-pNA
往1000mL干燥的三口烧瓶中加入化合物H-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg(Alloc)2-pNA(50.0g，60.3mmol)的1,4-二氧六环(300mL)，N2置换气3次，溶解后搅拌，冰盐浴(溶解度降低，有固体析出)，滴加入化合物琥珀酸酐(6.58g，65.7mmol)的1,4-二氧六环(200mL)溶液，滴加完后，冰浴搅拌30min，撤去冰盐浴，自然升温至室温(固体溶解后得到无色透明液体)，室温搅拌1h。反应完成后，在低于30℃条件下减压旋干溶剂，得到淡黄色粘稠固体。用二氯甲烷(500mL)萃取，有机相经无水硫酸钠干燥后旋干得到淡黄色固体55.2g。
十三、Suc-Ile-Glu(γ-piperidyl)-Gly-Arg-pNA
往1000mL干燥的单口烧瓶中加入Suc-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg(Alloc)2-pNA(55.2g，59.4mmol)，1,3-二甲基巴比妥酸(55.7g，356.5mmol)、四氢呋喃(600mL)、Pd(PPh3)4(8g，7.0mmol)，氩气保护、常温条件下搅拌2h。反应完成后，加入饱和的NaHCO3，并用***萃取，有机层经无水硫酸钠干燥后旋干，过硅胶柱纯化，得到类白色固体39.8g。实验十二和实验十三总收率86.7％.
收率计算公式：
收率＝产物Suc-Ile-Glu(γ-piperidyl)-Gly-Arg-pNA摩尔数/原料H-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg(Alloc)2-pNA摩尔数×100％。
十四、Suc-Ile-Glu(γ-piperidyl)-Gly-Arg-pNA·HCl
往干燥的1000mL单口烧瓶中加入化合物Suc-Ile-Glu(γ-piperidyl)-Gly-Arg-pNA(39.8g，52.3mmol)和约6M的HCl/EA(400mL)，5～10℃下反应2～3h。反应完全后，在30℃条件以下，将反应液基本旋干。加入新蒸的乙酸乙酯200mL，搅拌1h。过滤，滤饼用乙酸乙酯漂洗后抽干得到微黄色固体(粗肽)48.5g，粗肽通过Sephadex G-15纯化，用1％醋酸溶液洗脱，收集组分冻干，得白色固体35.44g，收率85％，纯度96％。
所得产物经质谱检测：ES-API-LC/MS m/z：761.4(M-Cl)+
所得产物氢谱如图1。证明制备得到S-2732。
收率计算公式：
收率＝Suc-Ile-Glu(γ-piperidyl)-Gly-Arg-pNA·HCl摩尔数/原料Suc-Ile-Glu(γ-piperidyl)-Gly-Arg-pNA摩尔数×100％。
总收率的计算公式：
总收率＝终产物Suc-Ile-Glu(γ-piperidyl)-Gly-Arg-pNA·HCl摩尔数/起始原料Fmoc-Glu-OtBu摩尔数＝39.3％
对比例
Fmoc-Arg(Alloc)2-pNA
往干燥的2000mL三口烧瓶中加入二氯甲烷300mL，90％过氧化氢(14.0mL，516.8mmol)。然后将烧瓶放置在冰浴中降温，等温度稳定后开始搅拌，然后加入三氟乙酸(92.1ml，1240.4mmol)。添加完成后，将烧瓶从冰浴中移除，并在室温条件下搅拌30min。接着将Fmoc-Arg(Alloc)2-pPDA(84.6g,129.2mmol)溶解在800mL二氯甲烷中，并逐滴滴加到前面制备的溶液中。滴加完成后，在烧瓶上方***回流装置，并加热回流1h。反应完成后，向反应液中加入冷水(300mL)。然后再加600mL二氯甲烷萃取。有机层依次用饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤。无水Na2SO4干燥，旋干，硅胶柱纯化，得到微黄色固体60.4g，收率68.3％。
收率计算公式：
收率＝产物Fmoc-Arg(Alloc)2-pNA摩尔数/原料Fmoc-Arg(Alloc)2-pPDA摩尔数×100％。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.Suc-Ile-Glu(γ-Pip)-Gly-Arg-pNA•HCl的制备方法，其特征在于，包括：
过氧化氢、三氟乙酸酐与Fmoc-Arg(Alloc)2-pPDA反应，制得Fmoc-Arg(Alloc)2-pNA；
Fmoc-Arg(Alloc)2-pNA依次与Gly、Ile-Glu(γ-pip)和琥珀酸酐缩合后，经脱保护、成盐制得Suc-Ile-Glu(γ-Pip)-Gly-Arg-pNA•HCl；
所述Fmoc-Arg(Alloc)2-pPDA的制备方法为将Fmoc-Arg(Alloc)2-OH以HOBt、DIEA和EDCI活化后，与对苯二胺室温反应8~12h，所述过氧化氢和三氟乙酸酐与Fmoc-Arg(Alloc)2-pPDA的摩尔比为(5~6):(6~7):(1~1.5)；所述反应的溶剂为二氯甲烷，所述过氧化氢为质量分数为90%的过氧化氢水溶液；所述反应具体包括：过氧化氢与三氟乙酸酐在冰浴的二氯甲烷中混合，室温搅拌30min后，滴加Fmoc-Arg(Alloc)2-pPDA的二氯甲烷溶液，加热回流1h。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Gly的氨基采用Fmoc保护；Fmoc-Arg(Alloc)2-pNA与Gly的缩合包括：脱除Fmoc-Arg(Alloc)2-pNA的Fmoc保护，以HOBt、DIEA和EDCI活化后，添加Fmoc-Gly-OH于-5~0℃反应1 h；然后室温反应12~16 h；制得Fmoc-Gly-Arg(Alloc)2-pNA。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Ile-Glu(γ-pip)中Ile的氨基采用Fmoc保护，Glu的羧基采用tBu保护；所述与Ile-Glu(γ-pip)缩合包括：H-Gly-Arg(Alloc)2-pNA与Fmoc-Ile-Glu(γ-pip)-OH混合，以HOBt、DIEA和EDCI活化后，于-5~0℃反应1 h；然后室温反应12~16 h，制得Fmoc- Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg(Alloc)2-pNA。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述Fmoc-Ile-Glu(γ-pip)-OH的制备方法为：
将Fmoc-Glu-OtBu在HOBt、DIEA和EDCI存在条件下与哌啶于-5~0℃反应1 h；然后室温反应12~16 h，制得Fmoc-Glu(γ-pip)-OtBu；
Fmoc-Glu(γ-pip)-OtBu脱除Fmoc保护后，在HOBt、DIEA和EDCI存在条件下与Fmoc-Ile-OH于-5~0℃反应1 h；然后室温反应12~16 h，再脱除OtBu保护基，制得Fmoc-Ile-Glu(γ-pip)-OH。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述与琥珀酸酐缩合包括：以1,4-二氧六环为溶液，H-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg(Alloc)2-pNA与琥珀酸酐混合，冰浴30min后，升温至室温，搅拌反应1h，制得Suc-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg(Alloc)2-pNA。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脱保护为在Pd(PPh3)4催化下，脱除Arg的胍基保护。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述成盐采用浓度为6mol/L的HCl的乙酸乙酯溶液，5~10℃下反应2~3 h。
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