CN107441481A - 一种治疗单纯皮肤损伤的经血干细胞制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗单纯皮肤损伤的经血干细胞制剂及其制备方法，解决了采用现有技术中的药物进行单纯皮肤损伤后的组织修复，其修复存在情况不尽人意、瘢痕形成明显的问题。本发明包括细胞破碎液，和添加到细胞破碎液中的rhEGF和KGF；所述rhEGF的终浓度为0.05～0.1μg/mL；所述KGF的终浓度为0.1～0.5μg/mL；所述细胞破碎液为：由浓度为1×10⁷～2×10⁹个/mL的经血干细胞通过破碎后，再经过过滤除菌后获得。本发明具有达到更好地组织修复效果等优点。

Description

一种治疗单纯皮肤损伤的经血干细胞制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种经血干细胞制剂，具体涉及一种治疗单纯皮肤损伤的经血干细胞制剂及其制备方法。

背景技术

单纯皮肤损伤指皮肤损伤仅累计皮肤全层及皮下组织浅层部分。皮肤损伤严重时会造成深部组织坏死，如果处理不当，严重会发生溃烂，长时间都无法愈合。皮肤创伤愈合是指由于遭受外力作用，皮肤组织出现离断或缺损后的修复过程，包括各种组织的再生和肉芽组织增生、瘢痕组织形成的复杂组合，表现出各种过程的协同作用。

表皮及其它组织再生发生在创伤24小时内，伤口边缘的基底细胞即开始增生，并在凝块下面向伤口中心迁移，形成单层上皮，覆盖于肉芽组织的表面。当这些细胞彼此相遇时，则停止迁移，并增生、分化成为鳞状上皮。健康的肉芽组织对表皮再生十分重要，因为它可提供上皮再生所需的营养及生长因子。如果肉芽组织长时间不能将伤口填平并形成瘢痕，则上皮再生将延缓。目前针对单纯皮肤创伤的处理手段主要包括：创面消毒与灭菌和使用抗生素预防感染及常规的清创缝合。但这些处理手段仅属于急性期的预防措施，并不能对创伤后的修复产生直接作用。更有甚者，处理不当会加重伤情、遗留严重疤痕。

已有文献报道，经血干细胞是自我复制、定向分化能力最强的干细胞，它源于子宫内膜，通过经血排出体外。它的分化潜能与胚胎干细胞相近，又具备免疫原性低，异体移植无免疫排斥反应或反应较弱的特性，可用于治疗多种疾病，如肺损伤、肝硬化、心梗、糖尿病等。经血干细胞经体外培养可分泌多种细胞因子，这些细胞因子主要的生物学活性是强烈促进有丝***和参与干细胞诱导分化，能有效参与组织细胞的生长、再生和重建。

采用现有技术中的药物进行单纯皮肤损伤后的组织修复，其修复存在情况不尽人意、瘢痕形成明显的问题。而单独采用经血干细胞培养液或细胞因子进行组织修复的效果也不尽如人意。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：采用现有技术中的药物进行单纯皮肤损伤后的组织修复，其修复存在情况不尽人意、瘢痕形成明显的问题，目的在于提供临床皮肤修复效果更明显的一种治疗单纯皮肤损伤的经血干细胞制剂及其制备方法。

本发明通过下述技术方案实现：

一种治疗单纯皮肤损伤的经血干细胞制剂，包括细胞破碎液，和添加到细胞破碎液中的rhEGF和KGF；所述rhEGF的终浓度为0.05～0.1μg/mL；所述KGF的终浓度为0.1～0.5μg/mL；

所述细胞破碎液为：由浓度为1×10⁷～2×10⁹个/mL的经血干细胞溶液通过细胞破碎后，再经过过滤除菌获得。

本发明通过高纯度的经血干细胞破碎液与rhEGF和KGF结合，能达到更好地组织修复效果，通过实施例1～3的实施例可以看出，本发明中经血干细胞破碎液与rhEGF和KGF之间存在相互促进的效果，效果极佳。

进一步，所述经血干细胞通过超声破碎仪破碎。所述经血干细胞破碎后采用0.22μm的滤器进行过滤除菌。

一种治疗单纯皮肤损伤的经血干细胞制剂的制备方法，包括：

取经血，经血经过分离后获得单核细胞层及内膜组织，转入间充质干细胞无血清培养基中进行培育，细胞传代至3～4代时进行细胞鉴定，当获得纯度高于95％的经血干细胞后，分别收集经血干细胞和培养上清液，然后采用经血干细胞和培养上清液配制成浓度为1×10⁷～2×10⁹个/mL的经血干细胞溶液，对经血干细胞溶液中的经血干细胞进行破碎处理，再经过过滤除菌后获得细胞破碎液；

再在细胞破碎液中添加rhEGF和KGF，添加后rhEGF的终浓度为0.05～0.1μg/mL，KGF的终浓度为0.1～0.5μg/mL。

进一步，所述经血处理时加入等体积的淋巴细胞分离液，在2500rpm的条件下离心15～25min后，取单核细胞层及内膜组织。

优选地，所述间充质干细胞无血清培养基采用CellGenix开发的间充质干细胞无血清培养基。所述培育时采用T25培养瓶进行原代培养，5～10小时后，采用上清液转瓶继续培养。

所述原代培养的间充质干细胞无血清培养基中添加有bFGF、hLif和庆大霉素；所述bFGF添加后的终浓度为20～40ng/mL，hLif添加后的终浓度为20～40ng/mL，庆大霉素添加后的终浓度为300-600IU/mL。

若原代培养中无污染，则传代培养的间充质干细胞无血清培养基只添加bFGF和hLif；若原代培养中怀疑有污染，则传代培养的间充质干细胞无血清培养基中添加bFGF、hLif和庆大霉素；所述bFGF添加后的终浓度为20～40ng/mL，hLif添加后的终浓度为20～40ng/mL，庆大霉素添加后的终浓度为300-600IU/mL。

通过上述各组成成分和配比的优化，能极大地提高皮肤的修复效果，效果十分显著。

优选地，过滤除菌时采用0.22μm的滤器进行处理。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明通过制备经血干细胞破碎液，与rhEGF和KGF之间相互配合后，能有效达到相互促进的效果，能达到更好地组织修复效果，效果极佳。

2、本发明不存在免疫排斥与伦理等问题，具有强大的细胞再生与修复的作用，效果十分显著。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为本发明中纯度高于95％的经血干细胞的显微镜下形态图。

图2为实施例1的成品处理后皮肤全层在40倍下的染色结果切片图。

图3为实施例2的成品处理后皮肤全层在40倍下的染色结果切片图。

图4为实施例3的成品处理后皮肤全层在40倍下的染色结果切片图。

图5为实施例4的成品处理后皮肤全层在40倍下的染色结果切片图。

图6为实施例5的成品处理后皮肤全层在40倍下的染色结果切片图。

图7为实施例6的成品处理后皮肤全层在40倍下的染色结果切片图。

图8为实施例7的成品处理后皮肤全层在40倍下的染色结果切片图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1

一种治疗单纯皮肤损伤的经血干细胞制剂，包括细胞破碎液，和添加到细胞破碎液中的rhEGF和KGF。

上述细胞破碎液的制备方法如下：

取经血10mL，加入人淋巴细胞分离液10mL，2500rpm的条件下离心15～25min，取单核细胞层及内膜组织，加入5毫升CellGenix开发的间充质干细胞无血清培养基，转入T25培养瓶中进行原代培养。该间充质干细胞无血清培养基中加入终浓度为30ng/mL的bFGF，终浓度为30ng/mL的hLif，终浓度为400IU/mL的庆大霉素。添加的bFGF、hLif和庆大霉素均符合GMP标准。

培育8小时后换液，即将T25培养瓶中的上清液转瓶继续培养，原代细胞若无污染，传代后不加入抗生素庆大霉素，待细胞传代3～4代，获得纯度高于95％的经血干细胞，如图1所示，收集10¹⁰的经血干细胞，用培养上清液10mL重悬，获得浓度为1×10⁹个/mL的经血干细胞溶液，经过超声破碎仪破碎经血干细胞，然后采用0.22μm的滤器过滤除菌获得细胞破碎液。

在再细胞破碎液中添加GMP标准的rhEGF和KGF，添加后rhEGF的终浓度为0.08μg/mL，添加后KGF的终浓度为0.4μg/mL。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中仅仅只有细胞破碎液，该细胞破碎液中并没有添加rhEGF和KGF。

实施例3

本实施例为实施例1的对照实施例，本实施例中的制剂仅仅由终浓度为0.08μg/mL的rhEGF，和终浓度为0.4μg/mL的KGF组成。

实施例4

本实施例为本发明的对照实施例，本实施例中的制剂仅仅由生理盐水组成。

实施例5

本实施例为本发明的对照实施例，本实施例中的制剂仅仅由浓度为0.2μg/mL的rhEGF组成。

实施例6

本实施例为实施例1的对照实施例，本实施例中与实施例1的区别仅仅在于，获得的细胞破碎液中添加的rhEGF和KGF的浓度不同，具体设置如下：

细胞破碎液中添加rhEGF和KGF后，rhEGF的终浓度为0.16μg/mL，KGF的终浓度为0.8μg/mL。

实施例7

本实施例为实施例1的对照实施例，本实施例中与实施例1的区别仅仅在于，获得的细胞破碎液中添加的rhEGF和KGF的浓度不同，具体设置如下：

细胞破碎液中添加rhEGF和KGF后，rhEGF的终浓度为0.04μg/mL，KGF的终浓度为0.2μg/mL。

采用上述实施例1～实施例7的成品对家兔进行试验，试验方式如下：

一、建立家兔模型

采用外科手术造损方式，选择新西兰兔，10％水合氯醛麻醉，选取脊柱两侧旁开2cm，靠近前肢的两对称区域，建立直径1cm的圆形区域创面。一只兔背部选6个区域，伤及真皮层。

二、治疗方法

治疗时间为5和10天，每组重复三次。每天治疗两次，每次50微升，治疗过程观察创口感染与修复情况，以及家兔饮食行动等其它反应。

三、治疗效果检测

治疗时间结束后处死家兔，取皮肤全层送病理切片，每一份标本进行双染色处理，即H&E染和Masson染色。检测结果如下：

1、生理盐水组与rhEGF组均有轻微脓性分泌物外，实验组别未见明显感染，治疗全程家兔饮食行动正常。

2、根据H&E染色和Masson染色的结果整理出修复情况表，修复情况如表1所示，表1中的+代表修复程度，+越多，修复效果越好，-代表未有修复。

表1

	表皮	真皮胶原新生层	附属结构
				实施例1	++++	+++	++
实施例2	+++	++	-
				实施例3	-	+	+
实施例4(生理盐水)	-	-	-
				实施例5(rhEGF)	-	+	-
实施例6	++	++	+
				实施例7	+	+	+

3、提供实施例1～7的经血干细胞制剂处理5天后的皮肤创伤在40倍下的染色结果切片图；通过该图片可以看出：

图2中有完整且连续的表皮层。真皮层胶原结构分明，真皮附属结构开始再生。痂皮与表皮层分离。说明已经经过创面愈合的炎细胞浸润过程，进入胶原重塑阶段。

图3中有完整且连续的表皮层，但表皮深浅不一，提示创面愈合处于起始阶段。真皮层亦显示新生成的排列不规整的胶原层与原有的排列规则的胶原纤维。真皮层未见附属结构。

图4中未见表皮层。真皮层胶原显示分新生与固有两层，提示有新生胶原产生，见少量真皮附属结构。

图5中无表皮层。真皮层胶原缺损。炎性渗出物较多，直接覆盖在真皮层表面。

图6中无表皮层。真皮层胶原修复不全。炎症细胞侵染多，真皮与痂皮黏附。

图7中表皮与痂皮连接紧密，剥离时撕去表皮。真皮层分新旧两层，已长出少量附属结构。

图8见少量不连续表皮，且表皮结构不完整，仅有1～2层细胞。真皮层胶原显示分新生与固有两层，提示有新生胶原产生，见少量真皮附属结构。

通过上述表1中的数据以及图1～图8的切片结果可知：

实施例1～3的结果可以证明：本发明通过在细胞破碎液中添加GMP标准的rhEGF和KGF，能够使细胞破碎液与添加的细胞因子之间存在相互促进的效果；通过本发明与实施例6与7的数据结果对比证明：只有在培养基中添加本发明浓度下的生长因子，并在细胞破碎液中添加本发明浓度范围内的细胞因子，才能有效使细胞破碎液和细胞因子之间达到相互促进的效果；通过实施例1～7的试验结果对比可知：本发明浓度下获得的制剂的修复效果最佳，优于无添加细胞因子的对照组与浓度范围值之外的对照组。

本发明中10天治疗效果与5天治疗效果的数据进行对比后发现，实施例1～实施例7处理的对比结果相类似，仅仅在于10天的治疗效果比5天更加显著。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种治疗单纯皮肤损伤的经血干细胞制剂，其特征在于，

包括细胞破碎液，和添加到细胞破碎液中的rhEGF和KGF；所述rhEGF的终浓度为0.05～0.1μg/mL；所述KGF的终浓度为0.1～0.5μg/mL；

所述细胞破碎液为：由浓度为1×10⁷～2×10⁹个/mL的经血干细胞溶液通过细胞破碎后，再经过过滤除菌获得。

2.根据权利要求1所述的一种治疗单纯皮肤损伤的经血干细胞制剂，其特征在于，所述经血干细胞通过超声破碎仪破碎。

3.根据权利要求1所述的一种治疗单纯皮肤损伤的经血干细胞制剂，其特征在于，所述经血干细胞破碎后采用0.22μm的滤器进行过滤除菌。

4.一种治疗单纯皮肤损伤的经血干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括：

取经血，经血经过分离后获得单个核细胞层及内膜组织，转入间充质干细胞无血清培养基中进行培育，细胞传代至3～4代时进行细胞鉴定，当获得纯度高于95％的经血干细胞后，分别收集经血干细胞和培养上清液，然后采用经血干细胞和培养上清液配制成浓度为1×10⁷～2×10⁹个/mL的经血干细胞溶液，对经血干细胞溶液中的经血干细胞进行破碎处理，再经过过滤除菌后获得细胞破碎液；

再在细胞破碎液中添加rhEGF和KGF，添加后rhEGF的终浓度为0.05～0.1μg/mL，KGF的终浓度为0.1～0.5μg/mL。

5.根据权利要求4所述的一种治疗单纯皮肤损伤的经血干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述经血处理时加入等体积的淋巴细胞分离液，在2500rpm的条件下离心15～25min后，取单个核细胞层及内膜组织。

6.根据权利要求4所述的一种治疗单纯皮肤损伤的经血干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞无血清培养基采用CellGenix开发的间充质干细胞无血清培养基。

7.根据权利要求6所述的一种治疗单纯皮肤损伤的经血干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述培育时采用T25培养瓶进行原代培养，5～10小时后，采用上清液转瓶继续培养。

8.根据权利要求7所述的一种治疗单纯皮肤损伤的经血干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述原代培养的间充质干细胞无血清培养基中添加有bFGF、hLif和庆大霉素；所述bFGF添加后的终浓度为20～40ng/mL，hLif添加后的终浓度为20～40ng/mL，庆大霉素添加后的终浓度为300-600IU/mL。

9.根据权利要求8所述的一种治疗单纯皮肤损伤的经血干细胞制剂的制备方法，其特征在于，若原代培养中无污染，则传代培养的间充质干细胞无血清培养基只添加bFGF和hLif；若原代培养中怀疑有污染，则传代培养的间充质干细胞无血清培养基中添加bFGF、hLif和庆大霉素；所述bFGF添加后的终浓度为20～40ng/mL，hLif添加后的终浓度为20～40ng/mL，庆大霉素添加后的终浓度为300-600IU/mL。

10.根据权利要求4所述的一种治疗单纯皮肤损伤的经血干细胞制剂的制备方法，其特征在于，过滤除菌时采用0.22μm的滤器进行处理。