CN106497975A - 基因重组干细胞制剂的制备方法及其在皮肤损伤修复、瘢痕抑制中的应用 - Google Patents

基因重组干细胞制剂的制备方法及其在皮肤损伤修复、瘢痕抑制中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于创伤修复、瘢痕抑制的基因重组干细胞制剂及其制备方法，所述基因重组干细胞制剂包括独立存放的细胞针剂和喷涂剂；该制备方法包括将稳定表达HGF的细胞系进行扩增培养，然后分离出细胞成分和培养上清；将所述细胞成分制备为细胞针剂；将所述培养上清制备为喷涂剂。本发明还提供了稳定表达HGF的宮血干细胞在制备用于修复皮肤损伤和/或抑制瘢痕产生的药物中的用途。本发明能够实现对创伤安全高效的修复并且能够抑制瘢痕的产生。

Description

基因重组干细胞制剂的制备方法及其在皮肤损伤修复、瘢痕 抑制中的应用
技术领域
本公开涉及药物制备与细胞培养技术领域，具体地，涉及一种用于创伤修复、瘢痕抑制的干细胞制剂的制备方法和干细胞制剂，以及，稳定表达HGF的宮血干细胞在制备修复皮肤损伤和/或抑制瘢痕产生的药物中的用途。
背景技术
肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一种重要的抗纤维化因子，现有研究表明，其可以促进皮肤伤口有效、高质量的快速愈合，可以减少瘢痕的形成，对骨重塑具有重要作用，是一种应用前景广泛的蛋白类治疗药物。
但是HGF不易大量收集和获取，目前工业生产中应用的最为广泛的生产方式为原核蛋白表达***，该***主要利用大肠杆菌表达蛋白，大肠杆菌的HGF表达量高但也易形成包涵体从而影响蛋白活性。而采用真核表达***进行瞬时转染表达的方式虽然避免了包涵体的形成，但是因其表达量低导致生产成本极高。此外，现有的以HGF作为有效成分的针剂或涂剂对皮肤瘢痕的修复不具有靶向性，而且直接使用HGF蛋白给药的治疗方法中存在HGF半衰期短的缺陷，即便进行高频率多次注射，也难以在体内维持高水平的HGF浓度，从而造成HGF用量以及经济上的花费巨大。另一方面，受蛋白制剂纯化工艺水平的限制，现有的一些HGF制剂在治疗中易产生不良反应从而给治疗带来负作用。
因此有必要对HGF的应用方式和获取方法进行改进，提供一种大规模、稳定、安全的HGF利用方法，以及一种用于创伤修复的制剂及其制备方法，为有效利用HGF的治疗作用提供新的途径。
发明内容
本公开的目的是解决现有技术中HGF应用于治疗时所存在的上述问题，提供一种新的HGF的应用形式和制剂从而有效的利用HGF的创伤修复功能。
为了实现上述目的，本发明提供了一种用于创伤修复、瘢痕抑制的基因重组干细胞制剂的制备方法，干细胞制剂包括独立存放的细胞针剂和喷涂剂；该制备方法包括：
(1)将SEQ ID NO.1所示的慢病毒载体pLVX-EF1α-hHGF包装为慢病毒感染颗粒后感染宫血干细胞，并筛选获得稳定表达肝细胞生长因子HGF的细胞系；所述宫血干细胞为CD3阳性且CD28阳性的宫血干细胞；
(2)将稳定表达HGF的细胞系进行4-6代的扩增培养，然后在无血清培养基中培养48-72小时，接着分离出细胞成分和培养上清；
(3)将所述细胞成分制备为细胞针剂；将所述培养上清制备为喷涂剂。
本公开的一个方面还提供了利用上述方法制备的用于创伤修复的干细胞制剂。
本公开的一个方面还提供了稳定表达HGF的宮血干细胞在制备修复皮肤损伤和/或抑制瘢痕产生的药物中的用途；其中，稳定表达HGF的宮血干细胞通过包括如下步骤的方法制备得到：
(1)将SEQ ID NO.1所示的慢病毒载体pLVX-EF1α-hHGF包装为慢病毒感染颗粒后感染宫血干细胞，并筛选获得稳定表达肝细胞生长因子HGF的细胞系；所述宫血干细胞为CD3阳性且CD28阳性的宮血干细胞；
(2)将稳定表达HGF的细胞系进行4-6代的扩增培养。
本公开将HGF基因的重组质粒导入宫血干细胞中，构建获得了稳定高表达HGF细胞因子的宫血干细胞株，并利用该宫血干细胞株制备获得了包括细胞针剂和喷涂剂的干细胞制剂。本公开的优点在于，细胞针剂中的干细胞能够稳定高表达HGF，表达效率高，效果持久，能够较长时间的维持有效浓度，而且由于干细胞的归巢效应，能够更利于药物在体内归巢到需要进行创伤修复的部位，达到更好的修复创伤、抑制瘢痕的作用。同时由于宫血干细胞能分泌丰富的细胞因子，如表皮生长因子EGF、神经生长因子NGF、血管内皮生长因子VEGF等，可以更好的有助于创伤的修复。利用宫血干细胞株的培养上清所制备的喷涂剂中含有宫血干细胞所分泌的各种细胞因子及营养成分，这些细胞因子和营养成分能够与肝细胞生长因子HGF发挥协同作用进行创伤修复。联合使用所述干细胞制剂中的细胞针剂和喷涂剂，可以通过二者的协同增效作用促进皮肤伤口有效、高质量的快速愈合，减少瘢痕产生。为安全、有效的利用HGF的治疗作用提供了新的途径。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开提供一种用于创伤修复、瘢痕抑制的基因重组干细胞制剂的制备方法，所述干细胞制剂包括独立存放的细胞针剂和喷涂剂；该制备方法包括：
(1)将SEQ ID NO.1所示的慢病毒载体pLVX-EF1α-hHGF包装为慢病毒感染颗粒后感染宫血干细胞，并筛选获得稳定表达肝细胞生长因子HGF的细胞系；所述宫血干细胞为CD3阳性且CD28阳性的宫血干细胞；
(2)将稳定表达HGF的细胞系进行4-6代的扩增培养，然后在无血清培养基中培养48-72小时，接着分离出细胞成分和培养上清；
(3)将所述细胞成分制备为细胞针剂；将所述培养上清制备为喷涂剂。
其中，所述慢病毒载体pLVX-EF1α-hHGF的启动子为EF1α启动子，利用该启动子使得HGF在原代细胞中的表达具有较高的启动效率。所述慢病毒载体pLVX-EF1α-hHGF的核苷酸序列可以通过基因工程方法改造现有的商品化载体得到或通过序列合成方法得到。
在本发明的一种优选的实施方式中，通过包括如下步骤的方法制备扩增培养的宫血干细胞：
S1、采集月经产物，将月经产物中的宫血与子宫内膜组织进行分离；
S2、分离出宫血中的单核细胞，并对分离得到的单核细胞进行贴壁培养，得到第一贴壁细胞；
S3、将子宫内膜组织进行胰酶消化和细胞分离，并且对分离得到的细胞进行贴壁培养，得到第二贴壁细胞；
S4、将所述第一贴壁细胞和所述第二贴壁细胞混合并进行4-6代的传代扩增培养，得到传代扩增细胞；
S5、用抗人CD3/CD28磁珠从所述传代扩增细胞中分离出CD3阳性且CD28阳性的宮血干细胞。
其中，在步骤S2中，可以利用Ficoll分离液对宫血进行密度梯度离心获得单个核细胞，并用生理盐水、PBS或空白培养基重悬单个核细胞后离心去除红细胞、血小板和细胞碎片等杂质。然后利用无血清培养基对细胞进行贴壁培养。可选的，所述无血清培养基可以为GIBCOMSC SFM培养基。
其中，在步骤S3中，可以采用过筛网的方式使胰酶消化后的细胞分离，并用生理盐水、PBS或空白培养基重悬单个核细胞后离心去除红细胞、血小板和细胞碎片等杂质。然后利用GIBCOMSC SFM培养基对细胞进行贴壁培养。
其中，在步骤S4中，将第一贴壁细胞和第二贴壁细胞混合时二者的比例没有特别的限制可以根据每种贴壁细胞的总量进行灵活的调整。
其中，在步骤S5中，抗人CD3/CD28磁珠能够与传代扩增细胞中CD3阳性和CD28阳性的宫血干细胞的表面标志物发生特异性结合，从而达到细胞分离的目的，可选的，所述CD3/CD28磁珠可以为购自Thermo Fisher公司的商品化产品。
在本公开的一种实施方式中，在用慢病毒感染颗粒感染宫血干细胞前优选使用含有20-40IU/mL的IL-2的培养基对CD3阳性且CD28阳性的宫血干细胞进行扩增，并且将扩增后的CD3阳性且CD28阳性的宫血干细胞用于慢病毒感染颗粒感染。
在本公开的一种优选的实施方式中，通过包括如下步骤的方法制备慢病毒感染颗粒：
SSS1、在所述宫血干细胞中加入含有所述慢病毒感染颗粒的悬液以及聚凝胺，接着在30-35℃和500-600×g的离心速度下离心20-40min，然后培养20-26h，得到待筛选的培养物；
SSS2、在所述待筛选的培养物中加入抗生素进行筛选，然后分离存活的细胞，获得稳定表达HGF的细胞系。
其中，在步骤SS1中，可以利用本领域常用的转染试剂进行细胞转染，例如可以使用PEI作为转染试剂。可选的，为了提高细胞转染的效率，可以采用电穿孔方法进行慢病毒载体的转染。
其中，在步骤SS2中，优选使用opti-MEM培养基对所述转染后的包装细胞进行培养，培养过程中每5-8小时更换一次培养基，也可以在培养基中加入滴度增强剂以增加病毒滴度。收集转染46-50小时后的细胞培养液并离心去除杂质获得纯度较高的慢病毒感染颗粒。
在本公开的一种实施方式中，慢病毒感染颗粒感染宫血干细胞并筛选的操作包括：
SSS1、在所述宫血干细胞中加入含有所述慢病毒感染颗粒的悬液以及聚凝胺(polybrene)，接着在30-35℃和500-600×g的离心速度下离心20-40min，然后培养20-26h，得到待筛选的培养物；
SSS2、在所述待筛选的培养物中加入抗生素进行筛选，然后分离存活的细胞，获得稳定表达HGF的细胞系。
其中，稳定表达HGF的细胞系在荧光显微镜下可以被观察到发出绿色荧光。
在步骤SSS1中，所述慢病毒感染颗粒在转染体系中的滴度可以为3-6×107TU/mL，聚凝胺在转染体系中的终浓度可以为3-10μg/mL。
并且，将稳定表达HGF的细胞系进行4-6代的扩增培养时，所用的培养基为含有20-40IU/mL的IL-2的培养基。优选的，用于扩增培养稳定表达HGF的细胞系的培养基为含有双抗(青霉素和链霉素)和20-40IU/mLIL-2的GIBCOMSC SFM培养基。
在本公开的一种实施方式中，将所述细胞成分制备为细胞针剂的操作包括：将细胞与注射缓冲液混合；
所述针剂中还可以含有营养成分，所述营养成分选自透明质酸、多肽、维生素、氨基酸和核酸中的至少一种；所述注射缓冲液为生理盐水、磷酸缓冲液、葡萄糖注射液或柠檬酸缓冲液；所述细胞针剂中的细胞浓度为0.1-1×107个/mL。
本发明中对于透明质酸、多肽、维生素、氨基酸和核酸的具体种类没有特别的限制，可以为本领域制备创伤修复类制剂时所常用的成分。
在本公开的一种可选的实施方式中，所述细胞针剂中还可以含有趋化因子，所述趋化因子能够趋化宫血干细胞靶向创伤修复部位，可选的，所述趋化因子的种类包括SDF-1(细胞衍生因子-1)和ActivinB中的至少一种。
在本公开的一种可选的实施方式中，将所述培养上清制备为喷涂剂的操作包括：
用3KD的超滤浓缩离心管对所述培养上清进行超滤浓缩，获得培养上清的8-10倍浓缩液；将所述浓缩液制备为喷剂。在本公开的一种优选的实施方式中，可以将所述浓缩液与营养成分混合；所述营养成分选自透明质酸、多肽、维生素、氨基酸和核酸中的至少一种。
其中，所述浓缩液中含有分子量为3KD以上的由干细胞所分泌的各种细胞因子。
在本公开的一种实施方式中，可以对所述浓缩液进行滤膜过滤，再将能够通过滤膜的部分置于无菌瓶中，在-20℃下保存待用，所述滤膜的孔径可以为0.22μm。
喷涂剂中还可加入助悬剂，如聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、羟丙基甲基纤维素等；防腐剂，如尼泊金类、苯甲酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等。
本公开还提供了利用本公开所述的方法制备的用于创伤修复的干细胞制剂。
本公开还提供了稳定表达HGF的宮血干细胞在制备修复皮肤损伤和/或抑制瘢痕产生的药物中的用途；其中，稳定表达HGF的宮血干细胞通过包括如下步骤的方法制备得到：
(1)将SEQ ID NO.1所示的慢病毒载体pLVX-EF1α-hHGF包装为慢病毒感染颗粒后感染宫血干细胞，并筛选获得稳定表达肝细胞生长因子HGF的细胞系；所述宫血干细胞为CD3阳性且CD28阳性的宮血干细胞；
(2)将稳定表达HGF的细胞系进行4-6代的扩增培养。
以下通过结合实施例进一步说明本发明。
实施例1
1)制备慢病毒感染颗粒：合成SEQ ID NO.1所示的慢病毒载体pLVX-EF1α-hHGF。将慢病毒载体pLVX-EF1α-hHGF与脂质体转染试剂混合后转染293T细胞，得到转染后的包装细胞；将转染后的包装细胞进行培养并收集慢病毒感染颗粒。
2)宫血干细胞的获得：采集月经产物，将月经产物中的宫血与子宫内膜组织进行分离；用Ficoll密度梯度离心分离出宫血中的单核细胞，用生理盐水重悬单个核细胞后离心去除红细胞、血小板和细胞碎片等杂质。然后利用GIBCOMSC SFM培养基对细胞进行贴壁培养，得到贴壁细胞；将子宫内膜组织进行胰酶消化并过筛分离，用生理盐水重悬单个核细胞后离心去除红细胞、血小板和细胞碎片等杂质。然后利用GIBCOMSC SFM培养基对细胞进行贴壁培养，得到贴壁细胞；将上述两种贴壁细胞混合并进行3代的传代扩增培养(传代扩增培养的培养基为GIBCOMSC SFM培养基)，得到传代扩增细胞；用抗人CD3/CD28磁珠从传代扩增细胞中分离出CD3阳性且CD28阳性的宮血干细胞。
3)慢病毒感染颗粒感染宫血干细胞：使用含有30IU/mL的IL-2的GIBCOMSC SFM培养基对CD3阳性且CD28阳性的宫血干细胞扩增3代后用于慢病毒感染颗粒感染；
在宫血干细胞中加入含有慢病毒感染颗粒的悬液以及聚凝胺获得转染体系(慢病毒感染颗粒在转染体系中的滴度为5×107TU/mL，聚凝胺在转染体系中的终浓度为8μg/mL)，接着在32℃和520×g的离心速度下离心30min，然后培养24h，得到待筛选的培养物；在待筛选的培养物中加入抗生素进行筛选，经3次传代后分离存活的细胞，获得稳定表达HGF的细胞系。
在荧光显微镜下观察到发出绿色荧光的细胞，即为已成功导入目的基因的细胞。
4)干细胞制剂制备：将稳定表达HGF的细胞系进行P4-P6代的扩增培养，所用的培养基为含有20-40IU/mL的IL-2的无血清培养基。扩增培养后再将稳定表达HGF的细胞在GIBCOMSC SFM无血清培养基中培养72小时，接着分离出细胞成分和培养上清；
将细胞成分制备为细胞针剂：将细胞与生理盐水混合；调整针剂中的细胞浓度为0.5×107个/mL制得细胞针剂。
将培养上清制备为喷涂剂的操作包括：将培养72小时后的干细胞培养上清收集到50mL离心管内；在25℃和300×g的离心速度下离心5min后弃沉淀。用3KD的超滤管对干细胞上清进行超滤浓缩，浓缩10倍获得浓缩液；
将浓缩液用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤，收集能通过滤膜的滤液制成喷剂。
实施例2
实施例1制备的干细胞制剂对Swiss裸鼠创伤修复试验。
18只体重为18-22g的裸鼠通过腹腔注射***-二甲苯胺噻嗪(80mg/kg-12mg/kg；Ref.K-113，Sigma，France)进行麻醉，将动物随机分为3个实验组和3个对照组，每组各3只，然后在每只小鼠的右胁用0.5/10刀片进行透皮损伤(长1cm，深大约1到2mm)。
(1)实验组1和对照组1
对照组1受伤后10分钟在动物伤口上局部施用200μL生理盐水；并经尾静脉注射1ml生理盐水；
实验组1受伤后10分钟在动物伤口上局部施用实施例1中制备的喷涂剂200μL；并经尾静脉注射实施例1制备的细胞针剂1ml。
治疗后48小时对创伤愈合的检测显示实验组1经治疗后伤口完全愈合有上皮形成，平均上皮生长率达到100％，而对照组1经治疗后伤口仍没有愈合，仍保持广泛开放。
(2)实验组2和对照组2
对照组2受伤后10分钟经尾静脉注射1ml生理盐水；；
实验组2受伤后10分钟经尾静脉注射实施例1制备的细胞针剂1ml。
治疗后48小时对创伤愈合的检测显示实验组2经治疗后伤口已经形成上皮，平均上皮生长率达到80％，而对照组2经治疗后伤口仍没有愈合，仍保持广泛开放。
(3)实验组3和对照组3
对照组3受伤后10分钟在动物伤口上局部施用200μL生理盐水；
实验组3受伤后10分钟在动物伤口上局部施用实施例1中制备的喷涂剂200μL。
治疗后48小时对创伤愈合的检测显示实验组3经治疗后伤口已经形成上皮，平均上皮生长率达到75％，而对照组3经治疗后伤口仍没有愈合，仍保持广泛开放。
实施例3
实施例1制备的干细胞制剂抑制Swiss裸鼠瘢痕产生的试验。
6只体重为18-22g的裸鼠通过腹腔注射***-二甲苯胺噻嗪(80mg/kg-12mg/kg；Ref.K-113，Sigma，France)进行麻醉，将动物随机分为实验组和对照组，每组各3只，然后在每只小鼠的右胁切出一条深入皮下组织的纵向透皮伤口(长1cm，深大约1-2mm)。
对照组受伤后10分钟在动物伤口上局部施用200μL生理盐水；并经尾静脉注射1ml生理盐水；
实验组受伤后10分钟在动物伤口上局部施用实施例1中制备的喷涂剂200μL；并经尾静脉注射实施例1制备的细胞针剂1ml。
观察实验组和对照组的伤口愈合及瘢痕产生情况。手术后6-8小时实验组就出现疤痕，疤痕持续10-12天，然后自然脱落。根据肉眼可见的创伤表面判断，疤痕下的组织愈合情况正常。受伤3周后，伤口局部的瘢痕平坦柔软并呈现逐渐不明显的趋势。对照组的疤痕在两天后才形成且疤痕表层较不平整，疤痕持续18-22天，然后自然脱落，根据肉眼可见的创伤表面判断，形成了增生性瘢痕，瘢痕明显高于周围正常皮肤，局部增厚***，表面呈红紫色，受伤4周后瘢痕状态仍没有明显改善。
以上实验结果表明，经本公开的干细胞制剂治疗的伤口与对照组间存在显著的区别，创伤愈合所需时间更短，瘢痕消退更快，更加平整美观。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (10)

1.一种用于创伤修复、瘢痕抑制的基因重组干细胞制剂的制备方法，所述干细胞制剂包括独立存放的细胞针剂和喷涂剂；其特征在于，该制备方法包括：
(1)将SEQ ID NO.1所示的慢病毒载体pLVX-EF1α-hHGF包装为慢病毒感染颗粒后感染宫血干细胞，并筛选获得稳定表达肝细胞生长因子HGF的细胞系；所述宫血干细胞为CD3阳性且CD28阳性的宫血干细胞；
(2)将稳定表达HGF的细胞系进行4-6代的扩增培养，然后在无血清培养基中培养48-72小时，接着分离出细胞成分和培养上清；
(3)将所述细胞成分制备为细胞针剂；将所述培养上清制备为喷涂剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，该制备方法还包括通过包括如下步骤的方法制备扩增培养的宫血干细胞：
S1、采集月经产物，将月经产物中的宫血与子宫内膜组织进行分离；
S2、分离出宫血中的单核细胞，并对分离得到的单核细胞进行贴壁培养，得到第一贴壁细胞；
S3、将子宫内膜组织进行胰酶消化和细胞分离，并且对分离得到的细胞进行贴壁培养，得到第二贴壁细胞；
S4、将所述第一贴壁细胞和所述第二贴壁细胞混合并进行4-6代的传代扩增培养，得到传代扩增细胞；
S5、用抗人CD3/CD28磁珠从所述传代扩增细胞中分离出CD3阳性且CD28阳性的宮血干细胞。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，该制备方法还包括：在慢病毒感染颗粒感染宫血干细胞之前，使用含有20-40IU/mL的IL-2的培养基对CD3阳性且CD28阳性的宫血干细胞进行扩增，并且将扩增后的CD3阳性且CD28阳性的宫血干细胞用于慢病毒感染颗粒感染；
并且，将稳定表达HGF的细胞系进行4-6代的扩增培养时，所用的培养基为含有20-40IU/mL的IL-2的培养基。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的制备方法，其中，该制备方法还包括通过包括如下步骤的方法制备慢病毒感染颗粒：
SS1、将SEQ ID NO.1所示的慢病毒载体pLVX-EF1α-hHGF与转染试剂混合后转染包装细胞，得到转染后的包装细胞；所述包装细胞选自293T细胞、293FT细胞、293TN细胞、293ET细胞中的至少一种；
SS2、将所述转染后的包装细胞进行培养并收集慢病毒感染颗粒。
5.根据权利要求1-3中任意一项所述的制备方法，其中，慢病毒感染颗粒感染宫血干细胞并筛选的操作包括：
SSS1、在所述宫血干细胞中加入含有所述慢病毒感染颗粒的悬液以及聚凝胺，接着在30-35℃和500-600×g的离心速度下离心20-40min，然后培养20-26h，得到待筛选的培养物；
SSS2、在所述待筛选的培养物中加入抗生素进行筛选，然后分离存活的细胞，获得稳定表达HGF的细胞系。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，所述慢病毒感染颗粒在转染体系中的滴度为3-6×107TU/mL，聚凝胺在转染体系中的终浓度为3-10μg/mL。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其中，将所述细胞成分制备为细胞针剂的操作包括：将细胞与注射缓冲液混合；所述注射缓冲液为生理盐水、磷酸缓冲液、葡萄糖注射液或柠檬酸缓冲液；所述细胞针剂中的细胞浓度为0.1-1×107个/mL。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其中，将所述培养上清制备为喷涂剂的操作包括：用3KD的超滤浓缩离心管对所述培养上清进行超滤浓缩，获得培养上清的8-10倍浓缩液。
9.权利要求1-8中任意一项所述的方法制备的用于创伤修复的干细胞制剂。
10.稳定表达HGF的宮血干细胞在制备修复皮肤损伤和/或抑制瘢痕产生的药物中的用途；其中，稳定表达HGF的宮血干细胞通过包括如下步骤的方法制备得到：
(1)将SEQ ID NO.1所示的慢病毒载体pLVX-EF1α-hHGF包装为慢病毒感染颗粒后感染宫血干细胞，并筛选获得稳定表达肝细胞生长因子HGF的细胞系；所述宫血干细胞为CD3阳性且CD28阳性的宮血干细胞；
(2)将稳定表达HGF的细胞系进行4-6代的扩增培养。
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