CN105950542A - 一种人皮肤表皮细胞培养基及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人皮肤表皮细胞培养基及其应用，本发明培养基将K‑SFM及DMEM和F12培养基按照2:1:1混合，添加BPE、EGF、SCGF、FGF、TGF‑β、VEGF、CaCl2、谷氨酰胺、双抗。本发明培养基不含血清，可用于人皮肤表皮细胞原代及传代培养。采用本发明培养基只需要很小的患者皮肤组织，就可以在体外培养获得大量的表皮细胞，与传统表皮细胞培养基相比，大大缩短了扩增相同细胞数量所需要的时间，满足了临床治疗的需求。

Description

一种人皮肤表皮细胞培养基及其应用
技术领域
本发明涉及一种人皮肤表皮细胞培养基及其应用，属于生物医学领域。
背景技术
皮肤是人体面积最大的器官，承担着保护身体、排汗、感觉冷热和压力等功能，使体内各组织和器官免受物理性、机械性、化学性和病原微生物的侵袭。遗传疾病、烧烫伤、慢性皮肤创伤(如糖尿病)、白癜风、白化病等很多原因会对皮肤造成损害，影响皮肤美观、使皮肤留下疤痕甚至失去生理功能。当皮肤受到严重损害，如深度的大面积烧烫伤时，皮肤不能再进行自我恢复，会失去对细菌的抵御作用，导致大量细菌通过皮肤侵入人体，极易引发全身感染而导致死亡。
人皮肤的上皮细胞是表皮细胞，除具有一般的上皮细胞特征外，可分泌角质，具有很强的角质化特征，以此作为保护上皮，完成表皮的功能。人表皮细胞在创伤愈合中起至关重要的作用，尤其是严重烧伤病人表皮细胞的匮乏与其病程长短、并发症的发生、后期瘢痕的形成均有密切关系，因此应用组织工程技术在体外进行表皮细胞的分离、培养与保存并应用于临床始终都是烧伤工作者的一个研究热点。
目前，用来治疗各类皮肤创伤的组织工程表皮最大的问题是能否提供足够的表皮数量，用以治疗大面积的创伤伤口。传统的表皮培养基不仅需要昂贵的添加因子，而且其培养的表皮细胞扩增速度缓慢，在时间上不能满足烧烫伤治疗的需求，这个因素严重束缚了组织工程表皮用于急性皮肤创伤的治疗的临床应用。
发明内容
针对组织工程表皮在临床应用上面临的束缚，本发明提供了一种人皮肤表皮细胞培养基，该培养基不含血清，只需要很小的患者皮肤组织，就可以在体外培养获得大量的表皮细胞，与传统表皮细胞培养基相比，大大缩短了扩增相同细胞数量所需要的时间，满足了临床治疗的需求。
为此，本发明采用技术方案如下，一种人皮肤表皮细胞培养基，以500ml计，各组分及用量关系如下：
a.最小必须培养基：
角质无血清培养基(K-sfm，keratinocyte serum-free medium)250ml；
DMEM(Ca2+free)培养基125ml；
Ham’s F-12培养基125ml；
b.200mML-谷氨酰胺(L-Glutamine)：终浓度1.5mM；
c.牛垂体提取物(Bovine Pituitary Extract,BPE):终浓度25μg/ml；
d.表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF):终浓度0.2ng/ml；
e.干细胞生长因子(Stem Cell Growth Factors,SCGF)：终浓度30ng/ml；
f.纤维母细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)：终浓度1.5ng/ml；
g.转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)：终浓度0.8ng/ml；
h.血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)：终浓度10ng/ml；
i.100X青霉素-链霉素(Penicillin/Streptomycin,PS)：终浓度为1X；
j.0.3M氯化钙溶液(CaCl2)：终浓度为0.4mM。
本发明培养基各组分名称及来源列举如下：
药品名称 公司及货号
K-sfm Life Technologies catalog#17005-042042
DMEM Life Technologies catalog#21068-028
Ham’s F-12medium Life Technologies catalog#31765-092
200mM L-Glutamine Life Technologies catalog#25030081
BPE ScienCell catalog#0713
EGF R&D systems catalog#236-EG-01M
Penicillin/Streptomycin Life Technologies catalog#15140122
SCGF Peprotech#100-22B-10
FGF Millipore#341595
TGF-β Peprotech#500-P16Bt-25
VEGF Peprotech#AF-100-20-10
配制方法为：
取K-SFM及DMEM和F12按照比例2:1:1混合，添加因子使其终浓度达到： 25μg/ml的BPE(牛垂体提取物)，0.2ng/ml的EGF(表皮生长因子)，0.4mM的CaCl2，30ng/ml的SCGF(干细胞生长因子)，1.5ng/ml的FGF(纤维母细胞生长因子)，0.8ng/ml的TGF-β(转化生长因子)，10ng/ml的VEGF(血管内皮生长因子)，1.5mM的glutamine(谷氨酰胺)，1xSAC双抗，混匀后使用。
本发明培养基用于人皮肤表皮细胞原代及传代培养，具体可应用于：1.烧伤创面治疗所需表皮片培养；2.疤痕创面整形美容；3.皮肤病药物筛选；4.化妆品有效成份的筛选及对表皮细胞有无毒性作用为确定；5.确定和筛选某些细胞因子对表皮细胞生长的影响；6.其他皮肤生理和皮肤病理学研究。
所述人皮肤表皮细胞采集源自胎儿头皮、新生儿***或成人头皮的含有多功能表皮和真皮细胞的组织样本；或者来自任何组织的SOX2基因表达的***和来自任何组织样本有能力形成单克隆的表皮细胞以及冰冻融化后仍可以有能力形成人皮肤的细胞。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明研究配制的培养体系是无血清的，应用于人表皮细胞体外培养，其效果与有血清比较无明显差别。在倒置显微镜下动态观察：无血清组与有血清组表皮细胞生长特点和生长速度相似。血清的成分比较复杂，不明因子繁多，且各批血清间所含的生长因子和激素的变化很大。因此，无血清的培养基更能满足临床治疗中对于组织工程表皮的质量要求。
2、本发明研制的表皮细胞培养体系不仅适合于传代表皮细胞培养，而且适合原代表皮细胞的培养。现在国家比较通用的表皮细胞培养基是无血清的角质培养基(keratinocyte serum-free medium，K-sfm)，该培养基培养的原代表皮细胞生长速度缓慢，所培养的原代表皮细胞密度较小，且不易形成表皮片。所以，很多研究工作者只有将分离的原代表皮细胞先采用有血清培养基培养，待细胞贴壁生长良好后才逐渐换成K-sfm培养基培养。为寻求更近似于生理状态的培养条件，探索适合于原代表皮细胞生长的培养体系，我们以少量的K-sfm培养基以及不含钙离子的DMEM培养基和F12培养基为基础培养基，添加了可促进角质细胞生长的各类因子组成无血清的完全培养基。同时，我们在该培养基中添加了一定量的钙离子，可以促进细胞克隆的形成和细胞的贴壁生长，极大的促进了表皮细胞的扩增速度，节省了培养所需要的时间，更降低了成本。
3、本发明研制的表皮细胞培养体系可以使培养的成人表皮细胞保留更好的干细胞特性，在组织工程表皮的临床移植中，表皮细胞的干细胞特性越强，其生长愈合能力就越好。研究表明，干细胞生长因子等细胞因子及活性成分对于维持干细胞微环境，细胞损伤修复，以及促使分化细胞重新获得分化能力有极大的作用，其中干细胞生长因子(SCGF)对于激活和维持干细胞增殖分化能力具有有效作用。纤维母细胞生长因子(FGF)可促进内皮样细胞增殖，同时对损伤细胞有较好的修复作用。转化生长因子(TGF)对于细胞是一种多功能蛋白质，可以影响多种细胞的生长、分化、细胞凋亡及免疫调节等功能。转化生长因子-β(TGF-β)是TGF家族的一员，可以通过SMAD信号通路和/或DAXX信号通路发挥其生物学功能。通过上述因子的作用，可以延缓或逆转细胞老化状态，同时也可以修复细胞损伤，提高细胞增殖、分化活力。因此我们的培养基可以为皮肤创伤的临床治疗带来干细胞特性更强的表皮细胞。
附图说明
图1为实施例1用传统含血清表皮培养基培养的原代表皮细胞。
图2为实施例1用本发明人皮肤表皮培养基培养的原代表皮细胞。
图3为实施例2用K-sfm表皮培养基培养的原代表皮细胞。
图4为实施例2用本发明人皮肤表皮细胞培养基培养的原代表皮细胞。
图5为实施例3用K-sfm表皮培养基培养的传代新生儿***表皮细胞。
图6为实施例3用本发明人皮肤表皮培养基培养的传代新生儿***表皮细胞。
图7为实施例4用K-sfm表皮培养基培养的传代成人***表皮细胞。
图8为实施例4用本发明人皮肤表皮培养基培养的传代成人***表皮细胞。
图9为实施例4用两种表皮培养基培养的成人***表皮细胞经过免疫荧光染色后的照片比较：其中A为K-sfm表皮培养基培养的成人***表皮细胞免疫荧光染色结果；B为本发明人皮肤表皮培养基培养的成人***表皮细胞免疫荧光染色结果。
具体实施方式
下面结合具体试验方法和附图对本发明的技术方案及其所产生的技术效果进行进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加 以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明中所使用的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实例一：本发明人皮肤表皮细胞培养基与传统含血清表皮培养基培养的原代表皮细胞形态及细胞数量的比较
材料和方法：
组织来源：医院手术废弃新生儿***
细胞培养基：传统含血清表皮培养基、本发明人皮肤表皮培养基
a)将采集的新鲜的组织样本用酒精消毒处理三分钟，进而用含2倍双抗的PBS处理两次，每次3分钟。将组织浸泡于含1倍双抗的F12培养基中4℃保存备用。组织保存时间不高于72小时。
b)组织于浸泡液体中取出，沥净多余液体，称重并作好记录后将组织切成长条状，均匀的平铺于100mm培养皿中，向培养皿中加入浓度为2.5mg/ml的中性蛋白酶(Dispase,neutral protease,grade II,中性蛋白酶，又称分散酶)酶液，每5g皮肤组织中加入20ml酶液，使每一块皮肤组织都完全浸没在酶液中，将皮肤组织于4℃静止孵育过夜。
c)Dispase中孵育过夜的新生儿***皮肤从冰箱中取出，用尖形镊子将表皮从真皮小心剥离下来，将表皮转入一个新的培养皿中，沥净多余液体，用手术刀将组织切成均匀的粘稠状。
d)加入胰酶浓度为0.05％的磷酸盐缓冲液(PBS)用于表皮的消化，每5g皮肤组织中加入20ml上述酶液；37℃下消化30分钟，消化过程中不断摇动混匀培养皿，将聚团的组织匀浆摇散，成细胞悬液；在消化好的细胞悬液加相同体积的含10％FBS的DMEM来中和酶消化液。吹打20－30次，避免吹出气泡。
e)将中和后的细胞用100um过滤器过滤。过滤过程中用移液管搅动溶液，使其过滤完全。
f)视组织量多少用适量(5～10ml)10％FBS的DMEM(含双抗)冲洗过滤器。
g)1000rpm离心5分钟。弃上清。每管加入10mL不含双抗的F12培养基重悬沉淀，1000rpm离心5分钟。计数并做好记录。
h)取相同数量的分离好的表皮细胞分别用两种培养基进行培养，相同的培养 条件(37℃，5％二氧化碳)培养5天后观察细胞状态。
结果分析：
图2为用传统含血清表皮培养基培养的原代表皮细胞。图2为用本发明人皮肤表皮培养基培养的原代表皮细胞。由图1和图2可以看出，用我们发明的人皮肤表皮细胞培养基培养的原代表皮细胞状态与用含血清的传统表皮培养基培养的原代表皮细胞状态相比，细胞密度、细胞形状大小均无明显差别，均可以形成完整的表皮片。因此，我们研发配制的人皮肤表皮培养基完全可以达到传统的含血清表皮培养基的培养效果。
实例二：采用本发明人皮肤表皮细胞培养基与传统无血清角质培养基(K-sfm)培养的原代表皮细胞形态及细胞数量的比较
材料和方法：
组织来源：医院手术废弃胎儿头皮
细胞培养基：K-sfm培养基、本发明人皮肤表皮培养基
a)将采集的新鲜的组织样本用酒精消毒处理三分钟，进而用含2倍双抗的PBS处理两次，每次3分钟。将组织浸泡于含1倍双抗的F12培养基中4℃保存备用。组织保存时间不高于72小时。
b)组织于浸泡液体中取出，沥净多余液体，称重并作好记录后将组织切成长条状，均匀的平铺于100mm培养皿中，向培养皿中加入浓度为2.5mg/ml的中性蛋白酶(Dispase,neutral protease,grade II,中性蛋白酶，又称分散酶)酶液，每5g皮肤组织中加入20ml酶液，使每一块皮肤组织都完全浸没在酶液中，将皮肤组织于4℃静止孵育过夜。
c)Dispase中孵育过夜的胚胎皮肤从冰箱中取出，用尖形镊子将表皮从真皮小心剥离下来，将表皮转入一个新的培养皿中，沥净多余液体，用手术刀将组织切成均匀的粘稠状。
d)加入胰酶浓度为0.05％的磷酸盐缓冲液(PBS)用于表皮的消化，每5g皮肤组织中加入20ml上述酶液；37℃下消化30分钟，消化过程中不断摇动混匀培养皿，将聚团的组织匀浆摇散，成细胞悬液；在消化好的细胞悬液加相同体积的含10％FBS的DMEM来中和酶消化液。吹打20－30次，避免吹出气泡。
e)将中和后的细胞用100um过滤器过滤。过滤过程中用移液管搅动溶液，使 其过滤完全。
f)视组织量多少用适量(5～10ml)10％FBS的DMEM(含双抗)冲洗过滤器。
g)1000rpm离心5分钟。弃上清。每管加入10mL不含双抗的F12培养基重悬沉淀，1000rpm离心5分钟。计数并做好记录。
h)取相同数量的分离好的表皮细胞分别用两种培养基进行培养，相同的培养条件(37℃，5％二氧化碳)培养3天后观察细胞状态。
结果分析：
图3为用K-sfm表皮培养基培养的原代表皮细胞。图4为用本发明人皮肤表皮细胞培养基培养的原代表皮细胞。由培养的细胞照片可以看出，用我们改良后的人皮肤表皮细胞培养基培养的原代表皮细胞状态与K-sfm表皮培养基培养的原代表皮细胞状态相比，生长相同时间细胞密度更大，细胞状态更好，且更易形成形成完整的表皮片。
实例三：采用本发明人皮肤表皮培养基与传统无血清角质培养基(K-sfm)培养的传代新生儿***表皮细胞形态及细胞数量的比较
材料和方法：
细胞：经过了传代培养的新生儿***表皮细胞
培养基：K-sfm培养基、本发明人皮肤表皮培养基
a)将培养瓶中的旧培养液去掉。
b)每瓶用5～10ml PBS洗一次去除残留的血清。
c)T75flask中加入3ml含EDTA的0.05％胰酶于37度培养箱中消化10min。
d)在显微镜下观察，如果细胞全部脱落，每瓶加10ml含10％FBS的DMEM中和(可轻柔吹打几次)，将全部细胞收集到一个50ml离心管中。
e)1000rpm离心5分钟，弃上清。
f)加10ml含双抗的F12培养基重悬细胞。计数。
g)1000rpm离心5分钟，弃上清。
h)表皮细胞按1:3的比例传代，用两种不同的培养基相同的培养条件(37℃，5％二氧化碳)培养3天后观察细胞状态。
结果分析：
图5为K-sfm表皮培养基培养的传代新生儿***表皮细胞；图6为本发明人 皮肤表皮培养基培养的传代新生儿***表皮细胞。由培养的细胞照片可以看出，用我们发明的人皮肤表皮细胞培养基培养的传代表皮细胞状态与K-sfm表皮培养基培养的传代新生儿表皮细胞状态相比，生长相同时间细胞密度更大，细胞状态更好，且更易形成形成完整的表皮片。由于新生儿表皮细胞具有较强的干细胞特性，经传代后细胞干性不易减弱，所以两种培养基培养的新生儿细胞干细胞特性无较大差异。
实例四：采用本发明人皮肤表皮培养基与传统无血清角质培养基(K-sfm)培养的传代成人***表皮细胞形态及细胞数量的比较
材料和方法：
细胞：经过了传代培养的成人***表皮细胞
培养基：K-sfm培养基、本发明人皮肤表皮培养基
a)细胞密度到90％时用胰蛋白酶收集细胞。将细胞转到15ml离心管计数。
b)1000转离心4分钟。
c)吸掉上清，用培养基重悬细胞并调整细胞浓度为1×106个/ml。
d)在24孔板中每孔加入3×105个细胞，补充培养基至2ml。
e)37℃，CO2培养箱培养1～2天。
f)吸出培养基，每孔用500μl PBS清洗3次。
g)每孔用200～300μl的4％PFA固定20分钟。
h)将4％PFA吸掉，每孔用500μl PBS清洗3次(该步骤中，可将最后一次清洗的PBS留在孔内，并与4℃内保存备用)。
i)用含5％NGS(羊血清)的PBS封闭培养的细胞，然后加入5％NDS+0.2％TX-100，常温处理30分钟(每孔500μl).
j)用PBS清洗1次，500μl/孔。
k)用Anti-Cytokeratin 19antibody-Alexa488(用含5％NGS的PBS1:500稀释)孵育细胞，然后加入5％NDS+0.2％TX-100，常温处理60分钟(每孔300μl)。
l)用PBS清洗3次，500μl/孔。
m)用赫斯特荧光染料或者DAPI(1:10000稀释，4℃保存)常温孵育2～3分钟(每孔500μl)。
n)用PBS清洗3次，500μl/孔。
o)最后一次的清洗液留在孔内
p)荧光显微镜观察细胞染色情况及细胞数量。
结果分析：
图7为用K-sfm表皮培养基培养的传代成人***表皮细胞；图8为用本发明人皮肤表皮培养基培养的传代成人***表皮细胞；图9为用两种表皮培养基培养的成人***表皮细胞经过免疫荧光染色后的照片比较：其中A为K-sfm表皮培养基培养的成人***表皮细胞免疫荧光染色结果；B为本发明人皮肤表皮培养基培养的成人***表皮细胞免疫荧光染色结果。由培养的细胞照片可以看出，用我们发明的新型人皮肤表皮细胞培养基培养的传代成人***表皮细胞状态与K-sfm表皮培养基培养的传代成人***表皮细胞状态相比，细胞培养相同时间后，我们发明的培养基细胞密度更大，且分化细胞较少，而用K-sfm培养的成人表皮细胞传代后细胞密度小，且细胞分化较为严重。细胞角蛋白CK19在未分化的细胞中含量较多，我们发现，经过免疫荧光染色后的两种细胞状态可以看出，用新型培养基培养的成人***表皮细胞CK19的含量要比K-sfm培养基培养的表皮细胞高很多，说明了我们发明的新型表皮培养基培养的成人表皮细胞干细胞特性更强，更利于临床移植治疗各种皮肤创伤。

Claims (5)

1.一种人皮肤表皮细胞培养基，其特征是，以500ml计，各组分及用量如下：
a.最小必须培养基：角质无血清培养基250ml、DMEM培养基125ml、Ham’s F-12培养基125ml；
b.200mML-谷氨酰胺：终浓度1.5mM；
c.牛垂体提取物:终浓度25μg/ml；
d.表皮生长因子:终浓度0.2ng/ml；
e.干细胞生长因子：终浓度30ng/ml；
f.纤维母细胞生长因子：终浓度1.5ng/ml；
g.转化生长因子-β：终浓度0.8ng/ml；
h.血管内皮生长因子：终浓度10ng/ml；
i.100X青霉素-链霉素：终浓度为1X；
j.0.3M氯化钙溶液：终浓度为0.4mM。
2.权利要求1所述人皮肤表皮细胞培养基在人皮肤表皮细胞原代及传代培养中的应用。
3.权利要求2所述人皮肤表皮细胞培养基在人皮肤表皮细胞原代及传代培养中的应用，其特征是，所述人皮肤表皮细胞采集源自胎儿头皮、新生儿***或成人头皮的含有多功能表皮和真皮细胞的组织样本；或者来自任何组织的SOX2基因表达的***和来自任何组织样本有能力形成单克隆的表皮细胞以及冰冻融化后仍可以有能力形成人皮肤的细胞。
4.权利要求2或3所述人皮肤表皮细胞培养基在人皮肤表皮细胞原代培养中的应用，其特征是，步骤如下：
a)将采集的新鲜的皮肤组织样本用酒精消毒处理三分钟，进而用含2倍双抗的PBS处理两次，每次3分钟；将组织浸泡于含1倍双抗的F12培养基中4℃保存备用；
b)组织于浸泡液体中取出，沥净多余液体，称重并作好记录后将组织切成长条状，均匀的平铺于100mm培养皿中，向培养皿中加入浓度为2.5mg/ml的中性蛋白酶，每5g皮肤组织中加入20ml酶液，使每一块皮肤组织都完全浸没在酶液中，将皮肤组织于4℃静止孵育过夜；
c)孵育过夜的皮肤组织从冰箱中取出，用尖形镊子将表皮从真皮小心剥离下来，将表皮转入一个新的培养皿中，沥净多余液体，用手术刀将组织切成均匀的粘稠状；
d)加入胰酶浓度为0.05％的磷酸盐缓冲液用于表皮的消化，每5g皮肤组织中加入20ml酶液；37℃下消化30分钟，消化过程中不断摇动混匀培养皿，将聚团的组织匀浆摇散，成细胞悬液；在消化好的细胞悬液加相同体积的含10％FBS的DMEM来中和酶消化液，吹打20－30次，避免吹出气泡；
e)将中和后的细胞用100um过滤器过滤，过滤过程中用移液管搅动溶液，使其过滤完全；
f)用适量含双抗10％FBS的DMEM冲洗过滤器；
g)1000rpm离心5分钟，弃上清，每管加入10mL不含双抗的F12培养基重悬沉淀，1000rpm离心5分钟，计数并做好记录，
h)取分离好的表皮细胞分别用权利要求1所述培养基37℃，5％二氧化碳条件下进行培养。
5.权利要求2或3所述人皮肤表皮细胞培养基在人皮肤表皮细胞传代培养中的应用，其特征是，步骤如下：
a)取经过了传代培养的新生儿***表皮细胞，将培养瓶中的旧培养液去掉；
b)每瓶用5～10ml PBS洗一次去除残留的血清；
c)T75flask中加入3ml含EDTA的0.05％胰酶于37度培养箱中消化10min；
d)在显微镜下观察，如果细胞全部脱落，每瓶加10ml含10％FBS的DMEM中和，将全部细胞收集到一个50ml离心管中；
e)1000rpm离心5分钟，弃上清；
f)加10ml含双抗的F12培养基重悬细胞，计数；
g)1000rpm离心5分钟，弃上清；
h)表皮细胞按1:3的比例传代，用权利要求1所述培养基37℃，5％二氧化碳条件下培养。
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