CN107428799A - 纯化腺相关病毒(AAV)及/或重组腺相关病毒(rAAV)之方法及其梯度和流通式缓冲液 - Google Patents
纯化腺相关病毒(AAV)及/或重组腺相关病毒(rAAV)之方法及其梯度和流通式缓冲液 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107428799A CN107428799A CN201680005305.9A CN201680005305A CN107428799A CN 107428799 A CN107428799 A CN 107428799A CN 201680005305 A CN201680005305 A CN 201680005305A CN 107428799 A CN107428799 A CN 107428799A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- method described
- continuous flow
- density gradient
- gradient
- viral vector
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Centrifugal Separators (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
Abstract
提供一种纯化病毒载体之方法。该方法包括将非离子密度梯度装载至连续流离心机转子中;采用足以从非离子密度梯度的材料中分离病毒载体及可预测污染物之方式旋转该连续流离心机转子;以及自该连续流离心机转子卸载分离之病毒载体及可预测污染物。
Description
背景
1.发明领域
本发明是关于纯化腺相关病毒(AAV)及/或重组腺相关病毒(rAAV)等病毒载体之方法。更特定言之,本发明是关于使用连续流离心、以非离子密度梯度且最好以单个纯化步骤纯化AAV和/或rAAV之方法。本发明亦涉及用于此类连续流离心方法之密度梯度和流通式缓冲液。
2.技术背景
病毒载体在不同基因疗法应用中用于将遗传物质递送至宿主细胞中。在此类基因疗法应用期间,将遗传物质递送至宿主细胞中使用病毒载体将治疗基因携带至人类细胞中。
病毒载体通过修饰一个或多个病毒而形成,以将所需遗传物质递送至宿主细胞中。例如,一些病毒载体通过将病毒中的致病基因替换为在宿主细胞中提供所需效果的基因来形成。可以替换病毒中之基因,使病毒载体保留其感染和复制能力。
因此,病毒载体的形成最近已集中于已知可感染标靶物种而不引起任何已知疾病之病毒。换言之,病毒载体的形成最近已集中于非病原性病毒。已成为用于研发病毒载体之许多研究焦点的病毒是腺相关病毒(AAV)及/或重组腺相关病毒(rAAV)。为此,多种使用AAV及/或rAAV之基因疗法药物处于研发、临床试验和/或人类试验的不同阶段。
当前可用的纯化技术和技巧可通过使用多种纯化技术递送所需纯度之病毒载体。这些通常采用分析型分批离心技术(例如,管转子离心)和/或层析技术。当分批离心方法采用管转子时,需要进行多次这种分离步骤以处理整个批次/批号之产物。将多次处理所得成果合在一起以提供所需体积的纯化病毒载体。分批离心方法可被视为病毒载体之研究、开发、制造、规模扩大、产品优化及其他用途的瓶颈。因此,对于某些用途,分批离心可能不被视为足够快速及/或具有足够成本效益。
本发明认为我们持续需要比先前可能方法更大量、有效并且成本更低的纯化AAV和/或rAAV的方法。
概要
提供使用连续流离心机纯化AAV及/或rAAV之方法。本发明之连续流离心方法以单个纯化步骤纯化AAV及/或rAAV。本发明所揭示之纯化不仅为AAV及/或rAAV之浓缩,而是去除污染物,包括但不限于蛋白质、DNA、碳水化合物及其他不相关之物质。
在一些实施例中,本发明之单个离心步骤方法纯化之AAV及/或rAAV数量足够用于病毒载体之研究、开发、制造、规模扩大、产品优化及其他用途。
在一些实施例中,该方法利用非离子密度梯度。
非离子密度梯度可选自由以下梯度组成之群组:以商品名市售之梯度、以商品名HistodenzTM和(在本文中称为“碘海醇”)市售之5-(N-2,3-二羟丙基乙酰胺基)2,4,6-三-碘-N-N′-双(2,3-二羟丙基)间苯二甲酰胺梯度、以商品名和(在本文中称为“碘克沙醇”)市售之5,5′-[(2-羟基-1,3-丙烷二基)-双(乙酰亚胺基)]双-[N,N双(2,3二羟丙基)-2,4,6-三碘苯二甲酰胺梯度、以商品名(在本文中称为“甲泛葡胺”)市售之2-({3-(乙酰胺基)-5-[乙酰基(甲基)胺基]-2,4,6-三碘苯甲酰基}胺基)-2-脱氧-D-葡萄哌喃糖梯度、其任何组合。
非离子密度梯度材料可为经调节或未经调节之碘克沙醇水性缓冲溶液。
在一些实施例中,使用含未经调节非离子密度梯度材料之水性缓冲溶液,本发明提供一种可以在存在可预测污染物的情况下纯化AAV及/或rAAV之连续流离心方法。如本文所用,术语“可预测污染物”是指与相关病毒载体(“标靶载体”)共纯化和/或成比例纯化之污染物。在一些情况下,可预测污染物可结合于标靶载体。可预测污染物可为使用SDS-PAGE检测为单条带(例如在约40千道尔顿(kDa))之一种或多种污染物,也可为检测为多条带(例如,15-45kDa)之多种污染物。
在一些实施例中,使用含经调节非离子密度梯度材料之水性缓冲溶液,术语“经调节”是指非离子密度梯度材料包括一种或多种未被选择用于特定促成梯度密度的调节剂,例诸如缓冲液、pH调节剂或其他组分(例如,界面活性剂层)、助溶剂、稳定剂、离子或阴离子界面活性剂、离子或阴离子清洁剂、离子或阴离子盐及其任何组合。此外,术语“经调节”是指非离子密度梯度材料包括调节剂,及/或与非离子密度梯度材料一起使用之流通式缓冲液包括调节剂,及/或携带标靶载体之材料或溶解物包括调节剂,及其任何组合。
如此处所用,经选择作为调节剂的材料(这些材料不用于促成梯度密度)是指材料将不特定改变梯度形状或整体梯度坡度以产生所需梯度形状。例如,20%w/v CsCl溶液之密度为1.149g/cm3,而预期的AAV及/或rAAV等密度带状浓度被理解为1.38g/cm3。因此,可将高达约40%w/v浓度之CsCl作为调节剂添加至梯度中,而不会影响本申请案意义内梯度材料之密度。
虽然某些材料可被视为密度梯度介质,但本发明认识到,这些相同介质对纯化方法具有其他益处。这些调节剂在典型应用中可具有密度梯度功能,但以本申请所指定的量添加至梯度是用作梯度调节剂,改变可预测污染物与标靶载体之间的关系。例如,我们认为CsCl及/或NaCl可向密度梯度提供足够电离电位,这可以改变蛋白质:蛋白质、蛋白质:DNA、蛋白质:碳水化合物之共纯化相互作用及其他关系,但不一定改变梯度密度。
本文所揭示之纯化方法即使在使用未经调节之梯度时,也不需要汇集多个连续流离心步骤或多次管转子操作。实际上,本发明之方法提供单个步骤单密度梯度连续流离心方法,在有可预测污染物或没有可预测污染物的条件下纯化AAV及/或rAAV。
在一特别优选之实施例中,密度梯度为最大密度为50%w/v的碘克沙醇水性缓冲溶液经调节之碘克沙醇梯度。在一些实施例中,用氯化铯(CsCl)、氯化钾(Kcl)、氯化钠(NaCl)及其任何组合中之一种或多种形式的离子盐调节梯度。
提供一种纯化病毒载体之方法。该方法包括将非离子密度梯度装载至连续流离心机转子中;采用足以从非离子密度梯度的材料中分离病毒载体及可预测污染物之方式旋转连续流离心机转子;以及自该连续流离心机转子卸载分离之病毒载体及可预测污染物。
在单独或与上述或下述实施方案组合的一些实施例中,材料为包括病毒载体之溶解物。
在单独或与上述或下述实施方案组合的一些实施例中,非离子密度梯度为碘克沙醇溶液和水性缓冲液。
在单独或与上述或下述实施方案组合的一些实施例中,水性缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在单独或与上述或下述实施方案组合的一些实施例中,非离子密度梯度是每体积1-60重量%(%w/v)的碘克沙醇溶液和水性缓冲液。
在单独或与上述或下述实施方案组合的一些实施例中,非离子密度梯度是25-50%w/v的碘克沙醇溶液和水性缓冲液。
在单独或与上述或下述实施方案组合的一些实施例中,碘克沙醇是有25%w/v层和50%w/v层的两层阶梯式梯度。
在单独或与上述或下述实施方案组合的一些实施例中,分离之病毒载体包含材料中至少47%(在一些实施方案中高达65%)之病毒载体。
在单独或与上述或下述实施方案组合的一些实施例中,旋转连续流离心机转子之步骤中进一步包括旋转时有足以从材料去除可预测污染物的调节剂。调节剂可包括在非离子梯度、流通式缓冲液及材料中之一或多者中。
在单独或与上述或下述实施方案组合的一些实施例中,调节剂选自由以下物质组成之群组:氯化铯(CsCl)、氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、Nycodenz、蔗糖、甘油、葡萄糖、溴化钾(KBr)及其任何组合。在调节剂为CsCl之实施方案中,CsCl之浓度可以高达40%w/v、更优选之浓度为20%w/v,也可为其之间的任何子范围。
在单独或与上述或下述实施方案组合的一些实施例中,分离之病毒载体包含材料中至少21%之病毒载体。
在单独或与上述或下述实施方案组合的一些实施例中,病毒载体为腺相关病毒(AAV)和重组腺相关病毒(rAAV)中之至少一种。
在单独或与上述或下述实施方案组合的一些实施例中,将非离子密度梯度装载至连续流离心机转子中的步骤包括以下中之一或多者:静态梯度装载或动态梯度装载、静态梯度卸载或动态梯度卸载、定向非离子密度梯度之步骤及装载混合梯度或线性梯度。
在单独或与上述或下述实施方案组合的一些实施例中,该方法进一步包括进行第二次离心步骤,自分离之病毒载体中移除可预测污染物。第二次离心步骤可为连续或非连续离心。第二次离心步骤可包括使用具有足以移除可预测污染物之离子调节剂的梯度。
亦提供一种纯化病毒载体之方法,包括将非离子密度梯度装载至连续流离心机转子中;将包括病毒载体之材料装载至连续流离心机转子中;采用足以从非离子密度梯度的材料中分离病毒载体之方式旋转连续流离心机转子;以及自该连续流离心机转子卸载分离之病毒载体。在此实施例中,病毒载体为AAV和rAAV中至少一者。
在单独或与上述或下述实施方案组合的一些实施例中,旋转连续流离心机转子之步骤中进一步包括旋转时有足以从材料移除可预测污染物的调节剂。
在单独或与上述或下述实施方案组合的一些实施例中,非离子密度梯度包括足以从材料中移除可预测污染物的调节剂。
在单独或与上述或下述实施方案组合的一些实施例中,旋转时使用流通式缓冲液,流通式缓冲液包括足以从材料中去除可预测污染物的调节剂。
在单独或与上述或下述实施方案组合的一些实施例中,材料包括足以从材料中移除可预测污染物的调节剂。
在前文提及之包括调节剂的实施例中,调节剂可为浓度高达40%w/v之CsCl。
进一步提供一种纯化病毒载体之方法,包括将非离子密度梯度装载至连续流离心机转子中,非离子密度梯度包括25-50%w/v之碘克沙醇溶液和PBS;将包括病毒载体之材料装载至连续流离心机转子中,其中病毒载体为AAV和rAAV中之至少一者;在浓度为高达40%w/v之CsCl存在下以足以在非离子密度梯度中从材料中分离病毒载体之方式旋转连续流离心机转子;及自连续流离心机转子卸载分离之病毒载体,其中分离之病毒载体包含该材料中至少21%的病毒载体。
在单独或与上述或下述实施方案组合的一些实施例中,非离子密度梯度包括CsCl。
在单独或与上述或下述实施方案组合的一些实施例中,旋转时使用流通式缓冲液,流通式缓冲液包括CsCl。
在单独或与上述或下述实施方案组合的一些实施例中,材料包括CsCl。
进一步提供一种纯化病毒载体之方法,包括将非离子密度梯度装载至连续流离心机转子中,非离子密度梯度包括25-50%w/v之碘克沙醇溶液和PBS;将包括病毒载体之材料装载至连续流离心机转子中,其中病毒载体为AAV和rAAV中之至少一者;以足以在非离子密度梯度中从材料中分离病毒载体和可预测污染物之方式旋转连续流离心机转子;及自连续流离心机转子卸载分离之病毒载体。分离之病毒载体包含材料中至少47%(在一些实施例中高达65%)的病毒载体。
提供一种用于连续流离心之密度梯度。梯度包括选自25或50%w/v群组的碘克沙醇;高达40%w/v之CsCl;及水性缓冲液。
在单独或与上述或下述实施例组合的一些实施例中,梯度进一步包括100mM柠檬酸钠。
在单独或与上述或下述实施例组合的一些实施例中,水性缓冲液包括PBS。
在单独或与上述或下述实施例组合的一些实施例中,碘克沙醇的量可为25%w/v及/或50%w/v。
在单独或与上述或下述实施例组合的一些实施例中,CsCl的量可为20%w/v。
提供一种用于连续流离心之流通式缓冲液,包括水性缓冲液、柠檬酸钠及CsCl。
在单独或与上述或下述实施例组合的一些实施方案中,柠檬酸钠是100mM柠檬酸钠。
在单独或与上述或下述实施例组合的一些实施方案中,水性缓冲液包括PBS。
在单独或与上述或下述实施例组合的一些实施方案中,CsCl的量可高达40%w/v或20%w/v。
熟习此项技术者将根据以下详细说明、图示以及所附权利要求书了解及理解本发明之上述及其他特征和优点。
图示简要说明
本申请案包含至少一幅彩制图示。在申请且支付必要的费用后,专利局将提供具有彩色图示的本专利或专利申请公开案的副本。
图1为根据本发明纯化方法之示例性实施例的流程图;
图2为图1纯化方法之示意性描述;
图3为说明实验A之结果的图;
图4为说明实验B之结果的图;
图5为说明实验C之结果的图;
图6为图5中实验C之十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和SimplyBlueTM染色之图像;
图7为说明实验D之结果的图;
图8是图7中实验D溶离份之SDS-PAGE和SimplyBlueTM染色之图像;
图9为说明实验E之结果的图;
图10为图9中实验E溶离份之SDS-PAGE和SimplyBlueTM染色之图像;
图11为说明实验G之结果的图;
图12为图11中实验G溶离份之SDS-PAGE和SimplyBlueTM染色之图像;
图13为说明实验H之结果的图;
图14为图14中实验H溶离份之SDS-PAGE和SimplyBlueTM染色之图像;
图15为说明实验I之结果的图;
图16为图15中实验I溶离份之SDS-PAGE和SimplyBlueTM染色之图像;
图17为说明实验J之结果的图;
图18为图17中实验J溶离份之SDS-PAGE和SimplyBlueTM染色之图像;
图19为说明实验K之结果的图,该实验将实验H所用之另一半溶离份暴露于连续流离心步骤;
图20为图19中实验K溶离份之SDS-PAGE和SimplyBlueTM染色之图像;
图21为碘克沙醇梯度中管转子离心后的溶离份之SDS-PAGE和SimplyBlueTM染色之图像;
图22为在透析纯化步骤之后从实验H获得的溶离份之SDS-PAGE和SimplyBlueTM染色之图像;
图23为用氯化铯调节剂进行额外管转子离心后溶离份之SDS-PAGE和SimplyBlueTM染色之图像;
图24为用氯化铯调节剂进行管转子离心后溶离份之SDS-PAGE和SimplyBlueTM染色之图像;
图25为说明实验L之结果的图;
图26为图25中实验L溶离份之SDS-PAGE和SimplyBlueTM染色之图像;
图27为说明实验M之结果的图;
图28为图27中实验M溶离份之SDS-PAGE和SimplyBlueTM染色之图像;
图29为说明实验N之结果的图;
图30为图29中实验N溶离份之SDS-PAGE和SimplyBlueTM染色之图像;以及
图31为比较实验C、D、H、K、L、M、E、G、I及J之表。
详细说明
参见图示,特别是图1和2,其中展示了根据本发明纯化方法之示例性实施例。本发明方法使用连续流离心来纯化AAV及/或rAAV。然而,本发明亦涵盖该方法不受所用血清型影响,因此可应用于一系列AAV、rAAV或任何其他载体类型。
如本文所用,术语连续流离心一般应指通过含有在高速操作期间维持在转子内的密度梯度之转子连续传送待分离之样品流体或材料(以下称作“材料”),即含有标靶载体(诸如AAV及/或rAAV)及一种或多种污染物之材料。在这种通过转子之材料连续流动结束时,转子可停止并且可自转子中移除在密度梯度中捕获的纯化之标靶载体。此类“连续流离心”通常亦指区带或区段离心或超速离心。适合离心装置包括AW Promatix 1000TM、AW PKII及AW KII,可向本发明之申请人购买。
因此,本发明之连续流离心方法可每小时处理几十公升材料或更多,其与先前技术之分批或管离心技术形成鲜明对比。
在不希望受任何特定理论束缚的情况下,已知AAV和/或rAAV具有小尺寸,诸如约20纳米(nm),本发明相信该尺寸使得连续流离心与分析型分批离心技术相比困难。由于AAV之小基因组(亦即,4.8千碱基),仅小基因可编码至AAV中。在不希望受任何特定理论束缚的情况下,相信此小尺寸意味着由基因***引起的任何AAV结构变化(AAV转化为rAAV)将为足够小而不改变纯化。因此,相信AAV将以与rAAV纯化一致的方式纯化。另外,本发明亦相信反之为真实的,亦即相信rAAV以与AAV纯化一致的方式纯化。
本发明方法提供一种密度梯度,其在连续流离心之速度及条件下保持稳定,又具有足够密度范围以允许在具有可预测污染物或不具有可预测污染物的情况下以单个步骤纯化AAV和/或rAAV。
再次参见图1和2,根据本发明之一种示例性方法包括第一或梯度装载步骤、第二或梯度定向步骤、第三或材料流动步骤、第四或标靶载体聚集成带的步骤、第五或转子减速步骤、第六或梯度重新定向步骤及第七或带状标靶载体卸载步骤。
应认识到,图1和2之连续流离心方法借助于实例描述为一种包括例如静态梯度装载、静态梯度卸载及装载未混合(例如,不连续)或分层(例如,阶梯)梯度之方法。亦涵盖本发明之连续流离心方法包括任何连续流方法步骤,诸如(但不限于)动态梯度装载、动态梯度卸载、装载混合或线性(例如,连续)梯度及其任何组合。
在第一或梯度装载步骤期间,将非离子密度梯度及缓冲溶液抽吸至离心机转子中。转子可有任何所需配置,诸如(但不限于)可购自本发明之申请人的K3转子,以及K6、K10、PK3、PK3-400、PK3-800、PK6、PK10、PX-55ml、PX-120ml、PX-230ml及其他中之一或多者。
非离子密度梯度可为任何非离子密度梯度,诸如(但不限于)碘海醇、碘克沙醇、甲泛葡胺及其任何组合。在一个较佳实施例中,非离子密度梯度为碘克沙醇。此实施例中之密度梯度包括每体积1至60%重量(%w/v)碘克沙醇溶液与水性缓冲液,其中25至50%w/v较佳,且其中50%w/v最大密度最佳。
在单独或与前述或后述实施例中之一或多者组合的其他实施例中,非离子密度梯度为经调节之碘克沙醇密度梯度。在本文中,非离子密度梯度可包括调节剂。
在一些实施例中,调节剂呈离子调节剂形式,诸如(但不限于)呈氯化铯(CsCl)、氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)及其任何组合中之一或多者的形式之盐。离子调节剂之浓度可为20mM至5M。
在单独或与前述或后述实施例中之一或多者组合的其他实施例中,非离子密度梯度可包括离子或阴离子界面活性剂和/或清洁剂之形式的调节剂,诸如(但不限于)以市售之聚山梨醇酯、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲铵基]-1-丙磺酸盐)、NP-40Tergitol型NP-40及浓度为0.05%w/v至7%w/v之
在单独或与前述或后述实施例中之一或多者组合的其他实施例中,非离子密度梯度可包括总计高达40%w/v百分比或浓度为例如高达2M之其他调节剂,诸如(但不限于)碘海醇、甲泛葡胺、蔗糖、甘油、葡萄糖、溴化钾(KBr)、氯化铯(CsCl)及其任何组合。
在一尤其较佳实施例中,密度梯度为在经CsCl调节之水性缓冲溶液中25%及50%w/v之经调节碘克沙醇梯度。
在第二或梯度定向步骤期间,转子以足以使非离子密度梯度及缓冲溶液自第一步骤之水平方向定向至垂直方向之逐渐递增速度旋转,其中具有较高密度之非离子密度梯度接近转子之外壁,而具有较低密度之缓冲溶液接近转子之旋转中心。
换言之,本发明方法在第一步骤中以不连续方式装载非离子密度梯度,但在加速度后,密度梯度变为线性或连续的;有效的是,步骤汇集且形成连续梯度。在某些情形中,梯度之线性化可在加速度阶段、产品流阶段开始时发生,或可在产品装载期间发生,或直至操作之制动阶段才发生。通常,线性化在达到操作最大/设定速度后发生。
在定向密度梯度后,在慢加速阶段期间达到约3,500rpm(亦即,约1,000×g)或其近似值,转子之最大加速度开始到达足够用于纯化之预定速度,在第三或材料流动步骤期间将其中悬浮有AAV和/或rAAV之材料抽吸至转子中。在第三或材料流动步骤期间,经由转子连续抽吸材料。在第四步骤期间,在标靶载体聚集成带时流通式缓冲液经由密度梯度流通,其中标靶载体(亦即,AAV和/或rAAV)径向沉降至梯度中且在梯度密度接近或等于标靶载体之浮力密度的区域中的等密度聚集成带。流通式缓冲液通过转子且在新缓冲液抽吸至转子中时离开转子。
在密度梯度为最大密度为60%w/v之碘克沙醇且材料包括AAV和/或rAAV之一个示例性实施例中,AAV和/或rAAV以32至48%w/v、更通常以35至47%w/v聚集成带。在本文中,本发明涵盖以5毫升/分钟(mL/min)至100mL/min之流动速率抽吸材料,且转子之体积为120mL至3.2L或更大。较佳地,转子及过程在此等体积之间为可扩展的,意味着标靶载体在密度梯度中之相同密度位置聚集成带,且密度梯度在各操作规模下基本上具有相同分离范围和能力,不管转子尺寸和/或经由转子抽吸之材料的流动速率如何,至少具有梯度曲线形状及密度范围之相同特征。
在预定时刻,诸如在已确定密度梯度装载有所需量之材料时,在第四或聚集成带的步骤期间材料之装载停止且连续装载流通式缓冲液。随后,在第五或转子减速步骤期间在快速阶段随后之较慢阶段中降低转子速度以允许密度梯度重新定向,随后达到停止或静止位置。在第六步骤较慢减速结束阶段期间,密度梯度将重新定向至原始位置而不干扰在密度梯度中捕捉之AAV和/或rAAV的条带。
最后,在第七或带状标靶载体卸载步骤期间,可以已知方式自连续流离心机转子卸载带状AAV和/或rAAV。
在不希望受任何特定理论束缚的情况下,相信用于AAV和/或rAAV之小规模分批或管离心方法的梯度(密度或其他)(诸如CsCl)虽然具有所需密度范围,但缺乏由本发明确定为AAV和/或rAAV纯化所需之稳定性。本发明所揭示浓度之密度梯度(诸如碘克沙醇)已被证实具有用于在单个步骤中AAV和/或rAAV纯化之所需稳定性及密度。
在一些实施例中,本发明已确定在碘克沙醇密度梯度中纯化AAV和/或rAAV可导致亦在AAV和/或rAAV之较佳聚集成带的密度范围下捕捉可预测污染物。
在一些实施例中且取决于纯化AAV和/或rAAV之最终用途,可预测污染物取决于纯化之AAV和/或rAAV的最终用途可在可接受参数范围内。
在其他实施例中且取决于纯化AAV和/或rAAV之最终用途,可预测污染物可不在可接受参数范围内,但可在一个或多个后续纯化步骤中移除,该等步骤包括(但不限于)管转子离心、透析纯化、层析纯化和/或连续流离心。
仍在其他实施例中且取决于纯化AAV和/或rAAV之最终用途,本发明涵盖在碘克沙醇密度梯度中借由单个步骤连续流离心移除可预测污染物。举例而言,已确定可使用本文中论述之经调节梯度中之一或多者来移除(亦即,在不同位置自碘克沙醇密度梯度和/或缓冲溶液中之AAV和/或rAAV捕捉)可预测污染物。因此,本发明已确定仅使用本文所揭示之经调节之非离子密度梯度,本发明方法可提供单个步骤连续流离心来纯化AAV和/或rAAV。
本文所揭示之纯化不仅为载体浓缩,而是纯化方案中不相关之污染物的移除。在一些实施例中,本发明方法提供与由采用多个CsCl梯度之小规模分批或管离心纯化提供的AAV和/或rAAV纯度相同或比其更好的AAV和/或rAAV纯度。
另外,本文所揭示之纯化即使在使用经调节之梯度时亦不需要多个离心步骤。实际上,本发明方法提供单个步骤之单密度梯度连续流离心方法来纯化AAV和/或rAAV。
在制备本文所揭示之实验中,将可购自Expression System,LLC之Sf9细胞培养物在摇瓶中在28℃下在亦可购自Expression Systems之补充有100个单位/毫升青霉素及100微克/毫升(μg/ml)链霉素(可购自Mediatech,Inc)之ESF921培养基中培养。在细胞密度达到1×107个细胞/毫升后,Sf9细胞1∶5***以便维护。
将Sf9细胞培养至约8×106个细胞/毫升且用新鲜ESF921培养基1∶1稀释以用于载体生产。使用重组杆状病毒Bac-inCap2-inRepOpt及Bac-CMV-GFP来感染经稀释之细胞3天,同时收集细胞集结粒。若不立即使用,则将细胞集结粒储存在-80℃下。将细胞集结粒溶解于SF9溶解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.8)、50mM NaCl、2mM MgCl2、1%w/v月桂酰基肌胺酸钠(亦称为肌胺酰)、0.5%w/vX-100及140个单位/毫升)中。基因组DNA借由在37℃下培育一小时来消化。借由在8,000rpm(亦即,10,322×g)下离心30分钟来移除细胞碎片。收集澄清细胞溶解物(亦即,材料)且用于连续流离心。收集溶离份,并借由表示为病毒基因组(vg)数量的定量PCR(QPCR)方法来测定AAV2载体(在本文中称为“rAAV”)之数量。
为测试纯化结果,使用SDS-PAGE、银染色及SimplyBlueTM染色来验证rAAV纯度。此处,使rAAV与可购自英杰(Invitrogen)之SDS-PAGE装载缓冲液混合,且在95℃下加热5分钟。随后将载体装载至10%SDS-PAGE Tris-甘胺酸凝胶(英杰)上且在100V下运作直至染料到达凝胶底部。根据制造商之方案(英杰)使凝胶染色。
实验A
自文献已知AAV和/或rAAV在CsCl梯度中之管转子离心产生许多应用可接受之纯度。亦已知许多适合于分批或管转子离心之梯度材料不适合于连续流离心。
现参见图3,设计初始实验来测试使用AW Promatix 1000TM之连续流方法中之CsCl梯度形成。此处,CsCl梯度溶液经制备而含有30%w/v蔗糖以借由增加黏度来增加梯度稳定性。使用120ml转子并将速度设定为26,000rpm(亦即,49,950×g)。随后,装载30ml低密度CsCl(1.3g/cc),随后装载38ml高密度CsCl(1.5g/cc),亦即图1之步骤1。缓冲液装载及冲洗速率设定为5ml/min,亦即图1之步骤3和4,其中不装载AAV或rAAV。在操作速度下运作10分钟(图1之步骤4)后,使离心机减速,且在***静止后,收集4ml体积溶离份。
CsCl溶离份之所得密度展示于图3中。在不希望受任何特定理论束缚的情况下,本发明相信AAV或rAAV将在1.38-1.41g/cc之CsCl密度下等密度聚集成带,使得此处所收集之溶离份低于AAV或rAAV聚集成带所需之密度。因此,相信图3中实验A之密度曲线缺乏在AAV或rAAV之连续流离心时维持等密度聚集成带所需之密度的所需稳定性。
此处,自CsCl运作观测到在离心期间,CsCl之总量相对于固定梯度相而言发生损失。此由以下事实证明:转子中CsCl之最大密度不维持在与装载浓度相同的密度下。此被视为归因于在运作期间之梯度“洗出”,其中连续流相与固定梯度相之间的界面不稳定,且有梯度不断移除至流通中且缓冲液进入固定相中。
实验B
现参见图4,重复实验A以证实CsCl梯度形成以用于连续流离心。再次且如自结果可见,尽管1.5g/cc CsCl用于高密度梯度,具有最高密度之溶离份仍未达到1.38g/cc临限值,意味着若AAV或rAAV已用于此测试,则标靶载体将尚未形成等密度条带。
实验C
在实验A及实验B之结果之后且仍不希望受任何特定理论束缚,如图5和6中所展示在连续流离心中尝试碘克沙醇梯度用于rAAV纯化。
此处,使用120-ml转子且速度设定为35,000rpm(亦即,90,500×g)。在蒸馏水中自68ml 50%w/v碘克沙醇制备梯度。使用总计100ml溶解物(批号12-303,总计2.29e+15vg)。材料装载速率(图1之步骤3)设定为5ml/min,且聚集成带或离心时间(图1之步骤4)为2小时。实验C之结果展示于图5中。约13%之所装载rAAV流通损失,且溶离份C4至C11中之产率为所装载rAAV之24%。因此,在连续流离心方法中可见大多数所装载rAAV在流通中损失或借由聚集或失活而损失。
图5之数据和图说明,与装载作为载体基因组(vg)之rAAV的总量相比,载体基因组中在各溶离份已收集之rAAV量。
图6之SDS-PAGE分析比较来自色带M、色带C、色带L、色带F及色带5至12之结果。
色带M说明用于尺寸参考之分子量标记。色带L表示在实验期间所用之溶解物,其为纯化提供基线。色带F说明在缓冲阶段之连续流装载期间已一次通过离心机转子之流通式材料。
色带C说明溶解物之对照纯化(“对照”)。对照色带(色带C)之溶离份在本文中用作基线,相对于其比较纯度。对照系使用管转子及CsCl梯度借由已知之AAV或rAAV纯化方法获得。
色带C5至C12表示图5中编号之收集溶离份,其中由VP1、VP2及VP3表示之条带指示标靶载体(亦即,AAV和/或rAAV)之条带。
为清楚起见,如本文所用之术语“纯度”及“产率”系参考图5和6中所展示之实验C的结果来论述。
自图6可见色带C5及C6中之溶离份在包括或不包括污染物的情况下,主要由如载体蛋白VP1、VP2、VP3所展示之所收集标靶载体表示。色带C5及C6中之溶离份包括实质上纯形式之标靶载体。因此,图6之SDS-PAGE提供纯度之定性测量,证实标靶载体(VP1、VP2和VP3)自溶解物分离。
相比之下,色带C7至C12中之溶离份则说明标靶载体之回收率或产率比色带C5及C6更好,此等色带亦包括一种或多种污染物。因此,图6之SDS-PAGE分析指示在使用碘克沙醇密度梯度之单一连续流离心之后在至少色带C5及C6中大多数污染物自rAAV移除。
可见图6说明已收集在15kDa及低于15kDa之一些材料。在不希望受任何特定理论束缚的情况下,相信所收集之低于15kDa之材料表示可随样品制备而变且在标靶载体之下游用途/处理中可不为有害或另外不希望的非特异性片段和/或降解产物(在本文中称为“碎片”)。在一些实施例中,纯度之定义忽略了碎片之存在。
术语“产率”应意味着所收集之标靶载体(亦即,AAV和/或rAAV)作为所有色带之载体基因组中装载之总载体的函数之百分比。在一些实施例中,仅符合所需纯度之彼等色带被视为“纯化产率”。以图形方式,“产率”在图5中展示为rAAV效价曲线下之整个区域,其表示约24%之总装载载体,而色带C5及C6之结果可视为提供“纯产率”,其表示约4%之总装载载体。如本文所用之产率在一些情况下亦表示为方法之回收率。
图6亦可用于更好理解如上文所定义之术语“可预测污染物”。观察色带C8至C10,可见随着如由载体蛋白(VP1、VP2和Vp3)表示之标靶载体的数量增加,在约40kDa下之特定污染物的量亦如此增加。观察色带C11及C12,可见随着如由载体蛋白(VPl、VP2和Vp3)表示之标靶载体的数量减少,在约40kDa下之特定污染物的量亦如此减少。因此,在实验C中可观测到在约40kDa下之特定污染物为可预测的,或与标靶载体共纯化,亦即为可预测污染物。
返回如本文所用之术语“纯度”或“纯”之时刻,本发明在一些实施例中涵盖可能可接受用于标靶载体之特定下游纯化之可预测污染物。在此等实施例中,纯度之定义包括以分离之病毒载体的百分比计算而所收集之可预测污染物(亦即,产率包括分离之病毒载体及可预测污染物,但不包括任何其他污染物)。
实验D
基于上述实验C的结果,使用两个密度梯度层的碘克沙醇来观察是否可以移除更多污染物,所有材料均在蒸馏水中制备。装载25ml 25%w/v碘克沙醇的低密度层及58ml50%w/v碘克沙醇高密度层。使用120ml转子,并制备新一批细胞溶解物(批号14-130,共2.09e+14vg)。速度设定为35,000rpm(亦即,90,500×g),聚集成带时间(图1之步骤4)为2小时。材料装载速率为5ml/min(图1之步骤3),流通式缓冲液之冲洗速率(图1之步骤4)为5ml/min(图1之步骤7)。
结果见图7和8。此处,可见溶解物中rAAV浓度比先前溶解物低10倍。虽然存在陡峭的rAAV纯化曲线,但自D6至D12所收集之溶离份之产率或回收率仅为12%。然而且由于使用低rAAV效价,图8之SDS-PAGE未显示rAAV的清晰载体蛋白(VP1、VP2、VP3)条带。
图8之SDS-PAGE分析表明,在单一连续流离心后,至少色带D5至D7中大多数污染物自rAAV移除。换言之,色带D5至D7中之溶离份包括纯形式之标靶载体。此处,约15%之所装载rAAV流通损失,且溶离份D2至D12中之回收率或产率为所装载rAAV之12%。
实验E
随后,使用230-ml转子重复使用如实验D中之两层梯度的测试,以判定实验D之结果是否可按比例线性调整以用于rAAV纯化。此处,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液制备两层碘克沙醇溶液。在230-ml转子中装载40ml 25%w/v及98ml 50%w/v碘克沙醇(图1之步骤1)。速度设定为35,000rpm(亦即,90,500×g),聚集成带时间为2小时(图1之步骤4)。材料装载速度为10ml/min(图1之步骤3),流通式缓冲液冲洗速率设定为5ml/min(图1之步骤7)。装载总计160ml溶解物(批号14-130)。
结果见图9和10。自结果可见获得陡峭rAAV纯化曲线。当在PBS中制备碘克沙醇时,自E5至E9所收集之溶离份之回收率为65%w/v。图10之SDS-PAGE清晰地显示了rAAV,表明与实验D相比回收率或产率更佳。
图10之SDS-PAGE分析表明,在单一连续流离心后,至少色带E5至E7中大多数污染物自rAAV移除。换言之,色带E5至E7中之溶离份包括纯形式之标靶载体。此处,约22%之所装载rAAV流通损失,且溶离份E2至E11中之产率为所装载rAAV之65%。
自实验E可见,使用PBS缓冲液而非如实验C及D中之蒸馏水制备碘克沙醇梯度,可以提供更高产率。然而,实验E亦显示可预测污染物仍然存在,其在实验C及D中以约40kDa存在。由于在比较时,在120ml及230ml转子中形成的梯度与在相同位置聚集成带之病毒载体实质上相同且梯度坡度类似,因此本文所揭示之纯化方法在不同体积的芯之间可扩展。
实验G
在实验G中,将来自实验C之溶离份C3至C12汇集以提供总计42.5ml。汇集溶液之折射率为1.3951,对应约33%w/v之碘克沙醇。将材料稀释3次以使碘克沙醇之浓度降低至约10%w/v,并进行第二次离心以确定rAAV纯度是否可提高。使用120-ml转子且速度设定为35,000rpm(亦即,90,500×g)。装载25ml 25%w/v及58ml 50%w/v碘克沙醇(图1之步骤1)。装载总计127.5ml之稀释材料(图1之步骤3)。材料装载速率(图1之步骤3)及缓冲液冲洗速率(图1之步骤7)设定为5ml/min。聚集成带时间(图1之步骤4)设定为2小时。
实验G之结果见图11和12,表明第二次连续流离心产生纯rAAV。
图12之SDS-PAGE分析表明,在第二次连续流离心后,色带G5至G12中大多数污染物自rAAV移除。换言之,色带G5至G12中之溶离份包括纯形式之标靶载体。此处,约45%之所装载rAAV流通损失,且色带G5至G12中之溶离份之回收率为所装载rAAV之49%(亦即,纯或分离之病毒载体之49%产率)。
图12进一步表明,在15kDa下及低于15kDa存在碎片,但似乎缺乏实验C中表明之可预测污染物。
实验H
在实验H中,生产另一批rAAV溶解物,亦即批号14-172,且使用120-ml转子进行离心操作。速度设定为35,000rpm(亦即,90,500×g),聚集成带时间(图1之步骤4)为2小时。梯度包括25ml 25%w/v碘克沙醇及58ml 50%w/v碘克沙醇。使用总计95ml之溶解物(总计rAAV 1.25e+15vg)。材料装载(图1之步骤3)及流通式缓冲液冲洗速率(图1之步骤7)设定为5ml/min。制备PBS缓冲液及碘克沙醇,使其含100mM柠檬酸钠。在不希望受任何特定理论束缚的情况下,在实验C至G中观测到之产率变化可能是由于标靶载体之聚集。因此,实验H已包括柠檬酸钠以试图使聚集减至最少程度。
实验H之结果见图13和14。图14之SDS-PAGE分析表明,在单一连续流离心后,色带H5至H8中大多数污染物自rAAV移除。换言之,色带H5至H8中之溶离份包括实质上纯形式之标靶载体。
应指出,色带H5至H8包括低于15kDa之碎片及约40kDa之可预测污染物(出于测定实验H之产率目的已酌减)。此处,约32%之所装载rAAV流通损失,且溶离份H2至H11中之回收率为所装载rAAV之55%。
亦应指出,如图13及14之结果所示,实验H之柠檬酸钠被认为减少了标靶载体聚集。
实验I
借由另一类似操作,将来自实验E之溶离份(亦即批号14-130)汇集在一起获得67ml rAAV溶液,并稀释10倍以使碘克沙醇浓度降低至约3%(w/v)。进行实验I来测试如果降低材料中碘克沙醇之浓度是否将使rAAV能够更易于进入密度梯度相,并使损失至离开转子之流通式缓冲液中的rAAV减至最小。使用120-ml转子,且速度设定为35,000rpm(亦即,90,500×g),且添加25ml 25%w/v及58ml 50%w/v之碘克沙醇。材料装载流动速率设定为10ml/min,且流通式缓冲液冲洗速率为5ml/min。聚集成带时间为2小时。
实验I之结果见图15和16。图16之SDS-PAGE分析表明,在第二次连续流离心后,色带I7和I8中大多数污染物自rAAV移除。换言之,色带I7和I8中之溶离份包括纯形式之标靶载体。
应指出,色带I5至I12包括低于15kDa之碎片及在25至35kDa聚集成带之可预测污染物,出于测定实验I之产率目的已酌减。此处,约7%之所装载rAAV流通损失,且溶离份I2至I11中之回收率为所装载rAAV之4%。在不希望受任何特定理论束缚的情况下,实验I之低回收率被认为至少部分归因于所装载rAAV之低浓度,这是因汇集实验E及另一类似操作之结果所致。
实验J
来自实验H之溶离份汇集达到43ml,且使用120-ml转子进行第二次离心。在含有100mM柠檬酸钠之PBS缓冲液中,将材料稀释10倍至体积430ml。速度设定为35,000rpm(亦即,90,500×g)且聚集成带时间为2小时,并装载68ml 50%w/v碘克沙醇。材料装载及缓冲液冲洗速率设定为5ml/min。
实验J之结果见图17和18。图18之SDS-PAGE分析表明,在第二次连续流离心后,色带J5至J9中大多数污染物自rAAV移除。换言之,色带J5至J9中之溶离份包括纯形式之标靶载体。
应指出,色带J9至J12包括低于15kDa之碎片及在40至35kDa聚集成带之可预测污染物(出于测定实验J之产率目的已酌减)。此处,约24%之所装载rAAV流通损失,且溶离份J2至J11中之回收率为所装载rAAV之43%。
实验G、I及J之结果说明第二次离心步骤为不必要的,使得本申请案之方法可以通过单个步骤提供所需纯度之AAV及/或rAAV。
实验K
在实验K中,使用来自批号14-172之另一半批rAAV溶解物,用120-ml转子重复实验H之离心操作。离心速度设定为35,000rpm(亦即,90,500×g),且允许密度梯度定向及线性化。聚集成带时间为2小时,且装载25ml 25%w/v及58ml 50%w/v之碘克沙醇。使用总计95ml之溶解物(总计rAAV 1.25e+15vg)。材料装载及缓冲液冲洗速率设定为5ml/min。制备PBS缓冲液及碘克沙醇,使其含有100mM柠檬酸钠以辅助防止标靶载体聚集,如由上述实验H所证实。
如图19和20所示,实验K之结果显示rAAV纯化,但同样存在可预测污染带。
在图20中,收集纯化之rAAV且与可购自英杰之SDS-PAGE装载缓冲液混合,并在95摄氏度下加热5分钟,随后装载至亦可购自英杰之10%w/v SDS-PAGE Tris-甘胺酸凝胶上,并在100V下操作直至染料到达凝胶底部。根据制造商之方案(英杰)使凝胶染色。此处,可见结果证实在单一连续流离心方法中,rAAV能从溶解物中纯化。
图20之SDS-PAGE分析表明,在连续流离心后,色带K5至K9中大多数污染物自rAAV移除。换言之,色带K5至K9中之溶离份包括纯形式之标靶载体。
应指出,色带K5至K12包括40至35kDa之可预测污染物(出于测定实验K之产率目的已酌减)。此处,约29%之所装载rAAV流通损失,且溶离份K2至K11中之回收率为所装载rAAV之47%。
因此,上述实验A至K说明,使用连续流离心机及未经调节之碘克沙醇密度梯度,纯化腺相关病毒(AAV)之一步可扩展程序能够成功。使用未经调节之碘克沙醇密度梯度的结果亦说明含有可预测污染物之纯化。
在一些实施例中且取决于纯化AAV及/或rAAV之最终用途,在可预测污染物存在之情况下,实验A至K之回收率及纯化对于一些方法而言可能在可接受参数范围内。此处,本申请案使用未经调节之碘克沙醇梯度,在具有柠檬酸钠之PBS缓冲液的更适宜条件下,以单一连续流离心提供此类结果。
在其他实施例中且取决于纯化AAV及/或rAAV之最终用途,可预测污染物可能不在可接受参数范围内。测试除上文所述之一个及两个连续流离心以外的方法,以确定用于移除剩余污染物之各种参数。
图21所示之结果系通过使用具有7ml 50%w/v及10ml 30%w/v碘克沙醇之碘克沙醇梯度,在55,000rpm(亦即,340,000×g)下离心1小时,随后在65,000rpm(亦即,402,000×g)下隔夜离心,使溶解物暴露于隔夜管转子离心来获得。此处,可见即使在第二次管转子离心步骤之后仍有污染带。
在不希望受任何特定理论束缚的情况下,本申请案在理论上认为不管是否通过单独的单次连续流离心(实验K-图20)或随后长时间的转子离心(图21)纯化,或通过两个独立连续流离心(实验G、I及J)纯化,污染带仍存在,这并非由于连续流离心机,而可能至少部分归因于梯度剂碘克沙醇之性质。
图22中之结果系通过汇集来自上述实验H之溶离份,并使所得汇集溶解物暴露于透析纯化来获得,透析纯化是去除诸如上文所述之可预测污染物的较小污染物之常用及熟知方法。
透析使用分子量截断为1,000kDa或300kDa之Float-a-Lyzer盒,假设所估计分子量为3,900kDa的所需rAAV将保持在盒内且较小污染物将扩散至透析缓冲液中并被去除。透析使用含1ml材料之100ml PBS缓冲液持续2小时,替换另一1000ml PBS且隔夜透析。回收盒内之rAAV且用qPCR滴定。
随后进行SDS-PAGE以确定所收集标靶载体之纯度,图22之结果说明透析在移除污染物时并非有效。
鉴于上文所述且在不希望受任何特定理论束缚的情况下,假设可预测污染物是可以与rAAV结合且因此与rAAV共纯化之蛋白质,使得诸如(但不限于)氯化铯或高浓度盐之强离子条件在一步连续流离心方法之前、期间或之后,可以有效使可预测污染物从标靶载体中解离。
图23中之结果系通过重复上述实验H且使所得汇集溶离份暴露于透析纯化以移除碘克沙醇(如上文关于图22所论述),随后在包括氯化铯(CsCl)之梯度中在65,000rpm(亦即,402,000×g)下管转子隔夜离心来获得。如图23所示,可预测污染带不再存在。
图24中之结果系通过重复上述实验H,但消除透析(如上文关于图22及23所论述),更确切而言是在实验H之连续流离心之后,在包括氯化铯(CsCl)之梯度(展示于色带2)中在65,000rpm(亦即,402,000×g)下管转子隔夜离心来获得。如图24所示,通过在存在CsCl情况下的离心作用来消除污染带。
作为亦由图24所示之额外测试,在实验H的连续流离心之后,亦在色带3中所示之包括3M氯化钠(NaCl)的梯度中在65,000rpm(亦即,402,000×g)下进行管转子隔夜离心。通过在存在NaCl情况下的离心作用来消除污染带。
正如图23及24中之结果所示,当需要移除在碘克沙醇中单一连续流离心之后存在的可预测污染物时,本申请案通过使用离子条件经由在CsCl及NaCl中进行第二次转子离心,成功解离了或以其他方式移除了可预测污染物。
虽然已在图23及24之结果中说明,有可能通过在暴露于连续流离心步骤之后的纯化步骤中暴露于离子条件来移除或解离或以其他方式移除可预测污染物,本发明亦说明在暴露于连续流离心步骤之前或期间存在此类离子条件。
实验L
使用批号15-219之1000ml细胞培养物制备溶解物,估计值为2e+15vg rAAV。此溶解物在使用前存储在4℃环境下约2周。在即将使用前,添加NaCI至溶解物中达到最终3M浓度且随后在连续流离心纯化中处理材料。溶解物体积为100ml。使用120ml转子。离心速度设定为35,000rpm(亦即,90,500×g),且材料装载和缓冲液冲洗速率设定为5ml/min。聚集成带时间设定为2小时。在含有0.1M柠檬酸钠及3M NaCl之PBS缓冲液中制备25ml 25%w/v及58ml 50%w/v碘克沙醇之梯度。在离心操作之后,每5ml收集二十四(24)个溶离份。另外,亦收集五(5)个流通式溶离份以确定rAAV在流通中的分布。
结果见图25和26。应指出,回收率为38%。由于溶离份中之rAAV含有高盐且溶离份中之rAAV效价较低,仅对溶离份7、8及9,流通物及溶解物进行脱盐,并用于图26之SDS-PAGE及染色分析。亦应指出,实验L之结果似乎至少包括一些因存储溶解物而产生之降解带来的效果。然而,图26之结果似乎表示,添加3M NaCl至连续流梯度中不能以单个步骤离心从rAAV中移除可预测污染带。
实验M
使用相同批号15-219中之另外1,000ml培养物来制备100ml溶解物,但该溶解物为新制备,且不同于上文在实验L中所述之冷冻溶解物。澄清后,添加氯化铯至含有100mM柠檬酸钠之1×PBS中获得20%w/v之浓度。亦制备含有0.1M柠檬酸钠及20%w/v氯化铯之洗涤缓冲液和碘克沙醇。除了此次在泵启动期间用40ml洗涤缓冲液稀释溶解物之外,离心参数与实验L中的完全相同。
结果见图27和28。此次的rAAV效价较高。在溶解物中,检测到1.3ge+13vg/ml效价,且在纯化方法中装载总计1.95e+15vg。图28之SDS-PAGE分析表明,在单一连续流离心后,色带M4至M14中大多数污染物(包括可预测污染物)自rAAV移除。换言之,色带M4至M14中之溶离份包括纯形式之标靶载体。此处,约62%之所装载rAAV流通损失,且来自纯载体之色带M4至M14之纯rAAV载体的产率为所装载rAAV之21%。
根据SDS PAGE凝胶分析,来自所收集溶离份之rAAV载体是纯的,如图28中所示具有微量污染带。这些结果说明,将20%w/v氯化铯作为调节剂添加至碘克沙醇梯度后,rAAV可通过此连续流离心方法以一步纯化。
实验N
使用一公升细胞培养物制备溶解物并在实验中使用。在含有100mM柠檬酸钠、1%W/VX-100之PBS缓冲液中制备碘克沙醇梯度。相同缓冲液用作洗涤缓冲液。除了此次在泵启动期间用40ml洗涤缓冲液稀释溶解物之外,离心参数与实验L中的完全相同,且添加20%w/v CsCl及1%w/vX-100至所有溶液中。结果见图29和30。
图30之SDS-PAGE分析表明,在单次连续流离心之后,色带N4和N5中大多数污染物自rAAV移除。换言之,色带N4和N5中之溶离份包括纯形式之标靶载体。色带N6至N11中之溶离份显示存在约40kDa之可预测污染物。此处,约39%之所装载rAAV流通损失,且溶离份N4至N15中之回收率为所装载rAAV之24%。
结果表示,添加1%w/vX-100未增加rAAV回收率,并损害了rAAV纯度,如图30所示。
为更好理解上文所论述之各种实验的结果,制备图31来比较实验C、D、H、K、L、M、E、G、I及J。
离心利用标靶载体与污染物之间的沉降差异来实现分离。在AAV和rAAV的情况下,与大多数可溶性蛋白质相比,其沉降速率由于相对较大的尺寸而相当快。使用连续流离心,在机器高速操作期间可将材料引入转子中,且若已选择适当流动速率,则可以在密度梯度中捕捉标靶载体。
需要正确选择流动速率,以确保适当捕捉标靶载体且使标靶载体的流通损失减至最小。此外,流动速率必须足够高,以阻止污染物在密度梯度中快速累积。此连续流离心操作在优化后可实现显著纯化,使超过90%污染物在高速离心期间通过转子,且在密度梯度中仅捕捉小比例污染物。转子内密度梯度之设计经优化后可实现标靶载体之集中累积,且可将处理期间难免进入转子密度梯度内之污染物有效分离。连续流离心之优势是使材料体积不受转子体积之限制。在高速操作期间可连续供应进料,且仅在密度梯度之标靶载体饱和时需结束此过程。在处理超过5至50转子体积之材料后,可发生此种情况,具体取决于进料流。此纯化过程可有效实现材料体积的大幅度减少,同时还可从污染物中高效分离标靶载体,且可使纯化因子增加100倍。
执行实验A和B,以确定能否将用于批处理梯度操作之CsCl梯度转移至连续流操作中。然而,现已确定,CsCl梯度不提供可利用连续流离心操作对rAAV进行纯化之梯度。
因此,以实验方式观测其他梯度培养基。在实验C中,使用0%梯度之一步梯度,亦即水,制作50%碘克沙醇梯度溶液。所得纯化可将标靶载体自材料内发现的大量污染物中分离。根据SDS PAGE分析,在碘克沙醇浓度高达44%至48%(1.4066至1.4111g/cm3)之密度梯度中,标靶载体(VP1、VP2及VP3)清晰可见且可见为基本较纯。在峰密度为41%碘克沙醇(1.3999g/cm3)之较不密集溶离份中可见尚未达到此密度范围(亦即仍处于速率区带分离,而非处于等密度区带点)之标靶载体。根据碘克沙醇中已知的rAAV沉降预计,rAAV之最终位置将处于浓度约48%之碘克沙醇中。
实验C之结果说明,因存在于密度梯度中之所有或大多数标靶载体未达到等密度层,所以沉降过程仍处于活动中。预计某个标靶载体之峰将延伸至该标靶载体之实际浮力密度。
在SDS PAGE中,对较低密度溶离份中之污染物进行了说明,其中一种污染物似乎会在约38kDa条件下与标靶载体(VP1、VP2及VP3)成比例出现。可将此污染物称为“可预测”或“共纯化”污染物。在整个相同溶离份(例如大约25kDa范围)中,可见之其他污染物浓度似乎随着密度梯度降低而增加,因此,可认为其累积方式似乎与标靶载体无关。
本申请案根据实验C确定,可使用AW Promatix 1000TM离心机之一步纯化方法获得纯rAAV。虽然在与对照物进行对比时,来自最纯溶离份之产率与在密度梯度中收集之rAAV的主要部分不相等。
本申请案随后会考虑进一步操作,旨在解决从rAAV中进一步分离污染物之问题,因为在溶离份C9及C10中可见污染物与峰显著重迭。这会导致实验D需采用密度较低之第二碘克沙醇层。这样做旨在使梯度在较低密度下具有更多可用体积,从而使污染物通过密度梯度之耗时更长,因此快速移动之rAAV与慢速移动之较小污染物之间存在更佳分辨率。
在实验D中,使用25%碘克沙醇及50%碘克沙醇。根据SDS PAGE分析,此法似乎已移除少量污染物,在此情况下,不认为装载材料具有足够高浓度,且在纯化过程中的损失较高,所以产率较低。
应认识到,在实验D中选择25%之浓度下限及50%之浓度上限来测试用于实现两层分离之潜在外边界。然而,本发明涵盖使用碘克沙醇浓度之其他组合,但前提是为避免碘克沙醇洗涤出转子而采用足够高之浓度下限,且浓度上限应保持在使碘克沙醇仍处于溶液中之限度内。此外,本发明涵盖浓度处于1%至60%之间时,密度梯度超过两层之情况。
为进一步评估呈25%∶50%浓度之两层梯度的效能,添加缓冲***,以使标靶载体稳定,从而帮助产率恢复并给予更佳纯化。
在实验E中,两个因素已改变。采用PBS缓冲***,并使用更大转子(早期测试尺寸之二倍)。此为比较按比例扩大期间的梯度分布及效能。实验E结果之表明回收率高达65%,并证明PBS缓冲***可增加产物之稳定性。此外,总产率较高,收集到含有1.46×1014个病毒基因组(vg)之16ml汇集物。根据SDS PAGE分析,在与实验C相比时,峰溶离份之纯度似乎并未显著改进。
为进一步改进纯度,本申请案考虑使用来自先前离心产物之材料的汇集物重复离心步骤。为此,将来自实验C之溶离份汇集,随后进行稀释,以降低总密度。进行稀释之目的是当装载材料之密度与固定梯度之密度相似时,最大限度地减少流通损失。在实验G中,可见此分离之结果。产率为49%,且通过SDS PAGE显示已移除显著比例之污染物。第二次操作时产率为49%,第一次操作时产率为24%,随后仅完成12%之总回收率。
在执行实验H时向缓冲液中添加100mM柠檬酸钠,本申请案认为其促进了rAAV之稳定性,因此可有效改进纯化期间之产率。有利地,与实验C相比,此实验结果表明产率出现显著提升,因为标靶载体在35%至47%碘克沙醇中之分布实现56%之回收率。峰溶离份为大约46%-47%碘克沙醇。根据SDS PAGE,与对照物相比,此峰溶离份目前基本上较纯,且该峰似乎仅在约38kDa条件下存在可预测之污染物。
执行实验K,以重复实验H,从而验证结果。实际上,已获得类似之纯度及产率结果,其中获得47%。可预测污染物仍存在,且本发明考虑此为使用碘克沙醇作为密度梯度培养基进行纯化之可再现性特征。
实验G及实验I汇集来自实验E之溶离份,随后对其进行了稀释,以降低材料密度,同时在基本相同的第二密度梯度上进行操作。虽然产物之峰高于44%碘克沙醇之校正密度而存在,但回收率较低。在此情况下,SDS PAGE不会显示有效纯化,且可预测污染物仍存在。
实验J得出类似结果,表明第二次离心不会实现额外纯化,且会导致rAAV显著损失。换言之,实验G、I及J说明,额外离心步骤在保持合理产率时,无法有效移除可预测污染物。
本申请案随后进行进一步小规模实验,以检验38kDa可预测污染物及其与rAAV之缔合。为证实本申请案中污染物并非是连续流离心方法所呈现之特征的假设,将碘克沙醇梯度移回至批处理管转子,针对CsCl密度梯度采用相同实验条件,但将碘克沙醇更换为密度梯度培养基。在此管实验的SDS PAGE中,可见可预测污染物之相同分离效果。因此认为,能够证实本申请案中可预测污染物随碘克沙醇密度梯度方法(而非连续流离心方法)而变的假设。
为查看可预测污染物与标靶载体之解离,本申请案使用1000kDa或300kDa过滤器进行透析,此类过滤器会保留rAAV,但同时应允许释放污染物。SDS PAGE分析未说明仅凭单独透析即可移除可预测污染物。根据这些结果,假设标靶载体与可预测污染物之间显著缔合,且可能受缓冲条件改变的影响。
因此,本申请案进一步在连续流离心机之第二批梯度上处理来自第一离心之溶离份,以检验向材料中添加CsCl或NaCl的效果。如SDS PAGE中所示,这样证明了在实验管转子方案中添加CsCl,达到密度为1.38g/cm3,或添加3M NaCl,皆可有效移除共污染物。
应用AW Promatix 1000TM进一步检验利用CsCl和NaCl进行的批处理管转子测试中发现的参数。实验L使用与先前相同的参数,但在缓冲液中包括3M NaCl。虽然实现了1.24×1014个病毒基因组(vg)之高产率,且在等密度层(亦即,43%至48%碘克沙醇)发现rAAV,但先前鉴别之可预测污染物仍存在。但所有其他污染物已移除。
实验L用CsCl取代NaCl,且在此情况下,根据SDS PAGE分析可见,基本上已从所有密度梯度之溶离份中移除可预测污染物。此为使用一步纯化法从溶解物(亦即,材料)中留下基本上较纯的rAAV。唯一限制因素为密度梯度之总产率降低至21%。在峰处产生1.61×1014个病毒基因组(vg)。
为检验表面活性剂能否有效移除可预测污染物而开展另一研究,证明即使在实验L中使用CsCl之情况下也并非如此。在后一种情况下,产率仍与仅使用CsCl之密度梯度相同,但却损失先前获得之纯度。
总之,本申请案提供AAV及/或rAAV在未经调节梯度中之一步连续流纯化,其方式导致标靶载体连同可预测污染物分离,至少如实验E、H及K中可见,产率分别为65%、55%及47%。在一些实施例中,可在后续纯化步骤中移除可预测污染物,一般在连续流离心步骤之后进行。此外,本申请案提供AAV及/或rAAV在经调节梯度中之一步连续流纯化,其方式导致标靶载体分离,亦即从可预测污染物中分离,至少如实验M中可见,产率为21%。
亦应指出,术语“第一”、“第二”、“第三”、“上”、“下”及其类似者在本文中可用于修饰各种元素。除非特别陈述,否则此等修饰语不暗示经修饰之元素的空间、顺序或分层次序。
虽然在本发明描述中已参考一个或多个示例性实施例,但熟习此项技术者应理解,在不脱离当前披露信息范畴的情况下,可进行各种改变且可用等效物取代各种元素。另外,在不脱离本发明之范畴的情况下可进行许多修改,以使特定情形或材料适应当前披露信息之教示。因此,本发明之意图为不限于所揭示作为预期的最佳模式之特定实施例,但本发明将包括属于本文揭示内容之范畴内的所有实施例。
Claims (53)
1.一种纯化病毒载体之方法,该方法包括:
将非离子密度梯度装载至连续流离心机转子中;
将包括该病毒载体之一种材料装载至该连续流离心机转子中;
采用足以从非离子密度梯度的材料中分离该病毒载体及可预测污染物之方式旋转该连续流离心机转子;以及
从该连续流离心机转子上卸除分离的病毒载体及可预测污染物。
2.根据权利要求1中所述之方法,其中该材料为包含该病毒载体的溶解物。
3.根据权利要求1中所述之方法,其中该非离子密度梯度包含碘克沙醇溶液与水性缓冲液。
4.根据权利要求3中所述之方法,其中该水性缓冲液中包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
5.根据权利要求1中所述之方法,其中该非离子密度梯度中包含容重为1%至60%(%w/v)之间的碘克沙醇溶液与水性缓冲液。
6.根据权利要求1中所述之方法,其中该非离子密度梯度中包含25%w/v至50%w/v之间的碘克沙醇溶液与水性缓冲液。
7.根据权利要求6中所述之方法,其中该碘克沙醇中包含含有25%w/v层及50%w/v层的两层阶梯式梯度。
8.根据权利要求6中所述之方法,其中分离的病毒载体中至少应包含材料中病毒载体的47%。
9.根据权利要求8中所述之方法,其中分离的病毒载体中至多可包含材料中病毒载体的65%。
10.根据权利要求1中所述之方法,其中旋转该连续流离心机转子的步骤中进一步包含在使用调节剂情况下的旋转步骤,以足以从材料中移除可预测污染物。
11.根据权利要求10中所述之方法,其中该调节剂以浓度形式存在,以提供足够的离子电位,从而改变可预测污染物与该材料之间的任何共纯化相互作用。
12.根据权利要求10中所述之方法,其中该非离子密度梯度中包含调节剂。
13.根据权利要求10中所述之方法,其中旋转该连续流离心机转子之步骤中进一步包含在使用流通缓冲液情况下的旋转步骤,而该流通缓冲液中应包含调节剂。
14.根据权利要求10中所述之方法,其中该材料中应包含调节剂。
15.根据权利要求10中所述之方法,其中该调节剂选自于下列群组,包括:氯化铯(CsCl)、氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、碘海醇、甲泛葡胺、蔗糖、甘油、葡萄糖、溴化钾(KBr)及其任何组合。
16.根据权利要求10中所述之方法,其中该调节剂中包含浓度最高为40%w/v的CsCl。
17.根据权利要求10中所述之方法,其中该调节剂中包含浓度为20%w/v的CsCl。
18.根据权利要求17中所述之方法,其中分离的病毒载体中至少应包含材料中病毒载体的21%。
19.根据权利要求1中所述之方法,其中该病毒载体中至少包含腺相关病毒(AAV)及重组腺相关病毒(rAAV)中的其中一种。
20.根据权利要求1中所述之方法,其中将非离子密度梯度装载至连续流离心机转子的步骤中包含静态梯度装载或动态梯度装载。
21.根据权利要求1中所述之方法,其中该卸除步骤中包含静态梯度卸除或动态梯度卸除。
22.根据权利要求1中所述之方法,其进一步包含在将材料装载至连续流离心机转子中之前,确定非离子密度梯度的方位。
23.根据权利要求1中所述之方法,其中将非离子密度梯度装载至连续流离心机转子的步骤中包含装载混合梯度或线性梯度。
24.根据权利要求1中所述之方法,其进一步包含执行第二次离心步骤,以从分离的病毒载体中移除可预测污染物。
25.根据权利要求24中所述之方法,其中第二次离心步骤中包含连续离心或非连续离心操作。
26.根据权利要求24中所述之方法,其中第二次离心步骤中包含使用具有离子调节剂的梯度,以便足以移除可预测污染物。
27.一种纯化病毒载体之方法,该方法包括:
将非离子密度梯度装载至连续流离心机转子中;
将含有病毒载体的材料装载至该连续流离心机转子中,其中该病毒载体中至少包含AAV及rAAV中之一种;
采用足以从非离子密度梯度的材料中分离该病毒载体之方式旋转该连续流离心机转子;以及
自该连续流离心机转子卸载分离之病毒载体。
28.根据权利要求27中所述之方法,其中旋转该连续流离心机转子之步骤中进一步包含在使用调节剂情况下的旋转步骤,以足以从材料中移除可预测污染物。
29.根据权利要求28中所述之方法,其中该调节剂中包含浓度最高为40%w/v之CsCl。
30.根据权利要求27中所述之方法,其中该非离子密度梯度中包含足以从材料中移除可预测污染物之调节剂。
31.根据权利要求30中所述之方法,其中该调节剂中包含浓度最高为40%w/v之CsCl。
32.根据权利要求27中所述之方法,其中旋转该连续流离心机转子之步骤中进一步包含在使用流通缓冲液情况下的旋转步骤,而该流通缓冲液中应包含足以从材料中移除可预测污染物之调节剂。
33.根据权利要求32中所述之方法,其中该调节剂中包含浓度最高为40%w/v之CsCl。
34.根据权利要求27中所述之方法,其中该材料中包含足以从材料中移除可预测污染物之调节剂。
35.根据权利要求34中所述之方法,其中该调节剂中包含浓度最高为40%w/v之CsCl。
36.一种纯化病毒载体之方法,该方法包括:
将非离子密度梯度装载至连续流离心机转子中,其中该非离子密度梯度中包含25%w/v至50%w/v之间的碘克沙醇溶液及PBS;
将含有病毒载体的材料装载至该连续流离心机转子中,其中该病毒载体中至少包含AAV及rAAV中之一种;
在浓度最高为40%w/v且在添加CsCl的情况下,采用足以从非离子密度梯度的材料中分离该病毒载体之方式旋转该连续流离心机转子;以及
自该连续流离心机转子卸载分离之病毒载体,其中分离之病毒载体中至少应包含材料中病毒载体的21%。
37.根据权利要求36中所述之方法,其中该非离子密度梯度中应包含CsCl。
38.根据权利要求36中所述之方法,其中旋转该连续流离心机转子之步骤中进一步包含在使用流通缓冲液情况下的旋转步骤,而该流通缓冲液中应包含CsCl。
39.根据权利要求36中所述之方法,其中该材料中应包含CsCl。
40.一种纯化病毒载体之方法,该方法包括:
将非离子密度梯度装载至连续流离心机转子中,其中该非离子密度梯度中包含25%w/v至50%w/v之间的碘克沙醇溶液及PBS;
将含有病毒载体的材料装载至该连续流离心机转子中,其中该病毒载体中至少包含AAV及rAAV中之一种;
采用足以从非离子密度梯度的材料中分离该病毒载体及可预测污染物之方式旋转该连续流离心机转子;以及
自该连续流离心机转子卸载分离之病毒载体,其中分离之病毒载体中至少应包含材料中病毒载体的47%。
41.根据权利要求40中所述之方法,其中分离之病毒载体中至多可包含材料中病毒载体的65%。
42.一种用于连续流离心之密度梯度,其中包含:
碘克沙醇,含量选自于包括25%w/v和50%w/v之群组;
最高含量为40%w/v之CsCl;以及水性缓冲液。
43.根据权利要求42中所述之密度梯度,其进一步包含100mM柠檬酸钠。
44.根据权利要求42中所述之密度梯度,其中该水性缓冲液中包含PBS。
45.根据权利要求44中所述之密度梯度,其进一步包含100mM柠檬酸钠。
46.根据权利要求42中所述之密度梯度,其中碘克沙醇的含量为25%w/v。
47.根据权利要求42中所述之密度梯度,其中碘克沙醇的含量为50%w/v。
48.根据权利要求42中所述之密度梯度,其中CsCl的含量为20%w/v。
49.一种用于连续流离心之流通缓冲液,其包含水性缓冲液、柠檬酸钠及CsCl。
50.根据权利要求49中所述之流通缓冲液,其中该柠檬酸钠中包含100mM柠檬酸钠。
51.根据权利要求49中所述之流通缓冲液,其中该水性缓冲液中包含PBS。
52.根据权利要求49中所述之流通缓冲液,其中CsCl之添加量最高为40%w/v。
53.根据权利要求49中所述之流通缓冲液,其中CsCl之添加量最高为20%w/v。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562102645P | 2015-01-13 | 2015-01-13 | |
US201562102650P | 2015-01-13 | 2015-01-13 | |
US62/102,650 | 2015-01-13 | ||
US62/102,645 | 2015-01-13 | ||
US201562139242P | 2015-03-27 | 2015-03-27 | |
US62/139,242 | 2015-03-27 | ||
PCT/US2016/012680 WO2016114992A2 (en) | 2015-01-13 | 2016-01-08 | Methods of purifying adeno-associated virus (aav) and/or recombinant adeno-associated virus (raav) and gradients and flow-through buffers therefore |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107428799A true CN107428799A (zh) | 2017-12-01 |
Family
ID=56367102
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201680005305.9A Pending CN107428799A (zh) | 2015-01-13 | 2016-01-08 | 纯化腺相关病毒(AAV)及/或重组腺相关病毒(rAAV)之方法及其梯度和流通式缓冲液 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9862936B2 (zh) |
EP (1) | EP3245218A4 (zh) |
CN (1) | CN107428799A (zh) |
SG (1) | SG11201704919SA (zh) |
TW (1) | TW201630926A (zh) |
WO (1) | WO2016114992A2 (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA3034527A1 (en) | 2016-08-23 | 2018-03-01 | Emmanuel John Simons | Compositions and methods for treating non-age-associated hearing impairment in a human subject |
BR112022016596A2 (pt) | 2020-02-21 | 2022-11-16 | Akouos Inc | Composições e métodos para o tratamento de debilitação auditiva não associada à idade em um indivíduo humano |
US20230407328A1 (en) | 2020-11-02 | 2023-12-21 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Process for enriching adeno-associated virus |
WO2023064383A1 (en) * | 2021-10-12 | 2023-04-20 | Cytonus Therapeutics, Inc. | Systems and methods for manufacturing of therapeutic cells |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040121444A1 (en) * | 1998-05-27 | 2004-06-24 | University Of Florida Research Foundation | Method of preparing recombinant adeno-associated virus compositions |
WO2005086658A2 (en) * | 2004-02-27 | 2005-09-22 | Alfa Wassermann, Inc. | Processes for adenovirus purification using continuous flow centrifugation |
CN101633911A (zh) * | 2008-07-22 | 2010-01-27 | 大连雅立峰生物制药有限公司 | 适合于大规模生产人用禽流感疫苗的纯化技术 |
CN103083654A (zh) * | 2012-08-27 | 2013-05-08 | 万里明 | Celligen310生物反应器制备人二倍体细胞狂犬病疫苗工艺 |
CN103374547A (zh) * | 2012-07-04 | 2013-10-30 | 北京健翔和牧生物科技有限公司 | 一种***纯化疫苗的制备方法 |
CN103721251A (zh) * | 2013-12-12 | 2014-04-16 | 北京科兴生物制品有限公司 | 流感病毒裂解疫苗的纯化方法 |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3430849A (en) | 1967-08-01 | 1969-03-04 | Atomic Energy Commission | Liquid centrifuge for large-scale virus separation |
SK181098A3 (en) | 1996-07-01 | 1999-07-12 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Method for producing recombinant adenovirus |
BR9713368A (pt) | 1996-11-20 | 2001-09-18 | Introgen Therapeutics Inc | Processo melhorado para a produção e a purificação de vetores adenovirais |
US6989264B2 (en) | 1997-09-05 | 2006-01-24 | Targeted Genetics Corporation | Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors |
WO2001085928A1 (fr) | 2000-05-10 | 2001-11-15 | Mitsubishi Pharma Corporation | Procede de preparation de vecteur de virus |
US6593123B1 (en) | 2000-08-07 | 2003-07-15 | Avigen, Inc. | Large-scale recombinant adeno-associated virus (rAAV) production and purification |
US20030114289A1 (en) | 2001-11-27 | 2003-06-19 | Merino Sandra Patricia | Centrifuge with removable core for scalable centrifugation |
US20050196854A1 (en) | 2002-05-14 | 2005-09-08 | Konz John O.Jr. | Methods of adenovirus purification |
US7419817B2 (en) | 2002-05-17 | 2008-09-02 | The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services, Nih. | Scalable purification of AAV2, AAV4 or AAV5 using ion-exchange chromatography |
CA2495680A1 (en) | 2002-08-16 | 2004-02-26 | Bertrand Saunier | Hepatitis c viral-like particle purification |
CN1842706A (zh) | 2003-03-19 | 2006-10-04 | 阿尔法沃塞曼公司 | 亚细胞组分的分离和积累和从其得到的蛋白质 |
CA2518555A1 (en) * | 2003-03-19 | 2004-09-30 | Alfa Wassermann, Inc. | Separation and accumulation of subcellar components, and proteins derived therefrom |
CA2569244C (en) | 2004-06-01 | 2017-02-14 | Avigen, Inc. | Compositions and methods to prevent aav vector aggregation |
US20060287506A1 (en) * | 2005-06-15 | 2006-12-21 | Alfa Wassermann, Inc. | Method for separating and concentrating biological materials using continuous-flow ultracentrifugation |
ES2400235T3 (es) | 2006-04-28 | 2013-04-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Método de producción escalable de AAV |
US10072256B2 (en) * | 2006-05-22 | 2018-09-11 | Abbott Products Gmbh | Process for separating and determining the viral load in a pancreatin sample |
FR2918074B1 (fr) * | 2007-06-27 | 2009-10-09 | Sanofi Pasteur | Procede de purification d'une suspension virale. |
BR112012018899A2 (pt) | 2010-01-28 | 2015-09-15 | Philadelphia Children Hospital | "método para purificar partículas de vetor de vírus adeno-associado." |
ES2609860T3 (es) | 2011-10-28 | 2017-04-24 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Línea celular para la producción de virus adenoasociado |
-
2016
- 2016-01-08 US US14/991,510 patent/US9862936B2/en active Active
- 2016-01-08 EP EP16737650.8A patent/EP3245218A4/en not_active Withdrawn
- 2016-01-08 WO PCT/US2016/012680 patent/WO2016114992A2/en active Application Filing
- 2016-01-08 CN CN201680005305.9A patent/CN107428799A/zh active Pending
- 2016-01-08 SG SG11201704919SA patent/SG11201704919SA/en unknown
- 2016-01-12 TW TW105100800A patent/TW201630926A/zh unknown
-
2017
- 2017-11-07 US US15/805,489 patent/US20180066237A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040121444A1 (en) * | 1998-05-27 | 2004-06-24 | University Of Florida Research Foundation | Method of preparing recombinant adeno-associated virus compositions |
WO2005086658A2 (en) * | 2004-02-27 | 2005-09-22 | Alfa Wassermann, Inc. | Processes for adenovirus purification using continuous flow centrifugation |
CN101633911A (zh) * | 2008-07-22 | 2010-01-27 | 大连雅立峰生物制药有限公司 | 适合于大规模生产人用禽流感疫苗的纯化技术 |
CN103374547A (zh) * | 2012-07-04 | 2013-10-30 | 北京健翔和牧生物科技有限公司 | 一种***纯化疫苗的制备方法 |
CN103083654A (zh) * | 2012-08-27 | 2013-05-08 | 万里明 | Celligen310生物反应器制备人二倍体细胞狂犬病疫苗工艺 |
CN103721251A (zh) * | 2013-12-12 | 2014-04-16 | 北京科兴生物制品有限公司 | 流感病毒裂解疫苗的纯化方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
D.R.DUBOIS ET AL: "Large-scale purification of inactivated hepatitis A virus by centrifugation in non-ionic gradients", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 * |
NORMAN GULACK ANDERSON: "《The Development of Zonal Centrifuges and Ancillary Systems for Tissue Fractionation and Analysis》", 21 June 1966 * |
ZOLOTUKHIN S ET AL: "Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.", 《GENE THERAPY》 * |
袁榴娣: "《高级生物化学与分子生物学实验教程》", 31 March 2006, 东南大学出版社 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3245218A2 (en) | 2017-11-22 |
WO2016114992A2 (en) | 2016-07-21 |
TW201630926A (zh) | 2016-09-01 |
EP3245218A4 (en) | 2018-10-03 |
US20160201086A1 (en) | 2016-07-14 |
WO2016114992A3 (en) | 2016-09-22 |
US20180066237A1 (en) | 2018-03-08 |
US9862936B2 (en) | 2018-01-09 |
SG11201704919SA (en) | 2017-07-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107428799A (zh) | 纯化腺相关病毒(AAV)及/或重组腺相关病毒(rAAV)之方法及其梯度和流通式缓冲液 | |
US20220098618A1 (en) | Recombinant adeno-associated virus particle purification with multiple-step anion exchange chromatography | |
EP3256574B1 (en) | Recombinant adeno-associated virus particle purification comprising an affinity purification step | |
JP7237843B2 (ja) | 修飾されたaavキャプシドタンパク質およびその使用 | |
Okada et al. | Scalable purification of adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) and AAV8 vectors, using dual ion-exchange adsorptive membranes | |
EP3535388B1 (en) | Adeno-associated virus purification methods | |
JP6521965B2 (ja) | 非エンベロープウイルス粒子の製造方法 | |
DE69936948T2 (de) | Virusenthaltende Zusammensetzungen und Methoden zur Konzentration von Viruspräparaten | |
EP1198580B1 (de) | Strukturprotein von adeno-assoziiertem virus mit veränderten chromatographischen eigenschaften | |
US20210010028A1 (en) | Insect cell manufactured partial self-complementary aav genomes | |
CA2687119C (en) | Formulation of sugar solutions for continuous ultracentrifugation for virus purification | |
JP7316326B2 (ja) | スペーサーを含む核酸分子およびその使用の方法 | |
WO2014125101A1 (fr) | Methodes pour la production de particules virales aav double brin | |
JP2023525119A (ja) | アデノ随伴ウイルス粒子またはアデノウイルスを精製するための方法および組成物 | |
EP2739725B1 (de) | Verfahren zur aufreinigung von virus-ähnlichen partikeln (vlp) | |
JP2007117003A (ja) | ウイルス中空粒子の迅速除去および精製方法 | |
CN107109374A (zh) | 用于生产无包膜病毒颗粒的方法 | |
CN1139656C (zh) | 一种快速高效分离和纯化重组腺病毒相关病毒的方法和用途 | |
RU2773406C2 (ru) | Способы очистки аденоассоциированных вирусов | |
Joshi | Check for updates Recombinant AAV Purification Pranav RH Joshi and Alina Venereo-Sanchez | |
Bobaly et al. | Stronger together: Analytical techniques for recombinant adeno associated virus |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
AD01 | Patent right deemed abandoned |
Effective date of abandoning: 20230523 |
|
AD01 | Patent right deemed abandoned |