CN107418952A - 一种土壤微生物宏基因组dna的提取方法及相应的试剂盒 - Google Patents

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CN107418952A CN201710810584.2A CN201710810584A CN107418952A CN 107418952 A CN107418952 A CN 107418952A CN 201710810584 A CN201710810584 A CN 201710810584A CN 107418952 A CN107418952 A CN 107418952A
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Abstract

本发明公开了一种土壤微生物宏基因组DNA的提取方法及相应的试剂盒。本发明土壤微生物宏基因组DNA的提取方法是对待测土壤样品进行前处理，有效避免重金属、高盐分和低pH等对溶菌酶的影响，再通过加入溶菌酶以及结合CTAB和SDS协同两次裂解细胞，进一步的冻融处理使更多的微生物细胞壁破碎，其中的DNA分子最大限度的溶出，保证了DNA的丰度、片段完整性和纯度。本发明提取方法操作简单，实用性强，提取得到的DNA可直接应用于解析土壤微生物群落的结构和功能。本发明提取方法特别适用于提取极端环境、生物量极低的土壤微生物宏基因组DNA，且根据本发明提取方法可制成相应的DNA提取试剂盒，具有良好的应用前景。

Description

一种土壤微生物宏基因组DNA的提取方法及相应的试剂盒
技术领域
本发明属于生物基因组DNA的提取技术领域，更具体地说，涉及一种土壤微生物宏基因组DNA的提取方法及相应的试剂盒。
背景技术
极端环境是指具有极端高温，低温，高压，高氧，高盐，高辐射，干旱，极端酸性或碱性，高重金属含量等特征的环境。典型的极端环境包括火山，沙漠，热泉，盐湖，海底热液口，极地等。极端环境微生物类型多样，在地球上分布非常广泛，研究其生命活动具有重要的理论研究和实际应用价值。目前研究微生物的方法主要有两种，即传统的实验室纯培养法和免培养法。环境生存着大量微生物，但可培养的微生物只占1％左右，而大部分的微生物由于种种原因，是无法培养获得的。
宏基因组方法通过提取样品中的总基因组，避开了微生物分离培养的问题，增加了发现新物种的机会，可以全面客观地反映样品中微生物的多样性。随着高通量测序技术的快速发展和测序成本大幅度的降低，利用宏基因组学研究极端微生物的群落结构成为微生物生态研究的一个重要内容。宏基因组学的研究对象是特定环境中全部微生物总DNA，因此DNA提取是宏基因组研究成功的关键步骤，高质量DNA获取是高通量测序的基础。
用于高通量测序宏基因组研究的DNA需要满足两个条件，既要尽可能获得样品中所有微生物的基因，又要保证片段的完整度和DNA纯度。目前，用于高通量测序或者构建基因组文库的基因组DNA一般采用SDS法(十二烷基苯磺酸钠)、CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵)或基于硅胶基质的吸附离心柱等方法提取。市场上也有很多商用基因组提取试剂盒都可高效地提取细菌基因组 DNA，但是这些试剂盒都是针对可培养的细菌，而针对免培养微生物效率则非常低。由于极端环境条件下微生物含量极少，而且特别是有些含有大量盐离子，极端的酸性碱性条件等严重困扰DNA的提取。采用常规DNA提取方法或普通试剂盒提取宏基因组DNA效率低，丰度欠佳，无法获得纯度高、质量优的宏基因组DNA。
发明内容
本发明的目的在于：克服现有常规的极端环境土壤微生物DNA提取时存在的提取效率低、无法满足测序要求等问题，提供一种快速、简易的土壤微生物宏基因组DNA的提取方法，该方法提取得到的DNA具有高丰度、高浓度、高纯度、杂质少等优点，便于后续高通量分析。
为了实现上述发明目的，本发明提供一种土壤微生物宏基因组DNA的提取方法，其包括如下步骤：
(1)将体积比为2:3～3:2的待测土壤样品与缓冲液A混合、50～55℃孵育 15～20min、离心去上清后，加入缓冲液A和溶菌酶37℃孵育30min～1h，再经 20mg/ml蛋白酶K与CTAB 37℃处理20～30min，然后加入浓度为20％的SDS， 65～68℃裂解细胞1～2h，离心获得含DNA的上清液和沉淀；
(2)在步骤(1)所得沉淀中加入缓冲液B和浓度为20％的SDS混合、 65～68℃水浴15～20min然后-80℃冷冻10～15min，反复冻融三次后，离心取上清液，与步骤(1)所得上清液混合；步骤(1)所得沉淀与缓冲液B的体积比为 1:3～3:2；浓度为20％的SDS与缓冲液B的体积比为1:1～9；
(3)加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇抽提蛋白，再用异丙醇进行沉淀1～2h；将混合液加入到离心纯化柱中，经离心洗涤TE洗脱后收集离心管中液体，即为土壤微生物宏基因组DNA溶液；
其中，所述缓冲液A的pH为8.0，包括0.1M EDTA，0.1M Tris-HCl，1.5M NaCl，0.1MNaH2PO4和0.1M Na2HPO4；
所述缓冲液B的pH为8.0，包括0.1M EDTA，0.1M Tris-HCl，1.5M NaCl， 0.1MNaH2PO4、0.1M Na2HPO4和1wt％CTAB。
作为本发明土壤微生物宏基因组DNA的提取方法的一种优选技术方案，上述土壤微生物宏基因组DNA的提取方法，其包括如下步骤：
(1)将体积比为3:2的待测土壤样品与缓冲液A混合、55℃孵育20min、离心去上清后，加入缓冲液A和溶菌酶37℃孵育30min～1h，再经20mg/ml蛋白酶K与CTAB 37℃处理20min，然后加入浓度为20％的SDS，65℃裂解细胞 1～2h，离心获得含DNA的上清液和沉淀；
(2)在步骤(1)所得沉淀中加入缓冲液B和浓度为20％的SDS混合、65℃水浴15min然后-80℃冷冻15min，反复冻融三次后，离心取上清液，与步骤(1) 所得上清液混合；步骤(1)所得沉淀与缓冲液B的体积比为1:3，浓度为20％的SDS与缓冲液B的体积比为1:5；
(3)加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇抽提蛋白，再将异丙醇进行沉淀1h；将混合液加入到离心纯化柱中，经离心洗涤TE洗脱后收集离心管中液体，即为土壤微生物宏基因组DNA溶液；
作为本发明土壤微生物宏基因组DNA的提取方法的一种优选技术方案，步骤(1)中，所述加入缓冲液A和溶菌酶37℃孵育时间为1h。
作为本发明土壤微生物宏基因组DNA的提取方法的一种优选技术方案，步骤(1)中，所述裂解细胞的时间为2h。
作为本发明土壤微生物宏基因组DNA的提取方法的一种优选技术方案，步骤(1)中，所述经20mg/ml蛋白酶K与CTAB 37℃处理20min中，每5～10min 颠倒混匀一次。
作为本发明土壤微生物宏基因组DNA的提取方法的一种优选技术方案，步骤(3)中，所述TE洗脱的次数为多次。
作为本发明土壤微生物宏基因组DNA的提取方法的一种更优选技术方案，步骤(3)中，所述TE洗脱的次数为3次。
本发明土壤微生物宏基因组DNA的提取方法不仅适用于普通土壤样品，还特别适用于极端环境极低生物量的土壤样品测试。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种土壤微生物宏基因组DNA的提取试剂盒，其包括缓冲液A，缓冲液B，pH为8.0、浓度为50mg/ml的溶菌酶溶液，蛋白酶K，10wt％CTAB，20wt％的SDS，5M NaCl，2mM EDTA，1.2 体积％的Tritonx-100异丙醇，TE缓冲液和70体积％的乙醇溶液；
其中，所述缓冲液A的pH为8.0，包括0.1M EDTA，0.1M Tris-HCl，1.5M NaCl，0.1MNaH2PO4和0.1M Na2HPO4；
所述缓冲液B的pH为8.0，包括0.1M EDTA，0.1M Tris-HCl，1.5M NaCl， 0.1MNaH2PO4、0.1M Na2HPO4和1wt％CTAB。
本发明上述土壤微生物宏基因组DNA的提取试剂盒既可用于提取普通土壤样品中的微生物宏基因组DNA，还特别适用于提取极端环境极低生物量的土壤样品中的微生物宏基因组DNA。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)手工提取法存在杂质多、容易造成基因组损失等缺陷，本发明提取方法是手工提取(CTAB+SDS裂解)与试剂盒提取相结合的方式，试剂盒中的吸附柱可以高效吸附DNA，弥补了手工提取法造成的基因组损失的不足，既可一次性获得较大量的DNA抽提液，又可有效提高基因组得率；
(2)本发明提取方法先通过特定的缓冲液孵育后离心的前处理步骤，可抑制DNA的降解，螯合过多的金属离子，这是因为金属离子的存在会影响溶菌酶的活性，除去金属离子可最大限度发挥溶菌酶的作用，提高基因组的提取率；
(3)本发明提取方法通过增大样本量从土壤(极端环境土壤)中通过溶菌酶破壁，再经蛋白酶K和CTAB+SDS协同裂解和多次冻融的方式以获得含更多DNA的粗提液，达到最大限度获取基因组的目的；
(4)本发明提取方法中，使用多次洗脱，最大可能获得较高DNA得率，并可根据洗脱液的数量调节DNA浓度，经检测表明(图1，表1)，本发明提取方法得到的砂土宏基因组DNA质量较高，纯度好。
(4)本发明提取方法保证了DNA的丰度、片段完整性和纯度，具有操作简单，实用性强的特点，提取得到的DNA可直接应用于解析土壤微生物群落的结构和功能。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式，对本发明及有益效果进行详细说明。
图1是本发明实施例提取砂土宏基因组和其他SDS加过柱方法以及 CTAB/SDS离心法收集方法提取DNA电泳的对比图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的配方、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。
实施例1
1.试剂配置
(1)缓冲液A：0.1M EDTA，0.1M Tris-HCl，1.5M NaCl，0.1M NaH2PO4和0.1MNa2HPO4，pH调成8.0，去离子水定容成1L，高温高压灭菌。
(2)50mg/ml溶菌酶：20mM Tris-HCl，2mM EDTA，体积分数为1.2％的 Triton x-100。
(3)10wt％CTAB:称量1gCTAB粉末，用无菌水定容至100ml(需65℃水浴加热溶解)。
(4)缓冲液B：称取0.5g CTAB，用缓冲液A定容至50ml(需65℃水浴加热溶解)。
(5)20％SDS：称取10g SDS，用无菌水定容至50ml(需68℃水浴加热溶解，pH调成7.2)。
(6)苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)。
(7)氯仿：异戊醇(24：1)。
(8)异丙醇(4℃)预冷，70％乙醇。
(9)RNase-free water。
(10)OMEGA Bacterial DNA Kit。
(11)蛋白酶K 20mg/ml。
2.样品前处理
(1)取15g砂土于50ml离心管中，加30ml缓冲液A，涡旋混匀10min (混匀成匀浆状没有任何颗粒或结块贴壁)，55℃水浴20min；
(2)10000xg，离心10min，弃去上清(沉淀如不继续处理可放-80℃)
3.DNA提取
(1)处理后的沉淀加入12ml缓冲液A，再加入500μl溶菌酶，37℃水浴 30min～1h(期间每隔5～10min轻轻颠倒混匀)。
(2)加100μL蛋白酶K(20mg/mL)和1.5ml 10％CTAB轻轻混匀，轻轻混匀，37℃孵育20min(每5～10min颠倒混匀)。
(3)加入1.5ml 20％SDS，65℃水浴1～2h(每5～10min上下颠倒混匀，转移上清液至新的离心管中(50ml，灭菌，注意不要碰到白色沉淀)。
(4)土壤沉淀再加入4.5ml缓冲液B和0.5ml 20％SDS，涡旋混匀20s，65℃水浴15min，水浴结束后反复冻融三次(-80℃，15min，65℃，5min)室温10000g 离心10min。取上清，和前面两次上清混合，不要碰到白色沉淀。
(5)加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，上下颠倒混匀3min。连同管套称重配平，10000g离心10min。
(6)上清加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，上下颠倒混匀。连同管套称重配平，10000g离心10min。
(7)转移上清液至新的离心管中(50ml，灭菌)，加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA(4℃预冷)，轻轻颠倒混匀1min，室温放置1～2h。
4.试剂盒纯化
(1)每次700ml过OMEGA Bacterial DNA Kit柱子，离心30s，至全部过完。
(2)将收集柱转移至Kit配有的离心管中，往柱子内加入500μlHB Buffer，常温离心机离心1min(10000g)。
(3)将滤液去掉，往柱子内加入700μl DNA Wash Buffer，常温离心机离心1min(10000g)。
(4)重复上一步一次。
(5)去掉滤液，常温离心机空甩2min(13000g)。
(6)将柱子转移至灭菌离心管中(1.5ml)，置于超净台风干(5min)。
(7)向柱子内膜上加入适量预热的RNase-free water溶解DNA(每次 50μl，洗脱后先测下浓度，较高的话继续加50μl，如果低，取滤过液再过一次柱)静置3～5min，常温离心机离心2min(13000g)至少过三次柱子。
实施例2利用SDS法提取砂土宏基因组
(1)取15g砂土于50ml离心管中，加30ml缓冲液A，涡旋混匀，55℃水浴20min；
(2)9000g，离心10min，弃去上清；
(3)向离心管中加入10ml缓冲液A，使用冻融法破碎细胞： -80℃15min—65℃水浴5min(重复3次，65℃温浴过程中无需颠倒混匀)。
(4)室温冷却(～10min即可)，向离心管中加入1ml溶菌酶(10mg/ml) (终浓度约为0.5mg/ml)，37℃水浴1h(期间每隔10min轻轻颠倒混匀)。
(5)加入0.5ml 10％SDS(终浓度约为0.5％SDS)和20μl蛋白酶K(终浓度约为100μg/ml)，58℃水浴1h(每10min上下颠倒混匀，最后20min预冷4℃离心机)。
(6)(4000～6000)xg离心7～10min。
(7)转移上清液至新的离心管中(50ml，灭菌，注意不要碰到白色沉淀)。
(8)剩余土壤沉淀再加入4.5ml缓冲液B和0.5ml 20％SDS，涡旋混匀20s， 65℃水浴15min，室温10000g离心10min。取上清，和前面一次上清混合。
(9)上清中加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，上下颠倒混匀。10000xg离心15min。
(10)转移上清液至新的离心管中(50ml，灭菌)，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，上下颠倒混匀。10000xg离心15min。
(11)转移上清液至新的离心管中(50ml，灭菌)，加入等体积的异丙醇沉淀DNA(4℃预冷)，轻轻的混匀，室温放置1h。
(12)每次600ml用OMEGA Bacterial DNA Kit中的柱子过柱，离心 1min。
(13)将收集柱转移至Kit配有的离心管中，往柱子内加入500μlHB Buffer，常温离心机离心1min(10000g)。
(14)将滤液去掉，往柱子内加入700μl DNA Wash Buffer，常温离心机离心1min(10000g)。
(15)重复上一步一次。
(16)去掉滤液，常温离心机空甩2min(13000g)。
(17)将柱子转移至灭菌离心管中(1.5ml)，置于超净台风干(5min)。
(18)向柱子内膜上加入适量预热的RNase-free water(50-100μl)溶解 DNA，常温离心机离心2min(13000g)
实施例3利用离心收集法提取砂土宏基因组
(1)称15g砂土土样，到液氮预冷的研磨钵。
(2)加入液氮研磨，在样品溶解前继续加液氮研磨，重复加三次磨三次
(3)把所有样品转到50-ml Falcon管加16.5ml DNA抽提液。混匀(测下上清的pH如果pH不是8，调到8。
(4)加40μl蛋白酶K(20mg/ml)，温和颠倒混匀，37℃，30min。
(5)65℃，+1.83ml 20％SDS，混匀,温育1～2h。每20min混合一次。
(6)7000rpm，15min,收集上清到新的Fecon tube，后存放4℃。
(7)加6ml抽提液，加0.67ml 20％SDS,混匀，65℃，15min(再一次抽提剩余沉淀样品)。
(8)7000rpm 15min，混合两次得到的上清。
(9)+1x volume(～22ml)异戊醇：氯仿(1:24＝20ml isoamyl alcohol+480mlchloroform,d＝1.48g/cm3)，摇5min混匀抽提(～24)。
(10)7000rpm 15min，收集上清到新的Falcon管。
(11)异戊醇：氯仿再抽提一次，收集上清到圆底离心管，记录下体积(～19 ml)。
(12)准确加0.6体积异丙醇(2-propanol,isopropanol,FW 60.10)，上下颠倒混匀，静置1h。
(13)10500rpm 45min。小心的转移上清到新的Falcon管，留(1-1.5ml)上清。
(14)收集残留上清(1-1.5ml，含有DNA)到一个1.5ml离心管。
(15)13000rpm 5-8min富集DNA(用上清洗涤圆底大离心管DNA区域部分(0.5ml)合并到1.5ml vial)。
(16)加+1ml 70％冷ethanol洗涤DNA沉淀，13000rpm，5min，小心去上清。
(17)在通风厨干燥沉淀30min。
(18)加20μl H2O溶解DNA，轻敲管壁，溶解并稍微离心，4℃过夜溶解DNA。
结果
请参见图1，图1为不同方法得到的砂土DNA电泳图，其中，M为DNA Marker(15000)，1为实施例3收集的DNA，2为实施例2收集的DNA，3为实施例本发明方法收集的DNA。
不同方法获得的砂土DNA浓度对比请参见表1。
表1不同方法获得的砂土DNA浓度对比
方法 CTAB+SDS裂解+过柱 SDS裂解+过柱 CTAB+SDS裂解+离心收集
浓度ng/μl 117.5 67.4 90.4
260/280 1.86 1.75 1.65
260/230 1.73 1.04 1.20
如图1，从3种方法提取DNA的琼脂糖电泳凝胶成像照片可见，与现有其他方法相比，本发明方法得到的宏基因组DNA(图1标记3处)条带更加明亮，清晰，完整，且无降解，说明本发明方法得到的DNA质量更好，浓度更高。实施例2的方法得到DNA虽然也有较高亮度但是有降解，拖尾严重。实施例3无降解但条带亮度较弱，DNA含量少。而且，从Nano DropSpectrophotometer分光光度计检测结果(表1)看，本方法得到的DNA浓度显著高于其他方法，而且260/280以及260/230比值也比其他方法高，说明本方法得到DNA蛋白质、糖类、盐等杂质含量少，因此纯度更好；综上，本发明方法得到的宏基因组DNA 有更高的浓度和纯度以及更好的完整性，能更好的满足宏基因组测序的要求。
上列详细说明是针对本发明之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。

Claims (10)

1.一种土壤微生物宏基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将体积比为2:3～3:2的待测土壤样品与缓冲液A混合、50～55℃孵育15～20min、离心去上清后，加入缓冲液A和溶菌酶37℃孵育30min～1h，再经20mg/ml蛋白酶K与CTAB 37℃处理20～30min，然后加入浓度为20％的SDS，65～68℃裂解细胞1～2h，离心获得含DNA的上清液和沉淀；
(2)在步骤(1)所得沉淀中加入缓冲液B和浓度为20％的SDS混合、65～68℃水浴15～20min然后-80℃冷冻10～15min，反复冻融三次后，离心取上清液，与步骤(1)所得上清液混合；步骤(1)所得沉淀与缓冲液B的体积比为1:3～3:2；浓度为20％的SDS与缓冲液B的体积比为1:1～9；
(3)加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇抽提蛋白，再用异丙醇进行沉淀1～2h；将混合液加入到离心纯化柱中，经离心洗涤TE洗脱后收集离心管中液体，即为土壤微生物宏基因组DNA溶液；
其中，所述缓冲液A的pH为8.0，包括0.1M EDTA，0.1M Tris-HCl，1.5M NaCl，0.1MNaH2PO4和0.1M Na2HPO4；
所述缓冲液B的pH为8.0，包括0.1M EDTA，0.1M Tris-HCl，1.5M NaCl，0.1M NaH2PO4、0.1M Na2HPO4和1wt％CTAB。
2.根据权利要求1所述的土壤微生物宏基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将体积比为3:2的待测土壤样品与缓冲液A混合、55℃孵育20min、离心去上清后，加入缓冲液A和溶菌酶37℃孵育30min～1h，再经20mg/ml蛋白酶K与CTAB 37℃处理20min，然后加入浓度为20％的SDS，65℃裂解细胞1～2h，离心获得含DNA的上清液和沉淀；
(2)在步骤(1)所得沉淀中加入缓冲液B和浓度为20％的SDS混合、65℃水浴15min然后-80℃冷冻15min，反复冻融三次后，离心取上清液，与步骤(1)所得上清液混合；步骤(1)所得沉淀与缓冲液B的体积比为1:3，浓度为20％的SDS与缓冲液B的体积比为1:5；
(3)加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇抽提蛋白，再将异丙醇进行沉淀1h；将混合液加入到离心纯化柱中，经离心洗涤TE洗脱后收集离心管中液体，即为土壤微生物宏基因组DNA溶液。
3.根据权利要求2所述土壤微生物宏基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述加入缓冲液A和溶菌酶37℃孵育时间为1h。
4.根据权利要求2所述土壤微生物宏基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述裂解细胞的时间为2h。
5.根据权利要求2所述土壤微生物宏基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述经20mg/ml蛋白酶K与CTAB 37℃处理20min中，每5～10min颠倒混匀一次。
6.根据权利要求2所述土壤微生物宏基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述TE洗脱的次数为多次。
7.根据权利要求6所述土壤微生物宏基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述TE洗脱的次数为3次。
8.根据权利要求1～7中任意一条权利要求所述土壤微生物宏基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述土壤为极端环境极低生物量的土壤。
9.一种土壤微生物宏基因组DNA的提取试剂盒，其特征在于，包括缓冲液A，缓冲液B，pH为8.0、浓度为50mg/ml的溶菌酶溶液，蛋白酶K，10wt％CTAB，20wt％的SDS，5M NaCl，2mMEDTA，1.2体积％的Triton x-100异丙醇，TE缓冲液和70体积％的乙醇溶液；
其中，所述缓冲液A的pH为8.0，包括0.1M EDTA，0.1M Tris-HCl，1.5M NaCl，0.1MNaH2PO4和0.1M Na2HPO4；
所述缓冲液B的pH为8.0，包括0.1M EDTA，0.1M Tris-HCl，1.5M NaCl，0.1M NaH2PO4、0.1M Na2HPO4和1wt％CTAB。
10.根据权利要求8所述的土壤微生物宏基因组DNA的提取试剂盒，其特征在于，所述土壤为极端环境极低生物量的土壤。
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