CN104694530A - 一种小麦基因组dna提取方法 - Google Patents

Abstract

一种小麦基因组DNA提取方法，将待提取小麦材料样品分别置于96孔板中，接着在每孔中放入钢珠，开盖置于真空冷冻干燥器中在-100～-120℃冷冻干燥20～28h，然后利用研磨仪对小麦材料样品进行研磨；最后采用改良SDS法利用排枪从研磨后的粉末样品中提取DNA。本发明通过真空冷冻干燥后用研磨仪对小麦组织叶片进行粉碎，与传统液氮研磨相比，极大地解放了人力并提高了工作效率，同时通过使用96孔板及排枪，加样抽提效率大大提高。本发明之小麦基因组DNA提取方法具有简便、快速、高通量、高质量。

Description

一种小麦基因组DNA提取方法

技术领域

本发明涉及一种植物基因组DNA提取方法，具体涉及一种小麦基因组DNA提取方法。

背景技术

随着分子生物学不断的发展，众多分子生物学实验的样本需求量都很大，简便快捷高效稳定的DNA提取技术是从分子水平上推进小麦相关研究发展的必要前提，也是研究效率的关键。小麦基因组的DNA提取一般须经过破碎细胞壁、裂解细胞膜、除去多糖和多酚等次生物质、变性分离蛋白质、沉淀核酸、去除RNA和浓缩DNA等几个步骤。一般来说，CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)法对处理含多糖成分的植物组织有独特的优势，广泛应用于植物基因组DNA的提取，而SDS(十二烷基硫酸钠)法在植物基因组DNA的提取中应用较少，主要应用于对模板DNA质量要求不太严的RAPD分析。但传统的CTAB法操作繁琐，试剂消耗量大，并且使用器皿多，研磨器皿等需要重复利用，易造成样品污染，产率也较低。

目前，关于植物DNA提取方法的报道绝大部分都是在SDS法和CTAB法基础上进行改良，但都无法摆脱用研磨棒或玻璃棒对样品逐个研磨的操作步骤，且提取步骤繁琐耗时。近年来也出现了植物DNA其他的简易提取方法，如高盐低pH值法、碱处理法、高温水煮法等，虽然这些方法步骤简单、速度快、成本低，避免使用液氮、苯酚等试剂，但是往往存在着DNA提取质量较差、一天能够提取300份样品左右，不能满足要求较高的PCR扩增等诸多问题。因此，迫切需要建立一个快速经济高通量高质量的DNA提取方法，为PCR扩增、分子标记辅助育种、基因定位和转基因植物检测等多种分子实验提供有效手段。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种简便、快速、高通量、高质量的小麦基因组DNA提取方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种小麦基因组DNA提取方法，将待提取小麦材料样品分别置于96孔板中，接着在每孔中放入钢珠，开盖置于真空冷冻干燥器中在-100～-120℃冷冻干燥20～28h，然后利用研磨仪对小麦材料样品进行研磨；最后采用改良的SDS法利用排枪从研磨后的粉末中提取DNA。

进一步，所述小麦材料为小麦种子播种发芽，第一片真叶展开后的新鲜真叶；所述每孔待提取小麦材料样品的用量为50～100mg。

进一步，所述新鲜真叶的长度为4～6cm。

进一步，所述96孔板为96孔联体试管板，使用96孔联体试管板，而不是单个离心试管，对叶片进行冷冻干燥后粉碎，无需使用液氮。

进一步，每孔放入1个无水酒精清洗的钢珠，每个小试管中放入一个钢珠保证各个样品单独研磨避免了其他方法研磨时出现研磨器具重复使用造成交叉污染的可能性。

进一步，所述采用改良的SDS法利用排枪从研磨后的粉末中提取DNA的方法，包括以下步骤：

(1)将研磨后的粉末样品在2～6℃，4000rpm，离心10min后，利用排枪向管中加入SDS提取液，匀质化后，加入等体积酚、氯仿和异戊醇的混合液摇匀，其中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1，在-20℃冰箱冷冻10min后，接着在4℃环境中静置10min；

(2)取出样品称量配平，在2～6℃，4000rpm，离心20～25min，利用排枪自上往下缓慢吸取上清液于96孔板中，并在96孔板中加入与上清液体积比为1∶10的NaAc和1∶1的-20℃预冷的异丙醇，盖上96孔盖子混匀，放入-20℃冰柜冷冻30～50min，直至DNA沉析出；

(3)将冷冻过的样品取出称量配平在2～6℃，4000rpm，离心10min后，打开96孔盖子，迅速翻转96孔板倾倒管中的全部液体，将96孔板倒置在干燥的吸水纸上吸湿2～3次，将96孔板翻转朝上，加入与上清液等体积的75％的酒精洗涤沉淀一次，在2～6℃，4000rpm，离心5min，迅速倾倒全部清洗液，将96孔板倒置在干燥的吸水纸上吸湿2～3次，将96孔板翻转朝上，加入与上清液等体积的无水乙醇洗涤沉淀一次，在2～6℃，4000rpm，离心5min，迅速倾倒全部清洗液，将96孔板倒置在干燥的吸水纸上吸湿2～3次，将96孔板翻转朝上，在超净工作台内干燥2～3h，加入与上清液等体积的TE或ddH₂O。

本发明通过真空冷冻干燥后用研磨仪对组织叶片进行粉碎，1分钟能同时研磨出192个样品，与传统液氮研磨相比，极大地解放了人力并提高了工作效率。同时冷冻离心机一次能够离心4×96个即384个样品，通过使用96孔板及排枪，使得加样抽提效率大大提高，同时，简化了SDS法提取DNA的步骤，只需加一次提取液抽提一次上清，其余步骤均为洗涤除杂，一轮下来即完成一次384样品的DNA制备大概2小时；所提样品DNA依据其浓度完全可供100次PCR的使用。实验证明，在小麦拔节期采样的叶片进行DNA提取同样能获得质量较好的DNA，也能满足SSR、STS、SCAR等分子标记进行PCR扩增检测，并且成功将约10000个F₂代植株进行了分子标记筛选，将2000个转基因植株进行了检测。

附图说明

图1为琼脂糖电泳检测基因组DNA。

图2为WMC419标记在亲本及后代群体中的电泳图。

图3为GWM11标记在亲本及后代群体中的电泳图。

图4为WE173标记在亲本及后代群体中的电泳图。

图5为小麦再生植株Bar基因的PCR结果。其中，3M：Marker；1：阳性对照；2：野生型；3～23：阴性植株；黄色方框中为阳性植株。

图6为小麦再生植株载体序列(含Bar和LTP)PCR结果。其中，M：Marker；1：阳性对照；2：野生型；3～22：阳性植株。

图7为小麦再生植株载体序列NW-22PCR结果。其中，M：Marker；1：野生型；2：阳性对照；3～17：阴性植株；黄色方框中为阳性植株。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步加以说明。

1、实验材料：小麦感病品种Avocet S和载体品种92R137以及两者杂交的F2代群体(10000株左右)；小麦转基因材料西农1376和小偃22(2000株左右)

2、主要仪器设备和耗材：冷冻干燥器(CoolSafe TM 110-4L，丹麦)、研磨仪(QIAGEN)、通风橱、离心机(eppendorf 5810R)、紫外分光光度仪NanoDrop ND2000/2000C(Thermo SCIENTIFIC)、电泳仪(北京六一DYY-6)、凝胶成像***(Bio-rad Gel Doc)、96孔联体试管盒(武汉仪兴试验仪器设备厂)、96孔PCR板、排枪、钢珠等。

3、试剂：SDS提取液(DS buffer)配方：0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH 8.0)，2％ SDS(pH8.0)；3mol/L NaAC(PH5.2)；酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)；异丙醇；乙醇(70％和95％)；1×TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/LEDTA，pH8.0)；琼脂糖(0.8％、1.5％)；丙烯酰胺凝胶(8％)；溴化乙锭；硝酸银。

实施例1

1、DNA提取

(1)将两个F2代群体的种子播种发芽，待苗子高5cm，一般需要5～7天第一片真叶展开后，取小麦幼叶5cm左右(干重约50mg)，将其分割成数段，按照对应次序放入八连排管中(每个试管容量为1ml)，每个96孔试管盒装有12排八连管。

(2)取样完毕后，用置珠器在每个试管放入1个事先用无水酒精清洗好的钢珠(直径4mm)，然后将样品开盖放置真空冷冻干燥器中，-110℃干燥24h。

(3)取出试管盒，迅速盖上管盖和磨样盒盖，将试管盒固定于研磨仪上，注意保持两侧平衡，进行研磨，一般25～30次/秒，1分钟左右，示样品而定。

(4)将磨好的样品需进行4℃，4000rpm，离心10min，以期粉状样品落入管底，然后放置于-20℃冰箱中保存待提取DNA。

(5)样品离心后打开管盖，利用300ul排枪向管中加入220uL DSbuffer，匀质化后，加入等体积(220uL)酚、氯仿和异戊醇的混合液，其中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1。

(6)对应盖上盖子，用力摇匀后，振荡动作不宜太剧烈，否则可能会导致DNA断裂，在-20℃冰箱冷冻10分钟后，再在4℃环境中静置10分钟。

(7)取出样品并称量配平，4℃，4000rpm，离心20～25min。

(8)用排枪自上往下缓慢吸取上清100ul于96孔板(带帽)中，注意不要吸到分离层的下层液体，板中预先加入10ul NaAc，加入等体积(100ul)-20℃预冷的异丙醇，盖上96孔盖子，轻柔上下颠倒，充分混匀后，放入-20℃冰柜冷冻30min以上，直至DNA沉析出来。

(9)将冷冻过的样品取出称量配平后放入离心机，4℃，4000rpm，离心10min后，小心打开96孔盖子，迅速翻转96孔板，倾倒管中的全部液体，将96孔板小心倒置在干燥的吸水纸上吸湿2～3次，以吸去多余的液体，注意这一过程需动作迅速。

(10)将96孔板翻转朝上，加入100uL 75％的酒精，盖上盖子，轻轻颠倒数次，4℃，4000rpm，离心5min，迅速倾倒全部清洗液，操作同(9)。

(11)弃上清，加入100uL无水乙醇洗涤沉淀一次，4℃，4000rpm，离心5min，其余操作同(9)。

(12)弃上清，超净工作台内干燥大约2～3h，以除去试管中多余的液体。加入100uLTE或ddH2O。

(13)待DNA沉淀充分溶解后，用紫外分光光度计检测DNA浓度，并用琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

2、DNA样品质量检测

(1)DNA的紫外分光光度分析法：检测DNA模板在230nm、260nm和280nm处的吸光值。取1.5μl DNA样品，用TE或ddH2O作空白对照，校正零点，读出核酸溶液的260nm/230nm、260nm/280nm值。DNA纯度可通过A260/A280或A260/A230来衡量，纯度好的DNA A260/A280的比值应该在1.8～2.0之间，如果比值低于1.8，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响，大于2.0则表明有RNA污染。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、盐(胍盐)等，纯度好的DNAA260/A230的比值应大于2.0。采用本试验提取方法获得DNA的平均浓度500ng/μL，A260/A280值平均为2.05，A230/A260值平均为2.12。由此可见DNA提取质量纯度较好。其中F₂群体随机抽取样本检测量为1000个，转基因植株随机抽取样本检测量为300个。

(2)琼脂糖电泳检测：稀释10倍的DNA样品用0.8％的琼脂糖凝胶，90V，电泳检测DNA的完整性。由图1可见，提取的基因组DNA条带清晰和完整，条带较亮并且泳道中没有弥散，将存放3个月之后的DNA进行测试，与之前结果没有明显差异，表明DNA无降解现象。

综上可见，本实施例提取的小麦基因组DNA质量纯度较好，并无降解现象。

3、PCR扩增检测：对于F₂群体筛选交换单株试验，采用与抗条锈基因Yr26连锁的3个标记进行基因检测，其中WMC419和GWM11为SSR标记，WE173为STS标记；各分子标记的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，GWM11标记一对正反引物序列：GGATAGTCAGACAATTCTTGTG，如SED ID NO：1所示，GTGAATTGTGTCTTGTATGCTTCC，如SED ID NO：2所示；WMC419标记一对正反引物序列：GTTTCGGATAAAACCGGAGTGC，如SED ID NO：3所示，ACTACTTGTGGGTTATCACCAGCC，如SED ID NO：4所示；WE173标记一对正反引物序列：GGGACAAGGGGAGTTGAAGC，如SED ID NO：5所示，GAGAGTTCCAAGCAGAACAC，如SED ID NO：6所示，详见表1；用选取的这3对引物对F₂群体DNA样品分别进行PCR扩增(PCR反应体系，见表2；PCR程序与电泳检测，见表3)，并用8％聚丙烯酰胺凝胶及1.5％琼脂糖凝胶检测PCR产物，以检测提取的DNA质量。WMC419和GWM11是位于抗条锈基因Yr26两侧的SSR标记，当用引物WMC419对F2群体扩增时，大部分感病单株及感病亲本扩增出一条150bp的带型，而大部分抗病单株(含有Yr26)及抗病亲本扩增出一条140bp或140和150bp双亲的带型，见图2；当用引物GWM11对F2群体扩增时，大部分感病单株及感病亲本(不含Yr26)扩增出一条150bp和203bp的带型，而大部分抗病单株及抗病亲本(含有Yr26)扩增出一条140bp和193bp或140，150，193，203bp都出现的双亲带型，见图3。WE173是与Yr26紧密连锁的EST-STS标记，大部分感病单株及感病亲本扩增出一条750bp的带型，而大部分抗病单株及抗病亲本(含有Yr26)扩增出一条475或475和750bp双亲的带型，见图4。利用实施例1中提取DNA方法对AvS与92R137的F2代群体进行了DNA提取，将后代DNA用于PCR扩增获得了相应的目的片段(图2)，并可成功进行约10000个F2单株的筛选。对于转基因试验，分别利用Bar、Bar+LTP、NW-22各自特异的SCAR标记对相应的转基因基因植株(T4)进行检测，其中含Bar基因的阳性植株能够扩增出一条435bp大小的片段，见图5；含Bar+LTP的阳性植株能够扩增出一条1037bp大小的片段，见图6；含NW-22的阳性植株能够扩增出一条718bp大小的片段，见图7。利用实施例1中提取DNA的方法可成功完成2000个T4代转基因植株的检测。

实验表明，按照实施例1中的方法操作，每人每天可提取上千个样品的DNA。

表1 文献中报道的相关基因的分子标记

“+”表示阳性，“-”表示阴性

表2 PCR反应体系

表3 PCR程序与电泳检测

Claims (6)

1.一种小麦基因组DNA提取方法，其特征在于，将待提取小麦材料样品分别置于96孔板中，接着在每孔中放入钢珠，开盖置于真空冷冻干燥器中在-100～-120℃冷冻干燥20～28h，然后利用研磨仪对小麦材料样品进行研磨；最后采用改良SDS法利用排枪从研磨后的的粉末样品中提取DNA。

2.根据权利要求1所述的小麦基因组DNA提取方法，其特征在于，所述小麦材料为小麦种子播种发芽，第一片真叶展开后的新鲜真叶；所述每孔待提取小麦材料样品的用量为50mg～150mg。

3.根据权利要求2所述的小麦基因组DNA提取方法，其特征在于，所述新鲜真叶的长度为4～6cm。

4.根据权利要求1所述的小麦基因组DNA提取方法，其特征在于，所述96孔板为96孔联体试管板。

5.根据权利要求1所述的小麦基因组DNA提取方法，其特征在于，每孔放入1个无水酒精清洗过的钢珠。

6.根据权利要求1～5之一所述的小麦基因组DNA提取方法，其特征在于，所述采用改良的SDS法利用排枪从研磨后的粉末中提取DNA的方法，包括以下步骤：

(1)将研磨后的粉末样品在2～6℃，4000rpm，离心10min后，利用排枪向管中加入SDS提取液，匀质化后，加入等体积酚、氯仿和异戊醇的混合液摇匀，其中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1，在-20℃冰箱冷冻10min后，接着在4℃环境中静置10min；

(2)取出样品称量配平，在2～6℃，4000rpm，离心20～25min，利用排枪自上往下缓慢吸取上清液于96孔板中，并在96孔板中加入与上清液体积比为1∶10的NaAc和1∶1的-20℃预冷的异丙醇，盖上96孔盖子混匀，放入-20℃冰柜冷冻30～50min，直至DNA沉析出；

(3)将冷冻过的样品取出称量配平在2～6℃，4000rpm，离心10min后，打开96孔盖子，迅速翻转96孔板倾倒管中的全部液体，将96孔板倒置在干燥的吸水纸上吸湿2～3次，将96孔板翻转朝上，加入与上清液等体积的75％的酒精洗涤沉淀一次，在2～6℃，4000rpm，离心5min，迅速倾倒全部清洗液，将96孔板倒置在干燥的吸水纸上吸湿2～3次，将96孔板翻转朝上，加入与上清液等体积的无水乙醇洗涤沉淀一次，在2～6℃，4000rpm，离心5min，迅速倾倒全部清洗液，将96孔板倒置在干燥的吸水纸上吸湿2～3次，将96孔板翻转朝上，在超净工作台内干燥2～3h，加入与上清液等体积的TE或ddH₂O。