CN107418916A - 筛选多环芳烃高效降解菌的方法及所得的高效降解菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多环芳烃高效降解菌WY6，为分枝杆菌WY6(Mycobacterium sp.WY6)，其保藏号为：CCTCC NO:M 2017373。本发明还同时提供了上述多环芳烃高效降解菌WY6的用途：治理土壤中多环芳烃高浓度污染；对于100mg L^‑1菲降解率达99.75％，对于50mg L^‑1芘降解率达98.73％。本发明还同时提供了一种筛选多环芳烃高效降解菌的方法。

Description

筛选多环芳烃高效降解菌的方法及所得的高效降解菌

技术领域

本发明属于环境有机污染物微生物修复技术领域，涉及一种高效筛选多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)降解菌的方法及所得的一株多环芳烃高效降解菌Mycobacterium sp.WY6。

背景技术

多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)是一类典型的持久性有机污染物，由两个及以上的苯环稠和而成。主要来源于煤和石油的燃烧、冶炼和运输行业等，可在环境中长期稳定存在，广泛分布于大气、水体及土壤中，因其具有“致癌、致畸、致突变”的特性，近来受到了公众的广泛关注，也是有机污染物修复研究者亟待解决的难题之一。

大气中的PAHs可附着于微小颗粒物上，通过迁移、沉降作用进入水体或土壤，而水体中的PAHs也可经水的流动进入到土壤中，并因其较强的疏水性最终在土壤中形成富集。有别于大气污染与水体污染，土壤污染具有较强的隐蔽性，不易被察觉，却与粮食生产密切相关。有研究表明，土壤中的PAHs可进入地下水或通过植物吸收进而进入食物链，进而对人体健康造成较大的危害。

现有土壤有机污染治理技术可分为物理修复(热处理技术、萃取技术、表面活性剂淋洗法等)、化学修复(Fenton试剂氧化、臭氧氧化等)、以及微生物修复技术。物理及化学修复技术均存在成本高，修复不彻底，易对环境造成二次污染的问题，难以大面积推广，具有一定的制约性。而微生物修复技术利用微生物本身以有机污染物为碳源，可将有机污染物代谢为水和二氧化碳的特性，具有能耗低、副产物少、环境友好的特点，被视为经济修复效果较为高效的一种方法。

在长期受到PAHs污染的土壤中，存在大量的PAHs降解菌，是环境中直接用于治理PAHs污染的降解菌储备库。有研究表明，对土壤PAHs的治理已不仅局限于低浓度污染(<5mgkg^-1)，在以化石燃料为主要供能的高能耗企业如钢铁厂、冶炼厂、造纸厂、电镀厂、和石油化工厂等周边的土壤中，PAHs污染浓度高达数百数千个单位(mg kg^-1)。采用高效的筛选方法，提高多环芳烃降解菌获得率，并从中获取高效降解菌，对治理土壤多环芳烃污染具有重要意义。

本发明涉及的参考文献如下：

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2.Wang H,Lou J,Gu H,et al.Efficient biodegradation of phenanthrene bya novel strain Massilia sp.WF1isolated from a PAH-contaminated soil[J].Environmental Science and Pollution Research,2016,23(13):13378-13388(Wang H,Lou J,Gu H,等.一株筛选自多环芳烃污染土壤的新型菌株Massilia sp.WF1及其对菲的高效降解[J].《环境科学与污染研究》2016,23(13):13378-13388)；

3.Masakorala K,Yao J,Cai M,et al.Isolation and characterization of anovel phenanthrene(PHE)degrading strain Psuedomonas sp.USTB-RU from petroleumcontaminated soil[J].Journal of hazardous materials,2013,263:493-500(Masakorala K,Yao J,Cai M,等.从石油污染土壤中所分离出的一株新型菲降解菌Psuedomonas sp.USTB-RU及其特性[J].《有害物质期刊》2013,263:493-500)；

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发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种简单可靠的筛选多环芳烃高效降解菌的方法及所得的一株高效降解菌，该菌兼有降解菲和芘的能力，且降解速率快、降解效果好。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种多环芳烃高效降解菌WY6，为分枝杆菌WY6(Mycobacterium sp.WY6)，其保藏号为：CCTCC NO:M 2017373。

本发明还同时提供了上述多环芳烃高效降解菌WY6的用途：治理土壤中多环芳烃(PAHs)高浓度污染。

对于100mg L^-1菲降解率达99.75％，对于50mg L^-1芘降解率达98.73％。

本发明还同时提供了一种筛选多环芳烃高效降解菌的方法，包括以下步骤：

1)、土壤PAHs降解菌的驯化：

在5g的PAHs污染土壤中加入45mL灭菌水，在28℃、130rpm条件下振荡培养2小时，获得土悬液；

在1mL土悬液中加入9mL PAHs降解菌驯化培养基于28℃、130rpm条件恒温振荡器中振荡培养14天，得驯化培养后的土悬液；

2)、土壤PAHs降解菌的筛选：

将步骤1)所得的驯化培养后土悬液分别稀释10³、10⁴、10⁵倍，各吸取200μL稀释液涂布于PAHs降解菌筛选平板上，置于28℃培养箱中培养；

挑选具有降解圈的单菌落划线接种至新的PAHs降解菌筛选平板上，纯化数代，待其菌落形态单一、稳定后，得多环芳烃高效降解菌。

作为本发明的筛选多环芳烃高效降解菌的方法的改进：

所述步骤2)中，通过16S rRNA基因对菌落进行鉴定，满足可培养条件并对降解菌筛选平板对应PAHs污染物具有降解能力的为多环芳烃降解菌。

作为本发明的筛选多环芳烃高效降解菌的方法的进一步改进：所述步骤1)中的PAHs降解菌驯化培养基的配制方法为依次进行以下步骤：

A.称取0.50g NaNO₃、1.00g KH₂PO₄、0.02g CaCl₂、0.20g MgSO₄、0.50g(NH₄)₂SO₄、1.00g NaH₂PO₄·H₂O溶解于1L去离子水中，搅拌混匀后，调节pH至6.5(采用浓度为6mol L^-1的氢氧化钠溶液进行调节)；灭菌(121℃高温高压灭菌30min)，得灭菌无机盐液体培养基；

B.吸取200μL浓度为5000ppm的PAHs母液(单一PAHs污染物，丙酮为溶剂)，待PAHs母液中的丙酮挥发后，形成一层PAHs污染物薄膜；

向上述PAHs污染物薄膜加入9mL灭菌无机盐液体培养基，得PAHs降解菌驯化培养基。

作为本发明的筛选多环芳烃高效降解菌的方法的进一步改进：所述步骤2)中PAHs降解菌筛选平板配置方法为依次进行以下步骤：

A、称取0.50g NaNO₃、1.00g KH₂PO₄、0.02g CaCl₂、0.20g MgSO₄、0.50g(NH₄)₂SO₄、1.00g NaH₂PO₄·H₂O溶解于1L去离子水中，搅拌混匀后，调节pH至6.5(采用浓度为6mol L^-1的氢氧化钠溶液进行调节)，然后添加15g琼脂粉，加热使琼脂粉溶解，混匀后灭菌(121℃高温高压灭菌30min)，得灭菌培养基Ⅰ；

待灭菌培养基Ⅰ冷却至50±5℃，倒15±1mL于培养皿中(90mm直径的培养皿)；室温下放置至凝固(约12±2小时)，得PAHs降解菌筛选平板下层；

B、称取0.125g NaNO₃、0.25g KH₂PO₄、0.005g CaCl₂、0.05g MgSO₄、0.125g(NH₄)₂SO₄、0.25g NaH₂PO₄·H₂O溶解于250mL去离子水中，混合均匀后，调节pH至6.5(采用浓度为6mol L^-1的氢氧化钠溶液进行调节)；然后添加3.125g琼脂粉，加热使琼脂粉溶解，混匀后灭菌(121℃高温高压灭菌30min)，得灭菌培养基Ⅱ；

待灭菌培养基Ⅱ冷却至50±5℃，加入25mL的5000mg L^-1PAHs母液(任一PAHs污染物，丙酮为溶剂)；均匀混合，待PAHs母液中的丙酮挥发；

C、吸取5mL步骤B所得物均匀分布于步骤A所得的PAHs降解菌筛选平板下层的表面，先室温下放置至凝固(约12±2小时)再继续放置直至培养皿内无水蒸气产生(约36～48小时)；得PAHs降解菌筛选平板。

作为本发明的筛选多环芳烃高效降解菌的方法的进一步改进：

所述PAHs包括萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并[a]蒽、屈、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并[a]芘、茚苯(1，2,3-cd)芘、二苯并(a,h)蒽、苯并(g h i)苝。

上述共计16种PAHs污染物，本发明中仅以菲、芘为例。

在本发明中，对采用本发明方法筛选获得的多环芳烃高效降解菌进行如下实验：

PAHs降解菌降解能力验证

在9mL的PAHs降解菌驯化培养基加入1mL菌悬液(OD_600nm＝1.0)；于28℃、130rpm条件恒温振荡器中振荡培养，每12h取样测定残留PAHs浓度，计算降解菌PAHs降解率。

最终获得的高效降解菌Mycobacterium sp.WY6的相应信息如下：

所述高效降解菌WY6所属Mycobacterium，中文名称为分枝杆菌，分离于福建三明市某PAHs污染土壤。菌株WY6为革兰氏阳性菌，菌体呈杆状，长2-3μm，在降解菌筛选培养基上其菌落呈圆形，单菌落整体呈黄色，中心为橘黄色，表面较为湿润。液体培养条件下，菌株WY6分别对菲和芘均具有较好的降解能力：以100mg L^-1菲为唯一碳源时，48h降解率为99.75％；以50mg L^-1芘为唯一碳源时，72h降解率为98.73％。将菌株Mycobacterium sp.WY6进行保藏，保藏名称：分枝杆菌WY6Mycobacterium sp.WY6，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2017373，保藏时间2017年6月26日。

本发明的技术方案包括土壤PAHs降解菌的驯化、PAHs降解菌的筛选及使用该方法所筛选出的一株高效降解菌Mycobacterium sp.WY6。将该方法用于获取污染土壤中PAHs降解菌株，提高了对以PAHs降解菌的获得率，丰富了治理PAHs污染的降解菌库，为进一步治理土壤PAHs高浓度污染提供可能。菌株Mycobacterium sp.WY6是依据本发明所述筛选方法获得的PAHs降解菌之一，该菌兼有降解菲和芘的能力，且降解速率快、降解效果好。

综上所述，本发明提供了一种筛选多环芳烃高效降解菌的完整方法，具体为：(1)提供PAHs污染土壤降解菌群驯化方法；(2)提供较好的可视化平板筛选方法，获得PAHs降解菌种类、数量多。(3)采用该方法所获得降解菌Mycobacterium sp.WY6对两种多环芳烃污染物(菲和芘)降解效果好，具有较好的应用前景。本发明方法简单、可靠，一般实验室容易实施，故有望推广应用于大量获得PAHs高效降解菌。不仅如此，所筛选出菌株表现出较好的降解能力，具有较高的应用价值，为环境中PAHs高浓度污染的生物降解治理提供技术支撑。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为PAHs降解菌筛选平板的示意图；

图2为在土壤中筛选到的多环芳烃菲高效降解菌16S rRNA基因***发育树；

图3为在土壤中筛选到的多环芳烃芘高效降解菌16S rRNA基因***发育树；

图4为菌株Mycobacterium sp.WY6 16S rRNA基因***发育树；

图5为菌株Mycobacterium sp.WY6nidA基因***发育树；

图6为菌株Mycobacterium sp.WY6透射电镜图与筛选平板上菌落形态；

图7为菌株Mycobacterium sp.WY6液体培养与土壤培养降解效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

一、PAHs降解菌驯化培养基(以驯化菲高效降解菌为例)配制方法为依次进行以下步骤：

1、称取无机盐(0.50g NaNO₃，1.00g KH₂PO₄，0.02g CaCl₂，0.20g MgSO₄，0.50g(NH₄)₂SO₄，1.00g NaH₂PO₄·H₂O)溶解于1L去离子水中；搅拌混匀后，采用浓度为6mol L^-1的氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.5；121℃高温高压灭菌30min待用，即制得灭菌无机盐液体培养基。

2、吸取200μL浓度为5000ppm的菲母液(称取0.5g菲粉末溶解于100mL丙酮中，即得5000ppm菲母液)添加至50mL灭菌锥形瓶底部；待丙酮完全挥发，即在锥形瓶内底部形成一层菲污染物薄膜；

吸取9mL上述灭菌无机盐液体培养基加入上述50mL三角瓶中，即得菲降解菌驯化培养基(实际使用状态的终浓度为100mg L^-1)。

备注说明：

由于实际使用时，是将1mL土悬液中加入9mL PAHs降解菌驯化培养基中，因此，定义成其使用状态的终浓度为100mg L^-1。

将上述步骤2中的菲改成16种PAHs中的其他任一污染物，即能获得该污染物的该终浓度的降解菌驯化培养基。

更改步骤2中的菲母液的浓度，就能相应获得所对应使用状态终浓度的菲降解菌驯化培养基。

二、PAHs降解菌筛选平板(以筛选菲高效降解菌为例)配置方法为依次进行以下步骤：

1、称取无机盐(0.50g NaNO₃，1.00g KH₂PO₄，0.02g CaCl₂，0.20g MgSO₄，0.50g(NH₄)₂SO₄，1.00g NaH₂PO₄·H₂O)溶解于1L去离子水中；搅拌混匀后，采用浓度为6mol L^-1的氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.5；称取15g琼脂粉添加于上述无机盐液体培养基中，加热使得琼脂粉溶解，混匀；121℃高温高压灭菌30min，得灭菌培养基Ⅰ；

120rpm振荡使灭菌培养基Ⅰ混匀并冷却至50℃左右(避免摇晃过于剧烈产生气泡)；倾倒至规格为90mm直径的培养皿中，每个培养皿中倾倒约15mL；室温下放置过夜(约12小时)使其冷却凝固，得PAHs降解菌筛选平板下层；待用；

2、称取无机盐(0.125g NaNO₃，0.25g KH₂PO₄，0.005g CaCl₂，0.05g MgSO₄，0.125g(NH₄)₂SO₄，0.25g NaH₂PO₄·H₂O)溶解于250mL去离子水中，混合均匀后，采用浓度为6mol L^-1的氢氧化钠溶液调节pH至6.5；称取3.125g琼脂粉加入至上述无机盐液体培养基中，加热使得琼脂粉溶解，搅拌混匀；121℃高温高压灭菌30min；得灭菌培养基Ⅱ；

120rpm振荡使灭菌培养基Ⅱ混匀并冷却至50℃左右(避免摇晃过于剧烈产生气泡)，吸取并加入25mL 5000mg L^-1菲母液(0.5g菲粉末溶解于100mL丙酮中，即得5000mg L^-1菲母液)；用10mL移液枪反复吹打(小心操作避免产生气泡)，使得污染物(即，菲母液)与培养基均匀混合，并使得丙酮挥发；

3、吸取5mL步骤2的所得物均匀分布于步骤1所得的菲降解菌筛选平板下层表面；先室温下放置过夜(约12小时)使其冷却凝固，再继续室温下放置直至培养皿内无水蒸气产生(约36～48小时)后待用；制得菲降解菌筛选平板。

备注说明：将上述步骤2中的菲改成16种PAHs中的其他任一污染物，即能获得该污染物降解菌筛选平板。

更改步骤2中的菲母液的浓度，就能相应获得所对应终浓度的菲降解菌筛选平板。

实施例1、一种从土壤中筛选菲高效降解菌的方法，依次进行如下步骤：

1)称取5g采于福建三明市某PAHs污染土壤，重悬于45mL灭菌水中，置于250mL灭菌锥形瓶中振荡(28℃、130rpm)培养2小时，获得土悬液。

2)吸取1mL步骤1)所得土悬液加入至9mL菲降解菌驯化培养基(菲浓度为100mg L^-1)中，于28℃、130rpm条件恒温振荡器中振荡培养14天；得驯化培养后的土悬液。

3)将步骤2)所得的得驯化培养后的土悬液分别稀释10³、10⁴、10⁵倍(体积倍)，各吸取200μL稀释液涂布于菲降解菌筛选平板上，置于28℃培养箱中培养，每日观察平板上是否有菌落生成。

4)选取菌落外圈具有透明降解圈的单菌落，划线接种于新的菲降解菌筛选平板上，多代纯化。

5)待其菌落形态单一、稳定后通过16S rRNA基因对其进行鉴定并保存菌种；即，满足可培养条件并对菲具有降解能力的多环芳烃降解菌。

通过上述实施例1所述方法，从土壤样品中共获得7株对菲具有降解能力的菌株，经过16S rRNA基因测序鉴定，两株菌(PHE-1与PHE-2)与已报道的菌株Mycobacteriumpallens strain czh-8具有较高的相似性，两株菌(PHE-3与PHE-4)与已报道的菌株Mycobacterium crocinum strain czh-42具较高的相似性，其他三株菌分别与Cupriavidus metallidurans strain NBRC 102507,Dyella kyungheensis strain THG-B117和Dokdonella kunshanensis strain DC-3具有较高的相似性，如图2和表1所示。

表1、WY6及相似菲降解菌株16S rRNA基因序列相似性矩阵表

注：

PHE-1，即，PHE-1(Mycobacterium sp.WY6)；

NR 043760，即，Cupriavidus metallidurans strain NBRC 102507(NR 043760)；

NR 109582，即，Dokdonella kunshanensis strain DC-3(NR 109582)；

NR 109691，即，Dyella kyungheensis strain THG-B117(NR 109691)；

NR 043901，即，Mycobacterium crocinum strain czh-42(NR 043901)；

NR 042913，即，Mycobacterium houstonense strain ATCC 49403(NR 042913)；

NR 043760，即，Mycobacterium pallens strain czh-8(NR 043760)。

实施例2、从土壤中筛选芘高效降解菌的方法，依次进行如下步骤：

1)、称取5g采于福建三明市某PAHs污染土壤，重悬于45mL灭菌水中，置于250mL灭菌锥形瓶中振荡(28℃、130rpm)培养2小时，获得土悬液。

2)、吸取1mL 1)步骤1)所得土悬液加入至9mL芘降解菌驯化培养基(芘浓度为100mg L^-1)中，于28℃、130rpm条件恒温振荡器中振荡培养14天；得驯化培养后的土悬液。

3)、将步骤2)所得的得驯化培养后的土悬液分别稀释10³、10⁴、10⁵倍，各吸取200μL稀释液涂布于芘降解菌筛选平板上，置于28℃培养箱中培养，每日观察平板上是否有菌落生成。

4)、选取菌落外圈具有透明降解圈的单菌落，划线接种于新的芘降解菌筛选平板上，多代纯化。

5)、待其菌落形态单一、稳定后通过16S rRNA基因对其进行鉴定并保存菌种；即，满足可培养条件并对芘具有降解能力的多环芳烃降解菌。

通过上述实施例2所述方法，共获得9株对菲具有降解能力的菌株，经过16S rRNA基因测序鉴定，一株菌(PYR-1)与已报道菌株Mycobacterium pallens strain czh-8具有较高的相似性，两株菌(PYR-2与PYR-3)与已报道的菌株Mycobacterium crocinum strainczh-42具有较高的相似性，一株菌(PYR-4)与已报道的菌株Mycobacterium chubuensestrain ATCC 27278具有一定相似性，其他五株菌分别与Pseudonocardia sulfidoxydansstrain 592,Pseudomonas carboxydohydrogena strain DSM 1083，Cupriavidusmetallidurans strain CH34，Dyella jiangningensis strain SBZ3-12和Dokdonellakunshanensis strain DC-3具有较高的相似性，如图3和表2所示。

表2、WY6及相似芘降解菌株16S rRNA基因序列相似性矩阵表

注：

PYR-1，即，PYR-1(Mycobacterium sp.WY6)；

NR 024703，即，Pseudomonas carboxydohydrogena strain DSM 1083(NR024703)；

NR 074704，即，Cupriavidus metallidurans strain CH34(NR 074704)；

NR 029324，即，Pseudonocardia sulfidoxydans strain 592(NR 029324)；

NR 121724，即，Dyella jiangningensis strain SBZ3-12(NR 121724)；

NR 109582，即，Dokdonella kunshanensis strain DC-3(NR 109582)；

NR 043901，即，Mycobacterium crocinum strain czh-42(NR 043901)；

NR 043760，即，Mycobacterium pallens strain czh-8(NR 043760)；

NR 041902，即，Mycobacterium chubuense strain ATCC 27278(NR 041902)。

结合实施例1与实施例2发现，对菲具有降解能力的菌株PHE-1与对芘有降解能力的菌株PYR-1在16S rRNA基因上均与菌株Mycobacterium pallens strain czh-8具有较高的相似性。经比对，菌株PHE-1与菌株PYR-1的16S rRNA基因序列完全一致，在以16S rRNA基因分类鉴定上实际为同一菌株。经16S rRNA基因鉴定比对，该菌株属于分枝杆菌属，将其命名为Mycobacterium sp.WY6，与Mycobacterium pallens strain czh-8菌株16S rRNA基因相似性较高(图4)。为进一步区别菌株Mycobacterium sp.WY6与菌株Mycobacteriumpallens strain czh-8，将菌株Mycobacterium sp.WY6的nidA基因进行扩增比对发现(图5)，与其nidA基因相似性最高的菌株为Mycobacterium sp.KMS，而与菌株Mycobacteriumpallens strain czh-8相似度相对较低，表明两株菌在16S rRNA基因上虽相似度较高，但在对污染物的降解机制上有所不同。据相关报道表明(Hennessee,et al.2009)，Mycobacterium pallens strain czh-8对多环芳烃荧蒽和芘有一定的降解能力，但具体降解效率报道中未予以说明，也与菌株Mycobacterium sp.WY6具有对菲和芘的降解能力有本质上的不同。与此同时，菌株Mycobacterium sp.WY6与菌株Mycobacterium sp.KMS的16SrRNA基因相似度低于97％，也属于分枝杆菌属下不同的菌种，如表3所示。

表3、WY6及相似菌株16S rRNA基因序列相似性矩阵表

表4、WY6及相似菌株nidA基因序列相似性矩阵表

将菌株Mycobacterium sp.WY6进行保藏，保藏名称：分枝杆菌WY6Mycobacteriumsp.WY6，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2017373，保藏时间2017年6月26日。

实验一、降解菌Mycobacterium sp.WY6液体培养与土壤培养降解能力测定

前期实验表明，Mycobacterium sp.WY6分别对两种污染物菲和芘具有降解能力，为进一步探索该菌株对菲和芘的降解能力，故进行如下步骤：

1、液体培养：

1)、分别将菲或芘降解菌驯化培养基置于50mL锥形瓶中，其中菲和芘终浓度分别为100mg L^-1和50mg L^-1。

以菲的浓度为例，菲母液(丙酮溶解)浓度为5000mg L^-1，吸取200μL加入50mL锥形瓶，丙酮挥发完毕后，锥形瓶中菲净含量为5000mg L^-1×(200μL÷1000÷1000)＝1mg，之后再加入9mL灭菌无机盐液体培养基及1mL菌液，相当于1mg对应培养基体积为10mL，浓度即为1mg÷(10mL÷1000)＝100mg L^-1。

2)、添加1mL Mycobacterium sp.WY6菌液(OD₆₀₀＝1.0)，以添加1mL无菌水为对照。

3)、每12h取样一次，向10mL培养体系中等比例添加10mL甲醇，超声30min。

4)、将3)中液体过膜(0.22μm PTFE滤膜)去除菌体。收集1.5mL过滤液体于2mL上样品中用于上样。

5)、采用HPLC对溶液中残留菲/芘进行测定。

2、土壤培养：

1)、各称取200g土壤于无菌1000mL烧杯中。

2)、分别加入2mL浓度为5000mg L^-1的菲母液和0.8mL浓度为5000mg L^-1芘母液，使菲和芘在土壤中的终浓度分别为50mg kg^-1和20mg kg^-1。

3)、添加Mycobacterium sp.WY6菌液(OD₆₀₀＝1.0菌液约2mL)，使其终浓度为10⁶CFU g^-1，以添加等体积无菌水作为对照。

4)、于28℃条件下避光培养，分别于0，3，7，14，21，28，35天取样。

5)、称取2g土壤于50mL棕色管中，加入10mL正己烷：丙酮(V:V＝1:1)混合溶液，超声提取30min(25℃，53KHz)。

6)、离心管1000×g离心10min，收集上清于新的50mL棕色管中。

7)、重复提取2次，上清收集于6)中棕色管中。

8)、将上清有机相氮吹至干，最后加入2.0mL甲醇溶解。

9)、将8)中液体过膜(0.22μm PTFE滤膜)去除杂质。收集1.5mL用于上样。

10)、采用HPLC对溶液中残留菲/芘进行测定。

通过上述实例表明，菌株Mycobacterium sp.WY6在液体培养和土壤培养中均对菲和芘有较好的降解能力。液体培养中，对于100mg L^-1菲48h降解率便达到99.75％，对于50mgL^-1芘72h达98.73％，相比文献中已报道的多环芳烃降解菌，WY6菌株在降解速率及降解PAHs种类方面均表现出较大的优势。

且将Mycobacterium sp.WY6分别添加进菲、芘污染土壤中，可加速对土壤中菲、芘的降解。在未添加WY6的对照组中，土壤土著微生物需要21天才能将土壤中的菲降解至5mgL^-1左右，需要28天才能将土壤中的芘降解至5mg L^-1以下。与对照组相比，添加Mycobacterium sp.WY6菌株处理组在3天时已将土壤中的菲降解至5mg L^-1左右，在7天时已将土壤中的芘降解为5mg L^-1以下。Mycobacterium sp.WY6菌株可显著加速污染物的降解，缩短了污染物高浓度污染的时间，降低了高浓度PAHs暴露风险，为进一步协助土壤土著低效PAHs降解菌降解菲、芘污染提供条件，具有实际应用价值。详细降解速率如表5、表6、图7所示。

表5、液体培养Mycobacterium sp.WY6对菲/芘降解率

表6、土壤培养Mycobacterium sp.WY6对菲/芘降解率

对比实验1、实验设置条件与实施例1保持一致，但不经过14天培养，其余等同于实施例1。

所得结果为：菲高效降解菌筛选平板上长出的单菌落种类及数量明显少于实施例1，且单菌落长出时间更长。耐受菌较多，降解圈不明显。

对比实验2、实验设置条件与实施例1保持一致，但不将其涂布于该发明所述降解菌筛选平板上，而将其涂布于菲膜平板上，其余等同于实例1。

菲膜平板的配制：

1)称取无机盐(0.50g NaNO₃，1.00g KH₂PO₄，0.02g CaCl₂，0.20g MgSO₄，0.50g(NH₄)₂SO₄，1.00g NaH₂PO₄·H₂O)溶解于1L去离子水中。

2)搅拌混匀后调节pH至6.5。

3)称取15g琼脂粉添加于1L上述无机盐液体培养基中。

4)加热使得琼脂粉溶解，混匀。

5)121℃高温高压灭菌30min。

6)120rpm振荡使灭菌培养基混匀并冷却至50℃左右(避免摇晃过于剧烈产生气泡)。

7)倾倒至规格为90mm直径的培养皿中。每个培养皿中倾倒约20mL。

8)过夜冷却凝固，放置至培养皿内无水蒸气后待用。

9)吸取2mL丙酮溶解的菲母液(5000mg L^-1)，均匀添加至无机盐固体培养基表面，待丙酮挥发后即成菲膜无机盐固体培养基。

所得结果为：平板生长出单菌落时间更长，且降解圈不容易观察，疑似降解菌较多，但经验证后表明大部分菌并无降解能力，使得判断不如PAHs筛选培养基直观，加大了工作量，而实际获得降解菌种类数量更少。

对比实验3、检索文献，比较筛选所得菌株Mycobacterium sp.WY6与现有所报道菌株在无机盐培养基中对污染物的降解效果。

表7、Mycobacterium SP.WY6无机盐液体培养基中降解效果与报道菌株比对

所得结果如下：如表7所示，对菲的降解能力而言，其他菌株可降解100mg L^-1的菲，但要达到相同的降解率，其他菌株如Massilia sp WF1，Psuedomonas sp.USTB-RU分别需要3天和7天的时间，且降解不如Mycobacterium sp.WY6彻底；Pseudomonas sp.Ph6-gfp和BZ-3可降解最高浓度及降解速率均不如Mycobacterium sp.WY6。对芘的降解能力而言，菌株Pseudomonas putida PL2与Mycobacterium sp.WY6具有相同的耐受浓度，均可降解浓度50mg L^-1的芘，但菌株Pseudomonas putida PL2在6天时降解率才达50.00％，降解效果不如Mycobacterium sp.WY6。而菌株Raoultella planticola PL7、Herbaspirillumchlorophenolicum Strain FA1、Pseudomonas sp.BZ-3可耐受浓度与降解速率均不如菌株Mycobacterium sp.WY6。由此可见，菌株Mycobacterium sp.WY6不仅具有可降解多种污染物的能力，且对两种污染物菲和芘都有较高的降解速率和耐受浓度，并且已在土壤中验证其降解能力，可为原位修复多环芳烃菲、芘污染提供理论依据，在实际应用中具有较高的应用前景。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例，显然不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (7)

1.多环芳烃高效降解菌WY6，其特征在于：为分枝杆菌WY6(Mycobacterium sp.WY6)，其保藏号为：CCTCC NO:M 2017373。

2.如权利要求1所述的多环芳烃高效降解菌WY6的用途，其特征在于：治理土壤中多环芳烃高浓度污染。

3.筛选多环芳烃高效降解菌的方法，其特征是包括以下步骤：

1)、土壤PAHs降解菌的驯化：

在5g的PAHs污染土壤中加入45mL灭菌水，在28℃、130rpm条件下振荡培养2小时，获得土悬液；

在1mL土悬液中加入9mL PAHs降解菌驯化培养基于28℃、130rpm条件恒温振荡器中振荡培养14天，得驯化培养后的土悬液；

2)、土壤PAHs降解菌的筛选：

将步骤1)所得的驯化培养后土悬液分别稀释10³、10⁴、10⁵倍，各吸取200μL稀释液涂布于PAHs降解菌筛选平板上，置于28℃培养箱中培养；

挑选具有降解圈的单菌落划线接种至新的PAHs降解菌筛选平板上，纯化数代，待其菌落形态单一、稳定后，得多环芳烃高效降解菌。

4.根据权利要求3所述的筛选多环芳烃高效降解菌的方法，其特征是：

所述步骤2)中，通过16S rRNA基因对菌落进行鉴定，满足可培养条件并对降解菌筛选平板对应PAHs污染物具有降解能力的为多环芳烃降解菌。

5.根据权利要求3或4所述的筛选多环芳烃高效降解菌的方法，其特征是所述步骤1)中的PAHs降解菌驯化培养基的配制方法为依次进行以下步骤：

A.称取0.50g NaNO₃、1.00g KH₂PO₄、0.02g CaCl₂、0.20g MgSO₄、0.50g(NH₄)₂SO₄、1.00gNaH₂PO₄·H₂O溶解于1L去离子水中，搅拌混匀后，调节pH至6.5；灭菌，得灭菌无机盐液体培养基；

B.吸取200μL浓度为5000ppm的PAHs母液，待PAHs母液中的丙酮挥发后，形成一层PAHs污染物薄膜；

向上述PAHs污染物薄膜加入9mL灭菌无机盐液体培养基，得PAHs降解菌驯化培养基。

6.根据权利要求3或4所述的筛选多环芳烃高效降解菌的方法，其特征是所述步骤2)中PAHs降解菌筛选平板配置方法为依次进行以下步骤：

A、称取0.50g NaNO₃、1.00g KH₂PO₄、0.02g CaCl₂、0.20g MgSO₄、0.50g(NH₄)₂SO₄、1.00gNaH₂PO₄·H₂O溶解于1L去离子水中，搅拌混匀后，调节pH至6.5，然后添加15g琼脂粉，加热使琼脂粉溶解，混匀后灭菌，得灭菌培养基Ⅰ；

待灭菌培养基Ⅰ冷却至50±5℃，倒15±1mL于培养皿中；室温下放置至凝固，得PAHs降解菌筛选平板下层；

B、称取0.125g NaNO₃、0.25g KH₂PO₄、0.005g CaCl₂、0.05g MgSO₄、0.125g(NH₄)₂SO₄、0.25g NaH₂PO₄·H₂O溶解于250mL去离子水中，混合均匀后，调节pH至6.5；然后添加3.125g琼脂粉，加热使琼脂粉溶解，混匀后灭菌，得灭菌培养基Ⅱ；

待灭菌培养基Ⅱ冷却至50±5℃，加入25mL的5000mg L^-1PAHs母液；均匀混合，待PAHs母液中的丙酮挥发；

C、吸取5mL步骤B所得物均匀分布于步骤A所得的PAHs降解菌筛选平板下层的表面，先室温下放置至凝固，再继续放置直至培养皿内无水蒸气产生；得PAHs降解菌筛选平板。

7.根据权利要求5或6所述的筛选多环芳烃高效降解菌的方法，其特征是：

所述PAHs包括萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并[a]蒽、屈、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并[a]芘、茚苯(1，2,3-cd)芘、二苯并(a,h)蒽、苯并(g h i)苝。