CN107410033B - 民族香料植物麻根的快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种民族香料植物麻根(P.magen B.Q.Cheng ex C.L.long&J.Yang)的快速繁殖方法。该方法包括：包括选取快速繁殖材料、优化培养基和建立无菌无性系培养、促进丛芽形成、生根培养步骤，本发明可操作性强，能快速扩大种苗基数,为日渐稀少的麻根(P.magen B.Q.Cheng ex C.L.long&J.Yang)解决它繁殖慢的问题、为满足傣族同胞对该香料的的喜好和保护应用及为将来保护该物种、引种回归提供技术保障。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及民族香料植物麻根((P.magen B.Q.Chengex C.L.long&J.Yang))的快速繁殖方法
技术背景：
胡椒属(Piper)是胡椒科最大的属，大约1000-2000个种。该属主要分布在热带地区，中国大约60个种(Cheng et al.1999)，其中有30多种胡椒属植物具有良好的药用价值，在民间传统应用有祛风散寒、行气活血、散瘀止痛、镇痛的功效。
麻根(P.magen B.Q.Cheng ex C.L.long&J.Yang)为木质攀援藤本，主要生长在云南南部西双版纳地区海拔大约1500m的石灰岩石壁上。麻根具有特殊的香味，在当地少数民族社区被用作一种特殊的食用香料食用,版纳的傣族过傣历年几乎都要去买几两麻根。由于野外的资源量少，该种香料的价格在当地也是一路攀升200-500元/kg，由于金钱利益和当地社区食用风俗的驱使，麻根在野外的资源量急剧下降，其濒危程度加剧。目前在野外观察到的麻根的主要繁殖方法是利用种子进行繁殖，然而，麻根属于雌雄异株植物，在野外见到的实生苗几乎都是幼体植株，从幼体到成体植株大概要5-10年的时间，民间主要采食成年植株，成年植株破坏尤为严重，几乎在野外见不到成年的植株的花以及成熟的种子，用种子繁殖几乎没有可能。该物种2017年8月才作为新种正式发表,目前没有任何关于麻根繁殖的相关报道。因此利用人工繁育方法解决麻根的繁殖问题，是解决麻根保护及可持续利用的重要技术。
发明内容：
本发明目的在于提供一种民族香料植物麻根(P.magen B.Q.Cheng ex C.L.long&J.Yang))的快速繁殖方法，以及离体保存方法。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案:
民族香料植物麻根的快速繁殖方法，该方法包括选取快速繁殖材料、优化培养基和建立无菌无性系培养、促进丛芽形成、生根培养、试管苗移栽步骤，取发芽后生长三个月的麻根带节芽条,用75％乙醇消毒10s，无菌水冲洗2次，用0.1％HgCl2水溶液消毒6min，用无菌水冲洗5-6次，每次1min，之后用消毒后的无菌虑纸吸干水分，剪去伤口部分0.2cm，剪成带节0.5cm小段，接入准备好的诱导茎段长出腋芽的培养基①1/4MS+BA0.02mg/L+NAA0.05mg/L；培养35天后转入诱导茎段长出丛芽的培养基②1/4MS+BA0.2mg/L+IAA0.1mg/L和③1/4MS+BA0.5mg/L；培养60天后转入诱导生根的培养基为④1/4MS+IAA1mg/L+PP3330.1mg/L。
根据所述的民族香料植物麻根的快速繁殖方法，其中所述的选取快速繁殖材料步骤是用采自云南南部西双版纳地区海拔1400m-1600m的石灰岩石壁上的麻根，带回室内栽种到盆子里(装有麻根生长环境的原生土:红壤土:腐殖土1:1:1的土壤的盆子)，十个月后发出新芽，新芽生长3个月后用作快速繁殖的外植体。
根据所述的民族香料植物麻根的快速繁殖方法，其中所述的优化培养基和建立无菌无性系培养步骤是采用培养条件为：基本培养基为1/4MS，诱导茎段长出腋芽的培养基为①1/4MS+BA0.02mg/L+NAA0.05mg/L；诱导幼茎段丛芽增殖的培养基为②1/4MS+BA0.2mg/L+IAA0.1mg/L和③1/4MS+BA0.5mg/L；诱导生根的培养基为④1/4MS+IAA1mg/L+PP333 0.1mg/L；培养基①②③糖浓度为3％，培养基④糖浓度为2％；培养条件均为：所有培养基PH 5.8，培养温度26±2℃，光照时间12h.d-1，光照强度20-40μmol.m-2.S-1。
根据所述的民族香料植物麻根的快速繁殖方法，其中所述的促进丛芽形成步骤是麻根幼茎经75％酒精溶液浸泡10s，无菌水冲洗2次，用0.1％升汞溶液处理6min后，无菌水冲洗4次，用灭菌手术剪去掉叶片，修剪成长约0.5cm带1节的切段，放在培养基①上培养，经35d培养后，每个茎段节长出腋芽1-2个，诱导率为98％，每块材料的芽的平均数为1.2个，取下茎段上所发出的芽在培养基②上培养60d，继代周期为60d，建成麻根快速繁殖无性系，增殖速率达1:4，再在培养基②上经过60d的培养，增殖速度达1:4，达到麻根工厂化生产的要求。
根据所述的民族香料植物麻根的快速繁殖方法，其中所述的生根培养步骤是在培养基③上培养，3-5丛/瓶芽接种35d后，每瓶得到高度达3-4cm以上芽条4-6个，同时也有增殖，月增殖速度为1:4，选取芽条高度在3cm以上的，切取下来放在培养基④1/4MS+IAA1mg/L+PP333 0.1mg/L上培养，10d-25d开始生根，随着培养时间延长生根率达99％，每株2-5条根，根长0.8-1.2cm，植株生长健壮。
根据所述的民族香料植物麻根的快速繁殖方法，其中所述的试管苗移栽步骤是芽条接入生根培养基30天后，根长1.4cm以上时移栽到栽培基质上，所述栽培基质为：栽培土∶腐殖土∶红壤土∶珍珠岩3:1:0.5，加0.1％百菌清搅拌均匀堆上三天装盆备用，生根瓶苗先放在常温下，松开瓶盖1天，第二天完全打开瓶盖，露两天后，第四天把附在根上的培养基轻轻洗干净，晾干30min后，栽入准备好的盆子里，浇透水，之后放入外罩70％遮阴网、平均温度21℃±2℃的温室中，20天后统计成活率为99％。
根据所述的民族香料植物麻根的快速繁殖方法，该方法进一步进行离体保存，所述的离体保存步骤是以试管生根苗的培养物类型进行离体保存，采取缓慢生长保存的中短期离体保存的方式，用生长抑制剂CCC1mg/L、5mg/L、10mg/L；PP333 0.5mg/L、1mg/L、5mg/L和ABA0.5mg/L处理；或者采用降低培养温度的方法暗培养4℃进行离体保存，延长继代周期至1年半。
与现有技术相比，本发明具备如下的优益性：
本发明所的麻根是本发明人新发现的植物新种，本发明的快速繁殖方法可操作性强，能快速扩大种苗基数,为日渐稀少的麻根(P.magen B.Q.Cheng ex C.L.long&J.Yang)提供切实有效的繁殖方法，解决了它繁殖慢的问题、为满足广大人民，特别是傣族同胞对该香料的的喜好，以及麻根的保护应用，为将来保护该物种、引种回归提供了技术保障。
该发明用②1/4MS+BA0.2mg/L+IAA0.1mg/L和③1/4MS+BA0.5mg/L培养基，不仅解决了麻根侧芽形成困难的问题，还让侧芽生长健壮利于生根和后续移栽成活，为快速扩大种苗基数提供技术保障。
具体实施方式：
下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1：
植物麻根(P.magen B.Q.Cheng ex C.L.long&J.Yang))的快速繁殖：
包括：无菌无性系的建立、培养基优化选择、筛选促进丛芽形成以及生根培养,其中：诱导茎段长出腋芽的培养基为①1/4MS+BA0.02mg/L+NAA0.05mg/L；诱导幼茎段丛芽增殖的培养基为②1/4MS+BA0.2mg/L+IAA0.1mg/L和③1/4MS+BA0.5mg/L；诱导生根的培养基为④1/4MS+IAA1mg/L+PP3330.1mg/L
繁殖方法：
一、无菌无性系的建立：
材料来源：植物麻根(P.magen B.Q.Cheng ex C.L.long&J.Yang)采自云南南部西双版纳地区海拔大约1500m的石灰岩石壁上。
无菌系的建立首先是外植体的消毒与灭菌，外植体材料的灭菌是组培中的重要环节，在组培初始灭菌较困难。既要求彻底杀死外材表面的微生物，又要尽可能少伤害外材组织和表面细胞，通过对杀菌程序的研究达到了理想效果，具体做法如下：
从野外至温室的过程：
培养材料植物麻根(P.magen B.Q.Cheng ex C.L.long&J.Yang))从野外带回栽种到盆子里(装有麻根生长环境的原生土：红壤土：腐殖土1:1:1的土壤的盆子)，十个月后发出新芽，新芽生长3个月后用作快速繁殖材料
二、培养条件：基本培养基为1/4MS(MS大量元素四分之一，其余成分与MS同)，诱导茎段长出腋芽的培养基为①1/4MS+BA0.02mg/L+NAA0.05mg/L；诱导幼茎段丛芽增殖的培养基为②1/4MS+BA0.2mg/L+IAA0.1mg/L和③1/4MS+BA0.5mg/L；诱导生根的培养基为④1/4MS+IAA1mg/L+PP333 0.1mg/L；培养基①②③糖浓度为3％，培养基④糖浓度为2％；培养条件均为：所有培养基PH 5.8，培养温度26±2℃，光照时间12h.d-1，光照强度20-40μmol.m-2.S-1。
三、快速繁殖
麻根幼茎经75％酒精溶液浸泡10s，无菌水冲洗2次，用0.1％升汞溶液处理6min后，无菌水冲洗4次，用灭菌手术剪去掉叶片，修剪成长约0.5cm带1节的切段，放在培养基①上培养，约经35d培养后，每个茎段节长出腋芽1-2个，诱导率为98％，每块材料的芽的平均数为1.2个。取下茎段上所发出的芽在培养基②上培养60d(继代周期为60d)，便建成了麻根快速繁殖无性系，增殖速率可达1:4，再在培养基②上经过60d的培养，增殖速度可达1:4。达到麻根工厂化生产的要求。丛芽再生方式有两种：一种是茎段叶腋长出，切下后采取无菌扦插的方式，可连续增殖下去；另一种方式为在茎段基部切口处形成丛生芽，产生位置仍在叶腋处，因为此处接触培养基营养供给充足，芽发生和生长很快，所以是丛生芽的形式出现，在这种培养基上培养的材料，无愈伤组织产生，说明这种无性快繁方式得到的芽生成的试管苗遗传性是稳定的。
四、生根培养
在培养基③上培养，3-5丛/瓶芽接种35d后，每瓶可得到高度达3-4cm以上芽条5个左右，同时也有增殖，月增殖速度为1:4。选取芽条高度在3cm以上的，切取下来放在培养基④1/4MS+IAA1mg/L+PP333 0.1mg/L上培养，10d-25d便开始生根随着培养时间延长几乎达99％根率，每株2-5条根，根长约1cm，植株生长健壮。
五、试管苗(炼苗)移栽
接入生根培养基30天后，根长约1.5cm时可移栽。具体操作方法1、栽培土：腐殖土、红壤土、珍珠岩(3:1:0.5)，加0.1％百菌清搅拌均匀堆上三天装盆备用。2、生根瓶苗先放在常温下，松开瓶盖1天，第二天完全打开瓶盖，露两天后，第四天把附在根上的培养基轻轻洗干净，稍稍晾干(30min)栽入准备好的盆子里，浇透水。之后放入外罩70％遮阴网、平均温度21℃±2℃的温室中，20天后统计：成活率在99％.
六、结果
通过优化选择筛选出诱导幼茎段丛芽增殖最好的培养基为②1/4MS+BA0.2mg/L+IAA0.1mg/L和③1/4MS+BA0.5mg/L，该培养基诱导出来的芽比较健壮，为后面提高生根苗移栽成活率提供优质材料；诱导生根的培养基为④1/4MS+IAA1mg/L+PP333 0.1mg/L，该生根培养基诱导出来的根系发达、整齐，因此移栽容易成活，为今后产业化生产提供了技术保障
七、离体保存
首先对离体保存中培养物类型进行选择，在室温下，对麻根丛生芽和试管苗进行了继代周期的比较(以培养物叶片黄化，芽条的枯死超过20％为标准，确定继代与否，结果显示：丛生芽继代周期为70d，而试管生根苗继代周期为8个月。本文以试管生根苗的培养物类型进行离体保存。主要采取缓慢生长保存的中短期离体保存的方式，在试验了生长抑制剂CCC1mg/L(单位下同)、5、10；PP333 0.5、1、5和ABA0.5后，又采用降低培养温度的方法(暗培养4℃)进行离体保存。可延长继代周期至1年半。在培养过程中，原培养条件下麻根培养物60d-70d必须继代。
Claims (7)
1.民族香料植物麻根的快速繁殖方法，其特征在于该方法包括选取快速繁殖材料、优化培养基和建立无菌无性系培养、促进丛芽形成、生根培养、试管苗移栽步骤，取发芽后生长三个月的麻根带节芽条,用75％乙醇消毒10s，无菌水冲洗2次，用0.1％HgCl2水溶液消毒6min，用无菌水冲洗5-6次，每次1min，之后用消毒后的无菌虑纸吸干水分，剪去伤口部分0.2cm，剪成带节0.5cm小段，接入准备好的诱导茎段长出腋芽的培养基①1/4MS+BA0.02mg/L+NAA0.05mg/L；培养35天后转入诱导茎段长出丛芽的培养基②1/4MS+BA0.2mg/L+IAA0.1mg/L和③1/4MS+BA0.5mg/L；培养60天后转入诱导生根的培养基为④1/4MS+IAA1mg/L+PP333 0.1mg/L。
2.根据权利要求1所述的民族香料植物麻根的快速繁殖方法，其特征在于所述的选取快速繁殖材料步骤是用采自云南南部西双版纳地区海拔1400m-1600m的石灰岩石壁上的麻根，带回室内栽种到装有麻根生长环境的原生土:红壤土:腐殖土1:1:1的盆子里，十个月后发出新芽，新芽生长3个月后用作快速繁殖的外植体。
3.根据权利要求1所述的民族香料植物麻根的快速繁殖方法，其特征在于所述的优化培养基和建立无菌无性系培养步骤是采用培养条件为：基本培养基为1/4MS，诱导茎段长出腋芽的培养基为①1/4MS+BA0.02mg/L+NAA0.05mg/L；诱导幼茎段丛芽增殖的培养基为②1/4MS+BA0.2mg/L+IAA0.1mg/L和③1/4MS+BA0.5mg/L；诱导生根的培养基为④1/4MS+IAA1mg/L+PP333 0.1mg/L；培养基①②③糖浓度为3％，培养基④糖浓度为2％；培养条件均为：所有培养基PH 5.8，培养温度26±2℃，光照时间12h.d-1，光照强度20-40μmol.m-2.S-1。
4.根据权利要求1所述的民族香料植物麻根的快速繁殖方法，其特征在于所述的促进丛芽形成步骤是麻根幼茎经75％酒精溶液浸泡10s，无菌水冲洗2次，用0.1％升汞溶液处理6min后，无菌水冲洗4次，用灭菌手术剪去掉叶片，修剪成长约0.5cm带1节的切段，放在培养基①上培养，经35d培养后，每个茎段节长出腋芽1-2个，诱导率为98％，每块材料的芽的平均数为1.2个，取下茎段上所发出的芽在培养基②上培养60d，继代周期为60d，建成麻根快速繁殖无性系，增殖速率达1:4，再在培养基②上经过60d的培养，增殖速度达1:4，达到麻根工厂化生产的要求。
5.根据权利要求1所述的民族香料植物麻根的快速繁殖方法，其特征在于所述的生根培养步骤是在培养基③上培养，3-5丛/瓶芽接种35d后，每瓶得到高度达3-4cm以上芽条4-6个，同时也有增殖，月增殖速度为1:4，选取芽条高度在3cm以上的，切取下来放在培养基④1/4MS+IAA1mg/L+PP333 0.1mg/L上培养，10d-25d开始生根，随着培养时间延长生根率达99％，每株2-5条根，根长0.8-1.2cm，植株生长健壮。
6.根据权利要求1所述的民族香料植物麻根的快速繁殖方法，其特征在于所述的试管苗移栽步骤是芽条接入生根培养基30天后，根长1.4cm以上时移栽到栽培基质上，所述栽培基质为：栽培土：腐殖土∶红壤土∶珍珠岩3:1:0.5，加0.1％百菌清搅拌均匀堆上三天装盆备用，生根瓶苗先放在常温下，松开瓶盖1天，第二天完全打开瓶盖，露两天后，第四天把附在根上的培养基轻轻洗干净，晾干30min后，栽入准备好的盆子里，浇透水，之后放入外罩70％遮阴网、平均温度21℃±2℃的温室中，20天后统计成活率为99％。
7.根据权利要求1所述的民族香料植物麻根的快速繁殖方法，其特征在于该方法进一步进行离体保存，所述的离体保存步骤是以试管生根苗的培养物类型进行离体保存，采取缓慢生长保存的中短期离体保存的方式，用生长抑制剂CCC1mg/L、5mg/L、10mg/L；PP3330.5mg/L、1mg/L、5mg/L和ABA0.5mg/L处理；或者采用降低培养温度的方法暗培养4℃进行离体保存，延长继代周期至1年半。
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