CN103535285B - 金银花种苗的快速繁殖和离体保存方法 - Google Patents
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Abstract
提供金银花种苗的快速繁殖和离体保存方法，包括无菌无性系的建立，快速繁殖，生根培养，试管苗的假植与移栽，离体保存步骤。金银花具有较高的保健、观赏、药用及生态功能，为我国特有的名贵中药材之一，数有中药之中“青霉素”的美誉。本发明提供了金银花组培中存在问题的解决方案和最佳培养技术。本发明的方法增殖速度达1:4-6，移栽成活率达90%以上，用多效唑（PP333）与吲哚丁酸（IBA）配合使用得到了99%的生根效果，得到的芽生成的试管苗遗传性稳定，用此方法建立的金银花无菌无性系在培养过程几乎无污染发生，且外植体在培养基上很快恢复生长，为大规模工厂化生产金银花优质种苗提供了技术支撑。
Description
所属领域：
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种金银花种苗的快速繁殖和离体保存方法。
背景技术：
金银花是具有较高的保健、观赏、药用及生态功能为一体的物种，为我国特有的名贵中药材之一，数有中药之中“青霉素”的美誉。特别是在2003年抗击SARS的防治中所起的作用，受到人们关注，成为忍冬科资源植物中的重点开发对象。现代药理研究表明：金银花具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤，增强免疫及解热、抗炎、利胆保肝、降血脂、抗生育、止血抗溃疡等多种生物活性。市场上产销两旺、干花蕾价格逐年上涨。但种苗特别是高产优质品种的种苗奇缺。20世纪80年代人们曾经开始了金银花组培研究，但直到近几年有关研究才逐渐增多。但目前金银花组培存在的问题限制了金银花产业的形成与发展。主要问题是：①外植体灭菌困难；②继代时期短（1-2个月）且离体保存无人做；③试管移栽成活率低，试管育苗成本高；④组织培养的试管苗真正大规模应用于生产的很少，仅见李红等（2007）金银花组培工厂化生产与栽培管理技术的报道，但工厂化培育种苗的整体水平不高，关键生产环节技术薄弱，造成繁殖系数低，大大限制了名贵品种的推广应用。迄今，现有技术中未见有金银花种苗的快速繁殖和离体保存方法的报道。
发明内容：
针对现有技术存在的上述不足之处，本发明旨在提供一种金银花种苗的快速繁殖和离体保存方法。提供金银花组培中存在问题的解决方案、技术和最佳培养条件，克服现有技术存在的工厂化培育种苗的整体水平不高，繁殖系数低的缺点，为大规模工厂化生产金银花优质种苗提供技术支撑。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
金银花种苗的快速繁殖和离体保存方法，包括无菌无性系的建立，快速繁殖，生根培养，试管苗的假植与移栽，离体保存步骤，所述无菌无性系的建立是取金银花芽条或幼茎，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞水溶液灭6min,用无菌水冲洗干净，接入培养基中进行快速繁殖，即将幼茎消毒后，去掉叶片，切段，放在培养基①上培养25d，取下茎段上所发出的芽在培养基②上培养60d，(继代周期为30d继代1次)再在培养基③上经过30d的培养；所述生根培养是在培养基③上培养，3-4丛芽/瓶接种30d后，选取芽条高度在3cm以上的，截取下来放在培养基④上培养14d-17d开始生根；所述试管苗的假植与移栽是在移栽过渡前，挑出生根培养20d试管瓶苗，先放在简易荫棚内，10d后移入栽苗基质中，在刚移苗1-2周内用塑料布盖在移出苗的上面保湿，待苗长出新根或新叶后去掉塑料布，并粗放管理培育30d后移入大田，所述离体保存用试管生根苗的培养物类型进行离体保存。
所述的金银花种苗的快速繁殖和离体保存方法，所述培养基采用：基本培养基为1/2MS（MS大量元素减半，其余成分与MS同），诱导茎段长出腋芽的培养基为①1/2MS+BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L；诱导幼茎段丛芽增殖的培养基为②1/2MS+BA0.5mg/L+IBA0.01mg/L和③1/4MS+BA0.3mg/L；诱导生根的培养基为④1/2MS+IBA3mg/L+PP3330.5mg/L；培养基①②③糖浓度为3%，培养基④糖浓度为2%；培养条件均为：所有培养基PH5.8，培养温度26±2℃，光照时间12h.d-1，光照强度20-40μmol.m-2.S-1。
所述的金银花种苗的快速繁殖和离体保存方法，所述栽苗基质选用新黄土与腐叶土各半，混合均匀，再用1份甲醛+水20份制成消毒液，将混合均匀的栽苗基质浇匀，以栽苗基质手摄成团,手散开团也散开为准，用塑料布密封24小时后打开，将栽苗基质装入移苗袋中待用。
所述的金银花种苗的快速繁殖和离体保存方法，所述移栽是将取出培养瓶内试管苗，用流水冲掉试管苗根部所粘琼脂，不伤及叶片和根尖，移入装满基质的塑料袋中，浇足定根水放在没有阳光直射的地面。
所述的金银花种苗的快速繁殖和离体保存方法，所述试管苗的假植与移栽是在移栽过渡前，挑出生根培养20d,高度4.5-5.5cm，根长度0.5cm以下的试管苗，先放在棚上复盖石棉瓦、四周围70%遮荫网、棚内分两台的简易荫棚内，放置培养瓶以便加强光照，10d后移入栽苗基质中。
所述的金银花种苗的快速繁殖和离体保存方法，所述离体保存是用试管生根苗在4℃下暗培养，在培养过程中，使金银花培养物原培养条件下每20d-30d继代一次，可延长继代周期至1年。
与现有技术相比，本发明的方法不仅降低了工作量，还避免了连续继代引起遗传性改变的可能，也为离体种质库增加了容量，还为金银花的优良基因的保存和可持续利用提供了保证。增殖速度达1:4-6，移栽成活率达90%以上，用多效唑（PP333）与吲哚丁酸（IBA）配合使用得到了99%的生根效果，得到的芽生成的试管苗遗传性稳定，用此方法建立的金银花无菌无性系在培养过程几乎无污染发生，且外植体在培养基上能很快恢复生长。
具体实施方式：
下面用本发明具体实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1：
一、无菌无性系的建立
材料学名：金银花Lonicera japonica Thnnb.
外植体材料的灭菌是组培中的重要环节，因金银花茎中空，外面被疏柔毛和疏腺毛，在组培初始灭菌较困难。既要求彻底杀死外材表面的微生物，又要尽可能少伤害外材组织和表面细胞，通过对杀菌程序的研究达到了理想效果，具体做法如下：
1、野外或大田筛选出高产的质优的金银花Lonicera japonica Thnnb.活植株(株型紧凑，每个叶腋开花蕾数达30朵左右的植株)，移入盆内放在室内养护，先封顶（去掉顶部茎尖）有利腋芽的长出，10d浇水1次，水为1/4MS（MS大量元素减少为1/4，其余成分相同但去掉有机成分）+BA0.25mg/L组成，约10d腋芽现出，并生长为新的幼茎，当幼茎长约4cm时，取下待用。
2、将野外采取的金银花Lonicera japonica Thnnb.优株(株型紧凑，每个叶腋开花蕾数达30朵左右的植株)当年生茎段，长约30cm***装水的棕色瓶内，培养1-2d换水1次，水为自来水，约10d腋芽生长为新的幼茎，当幼茎带有2-3个节时，切下待用。
上述两种方式取下的芽条（或幼茎）先用70%乙醇消毒20s，排出外材毛与毛之间空气，便于消毒水液能进入达到材料灭菌彻底的目的。再用0.1%升汞水溶液灭6min,用无菌水冲洗干净，即可接入事先准备好的培养基中。用此方法建立的金银花无菌无性系在培养过程几乎无污染发生，且外植体在培养基上很快恢复生长。
本发明的其中一个具体选择的材料来源于湖南培育的“艮翠蕾”良种，引种到重庆后，又筛选培育出的“渝翠蕾1号”，从渝翠蕾1号种植田内，用肉眼选出株型紧凑，每个叶腋开花蕾数达30朵左右的植株作材料。
二、培养条件：基本培养基为1/2MS（MS大量元素减半，其余成分与MS同），诱导茎段长出腋芽的培养基为：①1/2MS+BA0.5mg/L(单位以下同)+NAA0.2；诱导幼茎段丛芽增殖的培养基为：②1/2MS+BA0.5+IBA0.01和③1/4MS+BA0.3；诱导生根的培养基为：④1/2MS+IBA3+PP3330.5；培养基①②③糖浓度为3%，培养基④糖浓度为2%。培养条件均为：培养基PH为5.8，培养温度26±2℃，光照时间12h.d-1，光照强度20-40μmol.m-2.S-1。
三、快速繁殖
幼茎经消毒后，去掉叶片，修剪成长约1cm带1节的切段，放在培养基①上培养，约经25d培养后，每个茎段节处长出腋芽1-2个，诱导率为100%，每块材料的芽的平均数为1.7个。取下茎段上所发出的芽在培养基②上培养60d（继代周期为30d），便建成了金银花快速繁殖无性系，增殖速率可达1:3，再在培养基②上经过30d的培养，增殖速度可达1:4-6。达到金银花工厂化生产的要求。丛芽再生方式有两种：一种是茎段叶腋长出，切下后采取无菌扦插的方式，可连续增殖下去；另一种方式为在茎段基部切口处形成丛生芽，产生位置仍在叶腋处，因为此处接触培养基营养供给充足，芽发生和生长很快，所以是丛生芽的形式出现，在这种培养基上培养的材料，无愈伤组织产生，说明这种无性快繁方式得到的芽生成的试管苗遗传性是稳定的。
当金银花的增殖丛芽瓶数达到所需数量后，（这要根据市场需年产苗数和每月计划生产的苗数来决定。），控制存架母瓶数很关键，因为存架增殖瓶数过多在一定继代周期内因人力或设备不足，造成增殖并不能按时完成，积压瓶苗品质下降，丢弃会造成浪费。若存架增殖瓶数量少了，造成生产任务完不成，会带来经济上的损失和信誉降低。因此要严格控制存架增殖总瓶数。另外要考虑在种苗培养过程中会发生增殖苗长势不好，芽条枯死，叶片黄化和污染等现象，在制定生产计划时要比实际需求的苗数增加10%或20%的存架增殖瓶数。
四、生根培养
在培养基③上培养，3-4丛/瓶芽接种30d后，每瓶可得到高度达3-4cm以上芽条5个左右，同时也有增殖，月增殖速度为1:4。选取芽条高度在3cm以上的，截取下来放在培养基④上培养，14d-17d便开始生根，随着培养时间延长，达99%生根率，每株2-5条根，根粗约0.2cm，植株生长健壮。
目前现有技术报道生根试验中，一方面生根率不高费时长，另一方面在培养基中使用了NAA，在诱导根出现的同时，产生大量的愈伤组织，这种试管苗产生的根不是由中柱鞘产生的内起源的根，不定根与植株之间不存在紧密的连系，移栽后是不可能成活的。本发明创造性的用多效唑（PP333）与吲哚丁酸（IBA）配合使用得到了理想的生根效果。
五、试管苗的假植与移栽
经过生根培养的金银花试管苗，所处的环境优越，如营养供应充足，温度湿度合适，移出培养瓶要行自养生长，加上环境中温度湿度的变化，很难适应，造成试管苗移栽成活率不高。为解决这个问题，本发明在移栽过渡前，挑出生根培养20d试管瓶苗（试管苗高度5cm左右，根长度0.5cm以下），放在阳台上所建的简易荫棚内。棚高1米，长度依需要来定，上复盖石棉瓦，棚的四周围70%遮荫网，棚内分两台，放置培养瓶以便加强光照，约10d便可移入栽苗基质中。栽苗基质选用新黄土与腐叶土各半，混合均匀，再用1份甲醛+水20份制成消毒液，将混合均匀的栽苗基质浇匀，以栽苗基质手摄成团手散开团也散开为准，用塑料布密封24小时后打开，将栽苗基质装入移苗袋中待用。将加强光照后的瓶苗打开瓶盖小心取出培养瓶内试管苗。不要伤及叶片和根尖，用流水冲掉试管苗根部所粘的琼脂，移入装满基质的塑料袋中，浇足定根水放在没有阳光直射的地面。在刚移苗1-2周内可用塑料布盖在移出苗的上面，保湿，以后逐步打开，待苗长出新根或新叶后去掉塑料布并粗放管理培育约30d移入大田，成活率90%以上。
六、离体保存
首先对离体保存中培养物类型进行选择，本发明在室温下，对金银花丛生芽和试管苗进行了继代周期的比较（以培养物叶片黄化，芽条的枯死超过20%为标准，确定继代与否，结果显示：丛生芽继代周期为30d，而试管生根苗继代周期为4个月。本发明以试管生根苗的培养物类型进行离体保存。主要采取缓慢生长保存（Slow growth conservation）的中短期离体保存的方式，在试验了生长抑制剂CCC1mg/L(单位下同)、5、10；PP3330.5、1、5和ABA0.5后，没得到理想的结果（试管苗生长被抑制的同时出现了愈伤组织，叶片黄化和芽条枯死等现象）。本发明又采用降低培养温度的方法（暗培养4℃）进行离体保存。可延长继代周期至1年。在培养过程中，原培养条件下金银花培养物20d-30d必须继代。
综上，本发明的方法不仅降低了工作量，还避免了连续继代引起遗传性改变的可能，也为离体种质库增加了容量，还为金银花的优良基因的保存和可持续利用提供了保证。增殖速度达1:4-6，移栽成活率达90%以上，用多效唑（PP333）与吲哚丁酸（IBA）配合使用得到了99%的生根效果，得到的芽生成的试管苗遗传性稳定，用此方法建立的金银花无菌无性系在培养过程几乎无污染发生，且外植体材料在培养基上很快恢复生长。
Claims (1)
1.金银花种苗的快速繁殖和离体保存方法，包括无菌无性系的建立，快速繁殖，生根培养，试管苗的假植与移栽，离体保存步骤，所述无菌无性系的建立是取金银花芽条或幼茎，先用70％乙醇消毒20s，再用0.1％升汞水溶液灭菌6min,用无菌水冲洗干净，接入培养基中进行快速繁殖，即将幼茎消毒后，去掉叶片，切段，放在培养基①上培养25d，取下茎段上所发出的芽在培养基②上培养60d，继代周期为30d继代1次，再在培养基③上经过30d的培养；所述生根培养是在培养基③上培养，3-4丛芽/瓶接种30d后，选取芽条高度在3cm以上的，截取下来放在培养基④上培养14d-17d开始生根；所述试管苗的假植与移栽是在移栽过渡前，挑出生根培养20d的试管瓶苗，先放在简易荫棚内，10d后移入栽苗基质中，在刚移苗1-2周内,用塑料布盖在移出苗的上面保湿，待苗长出新根或新叶后去掉塑料布，培育30d后移入大田，所述离体保存是用试管生根苗的培养物类型进行离体保存；
所述培养基采用：基本培养基为1/2MS(MS大量元素减半，其余成分与MS同)，诱导茎段长出腋芽的培养基为①1/2MS+BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L；诱导幼茎段丛芽增殖的培养基为②1/2MS+BA0.5mg/L+IBA0.01mg/L和③1/4MS+BA0.3mg/L；诱导生根的培养基为④1/2MS+IBA3mg/L+PP3330.5mg/L；培养基①②③糖浓度为3％，培养基④糖浓度为2％；培养条件均为：所有培养基PH 5.8，培养温度26±2℃，光照时间12h.d-1，光照强度20-40μmol.m-2.S-1；
所述栽苗基质选用新黄土与腐叶土各半，混合均匀，再用1份甲醛+水20份制成消毒液，将混合均匀的栽苗基质浇匀，以栽苗基质手摄成团,手散开团也散开为准，用塑料布密封24小时后打开，将栽苗基质装入移苗袋中待用；
所述移栽是将培养瓶内取出的试管苗，用流水冲掉试管苗根部所粘琼脂，不伤及叶片和根尖，移入装满基质的移苗袋中，浇定根水放在没有阳光直射的地面；
所述试管苗的假植与移栽是在移栽过渡前，挑出生根培养20d,高度4.5-5.5cm，根长度0.5cm以下的试管苗，先放在棚上复盖石棉瓦、四周围70％遮荫网、棚内分两台的简易荫棚内，放置培养瓶以便加强光照，10d后移入栽苗基质中；
所述离体保存是用试管生根苗在4℃下暗培养，在培养过程中，使金银花培养物原培养条件下每20d-30d继代一次，可延长继代周期至1年；所述金银花培养物是指试管生根苗；所述原培养条件是指生根培养条件。
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