CN108812310A - 一种高效诱导华重楼种苗繁殖的方法 - Google Patents

一种高效诱导华重楼种苗繁殖的方法 Download PDF

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郭文杰
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Abstract

本发明公开了一种高效诱导华重楼种苗繁殖的方法，该方法将已分化出胚根的华重楼种子作为外植体，经过愈伤组织诱导和增殖培养，达到较高的繁殖率后，再经过分化培养和块茎膨大及生根培养，移栽，可以大量繁殖华重楼种苗并缩短华重楼药材生长期。本发明解决了现有技术中存在的华重楼种苗繁殖率低，生长缓慢，不能满足现有市场对华重楼种苗需求的问题。采用本发明方法，2年繁殖率可达60000倍以上，比常规种子繁殖快很多。本发明不仅繁殖率高，还缩短了华重楼药材的田间生长期，并且组培块茎的定植成活率高，适用于华重楼的规模化生产。

Description

一种高效诱导华重楼种苗繁殖的方法
技术领域
本发明属于植物繁育技术领域，具体涉及一种高效诱导华重楼种苗繁殖的方法。
背景技术
华重楼又名七叶一枝花，是珍贵中药材。华重楼种子因具有自然繁殖率低，种胚发育不完全，胚乳坚硬和胚轴后熟等具有明显“双重休眠”的特性，因此其种子播种后通常需要经历两个冬天才能萌发，其成苗生长时间长。而常规根茎切段育苗，由于土壤温度和湿度无法控制，切口愈合不理想，易感染病菌类而导致整块根茎溃烂，种质材料损失高；此外潜伏芽萌发时间长，萌发率低，多芽同时萌发较少，从而导致总的繁殖系数降低，繁殖生产出的种苗质量差。
利用组织培养的方法进行快速繁殖，具有繁殖系数大、去病毒、迅速更新品种等优点，在百合上已有许多成功的报道。而华重楼的组培尚未见***研究及应用。
目前华重楼的组织培养主要集中在种子的无菌萌发、愈伤组织诱导和培养方面，关于华重楼组培苗增殖及生根方面的研究，以及试管根茎增殖及膨大方面的研究较少。
中国专利CN201310529238.9公开了一种华重楼植株的快速繁殖方法，该专利采用的是华重楼的根茎作外植体，存在以下缺点：由于根茎长在土壤中，导致初代培养污染十分严重，此外由于根茎本身是药材，且一般只有前部一、两个芽体能诱导出愈伤组织，因此该方法会浪费大量的原材料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种繁殖速度快、数量多的高效诱导华重楼种苗繁殖的方法，以满足市场需求。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种高效诱导华重楼种苗繁殖的方法，包括无菌外植体的获取，经过下列步骤进行培养：
1）消毒处理：选择已分化出胚根的华重楼种子，先用流水冲洗干净，再用洗衣粉浸泡，用刷子轻刷，然后用自来水冲洗干净，然后将胚根切除干净，剩下的部分作为外植体，在超净工作台上将外植体先用酒精浸泡，再用升汞消毒，最后用无菌水冲洗3～4次；
2）诱导培养：将消毒处理后的外植体接种在诱导培养基上，在温度20±2 ℃、黑暗条件下培养50-60 d获得愈伤组织；
所述诱导培养基为MS 培养基，诱导培养基中各成分及其浓度如下：
6- BA 2.0-3.0 mg·L-1
NAA 0.3-0.5 mg·L-1
2，4-D 0.1-0.3 mg·L-1
蔗糖 28000-30000 mg·L-1
琼脂 7200-7500 mg·L-1
3）增殖培养：在无菌条件下，将步骤2）获得的愈伤组织分切成1-3 cm3大小后转入增殖培养基中，在温度24±2℃，黑暗条件下培养30-50 d，愈伤组织大量增殖；
所述增殖培养基为MS 培养基，增殖培养基中各成分及其浓度如下：
6- BA 1.0-2.0 mg·L-1
NAA 0.2 mg·L-1
2，4-D 0.1 mg·L-1
蔗糖 28000-30000 mg·L-1
琼脂 7200-7500 mg·L-1
4）分化培养：将步骤3）获得的愈伤组织分切成1-3 cm3大小后转入分化培养基中，在温度24±2℃，黑暗条件下培养50-70 d，愈伤组织即可分化出突起（即小块茎）；
所述分化培养基为MS 培养基，分化培养基中各成分及其浓度如下：
6- BA 1.0 mg·L-1
NAA 0.2 mg·L-1
蔗糖 28000-30000 mg·L-1
琼脂 7200-7500 mg·L-1
5）膨大和生根培养：将步骤4）获得的小块茎分切成单个后转入膨大和生根培养基中，在温度24±2 ℃，黑暗条件下培养70-90 d，小块茎迅速膨大及生根；
所述膨大和生根培养基为MS 培养基，膨大和生根培养基中各成分及其浓度如下：
6- BA 1.0 mg·L-1
NAA 0.1 mg·L-1
IAA 0.1 mg·L-1
蔗糖 58000-60000 mg·L-1
琼脂 7200-7500 mg·L-1
6）移栽：当步骤5）培养的块茎的根长为0.5-2.0 cm时，取出块茎，洗去根部的培养基后移栽到基质中生长，成活率可达93%以上。
步骤1）中，所述浸泡用的酒精浓度为70-75%，浸泡时间为25-35 s。
步骤1）中，所述消毒用的升汞浓度为0.1-0.15%，消毒时间为8-10 min。
步骤2）-步骤5）中，培养基的pH均为5.6-6.0，优选为5.8。
步骤6）中，所述基质是由草炭和珍珠岩组成的混合基质。
进一步，所述混合基质中基草炭和珍珠岩的体积比为1:1。
本发明采用以上技术方案，将已分化出胚根的华重楼种子作为外植体，经过诱导愈伤组织和增殖培养，达到较高的繁殖率后，再经过分化培养和块茎膨大及生根培养，移栽形成植株，在短期内可实现华重楼的快速繁殖，且缩短了田间生长期。
本发明具有以下优点：（1）采用已分化出胚根的华重楼种子作为外植体，种子数量多，消毒简单，初代培养污染少。（2）繁殖系数高，2年繁殖率可达60000倍以上，比常规种子繁殖快很多。（3）采用本发明方法生产的块茎整齐一致，可统一种植，管理方便。（4）由于采用试管块茎移栽，不带茎叶，洗苗快且方便，运输方便，且抗逆境能力强，种植成活率高，适用于华重楼的规模化生产。
具体实施方式：
为了更好地说明本发明的实质内容，下面给出本发明的实施例，但本发明的内容并不仅限于这些。
实施例1
一种高效诱导华重楼种苗繁殖的方法，包括无菌外植体的获取：经过下列步骤进行培养：
1）消毒处理：选择已分化出胚根的华重楼种子，先用流水冲洗干净，用洗衣粉浸泡，用刷子轻刷，然后用自来水冲洗干净，然后将胚根切除干净，剩下的部分作为外植体，在超净工作台上将外植体用75%的酒精浸泡30 s，再用0.1%的升汞消毒10 min，最后用无菌水冲洗4次；
2）诱导培养：将消毒处理后的外植体接种在诱导培养基上，在温度20 ℃、黑暗条件下培养55d获得愈伤组织；
所述诱导培养基为pH=5.8的MS 培养基，诱导培养基中各成分及其浓度如下：
6- BA 2.5mg·L-1
NAA 0.4 mg·L-1
2，4-D 0.2 mg·L-1
蔗糖 30000 mg·L-1
琼脂 7500 mg·L-1
3）增殖培养：在无菌条件下，将步骤2）获得的愈伤组织分切成2cm3大小后转入增殖培养基中，在温度24℃，黑暗条件下培养40 d，愈伤组织大量增殖；
所述增值培养基为pH=5.8的MS 培养基，增值培养基中各成分及其浓度如下：
6- BA 1.5 mg·L-1
NAA 0.2 mg·L-1
2，4-D 0.1 mg·L-1
蔗糖 30000 mg·L-1
琼脂 7500 mg·L-1
4）分化培养：将步骤3）获得的愈伤组织分切成2 cm3大小后转入分化培养基中，在温度24 ℃，黑暗条件下培养60 d，愈伤组织即可分化出突起（即小块茎）；
所述分化培养基为pH=5.8的MS 培养基，分化培养基中各成分及其浓度如下：
6- BA 1.0 mg·L-1
NAA 0.2 mg·L-1
蔗糖 30000 mg·L-1
琼脂 7500 mg·L-1
5）膨大和生根培养：将步骤4）获得的小块茎分切成单个后转入膨大和生根培养基中，在温度24 ℃，黑暗条件下培养80 d，小块茎迅速膨大及生根；
所述膨大和生根培养基为pH=5.8的MS 培养基，膨大和生根培养基础中各成分及其浓度如下：
6- BA 1.0 mg·L-1
NAA 0.1 mg·L-1
IAA 0.1 mg·L-1
蔗糖 60000 mg·L-1
琼脂 7500 mg·L-1
6）移栽：当步骤5）培养的块茎的根长为1.5 cm时，取出块茎，洗去根部的培养基后移栽到草炭和珍珠岩体积比为1:1的混合基质中生长。
实施例2
一种高效诱导华重楼种苗繁殖的方法，包括无菌外植体的获取：经过下列步骤进行培养：
1）消毒处理：选择已分化出胚根的华重楼种子，先用流水冲洗干净，用洗衣粉浸泡，用刷子轻刷，然后用自来水冲洗干净，然后将胚根切除干净，剩下的部分作为外植体，在超净工作台上将外植体用70%的酒精浸泡35 s，再用0.15%的升汞消毒8 min，最后用无菌水冲洗3次；
2）诱导培养：将消毒处理后的外植体接种在诱导培养基上，在温度18 ℃、黑暗条件下培养60 d获得愈伤组织；
所述诱导培养基为pH=5.6的MS 培养基，诱导培养基中各成分及其浓度如下：
6- BA 2.0 mg·L-1
NAA 0.3 mg·L-1
2，4-D 0.1 mg·L-1
蔗糖 28000 mg·L-1
琼脂 7200 mg·L-1
3）增殖培养：在无菌条件下，将步骤2）获得的愈伤组织分切成1cm3大小后转入增殖培养基中，在温度22℃，黑暗条件下培养50 d，愈伤组织大量增殖；
所述增殖培养基为pH=5.6的MS 培养基，增殖培养基中各成分及其浓度如下：
6- BA 1.0 mg·L-1
NAA 0.2 mg·L-1
2，4-D 0.1 mg·L-1
蔗糖 28000 mg·L-1
琼脂 7200 mg·L-1
4）分化培养：将步骤3）获得的愈伤组织分切成1cm3大小后转入分化培养基中，在温度22℃，黑暗条件下培养70 d，愈伤组织即可分化出突起（即小块茎）；
所述分化培养基为pH=5.6的MS 培养基，分化培养基中各成分及其浓度如下：
6- BA 1.0 mg·L-1
NAA 0.2 mg·L-1
蔗糖 28000 mg·L-1
琼脂 7200 mg·L-1
5）膨大和生根培养：将步骤4）获得的小块茎分切成单个后转入膨大和生根培养基中，在温度22 ℃，黑暗条件下培养90 d，小块茎迅速膨大及生根；
所述膨大和生根培养基为pH=5.8的MS 培养基，膨大和生根培养基础中各成分及其浓度如下：
6- BA 1.0 mg·L-1
NAA 0.1 mg·L-1
IAA 0.1 mg·L-1
蔗糖 58000 mg·L-1
琼脂 7200 mg·L-1
6）移栽：当步骤5）培养的块茎的根长为0.5cm时，取出块茎，洗去根部的培养基后移栽到草炭和珍珠岩体积比为1:1的混合基质中生长。
实施例3
一种高效诱导华重楼种苗繁殖的方法，包括无菌外植体的获取：经过下列步骤进行培养：
1）消毒处理：选择已分化出胚根的华重楼种子，先用流水冲洗干净，用洗衣粉浸泡，用刷子轻刷，然后用自来水冲洗干净，然后将胚根切除干净，剩下的部分作为外植体，在超净工作台上将外植体用75%的酒精浸泡25s，再用0.1%的升汞消毒10 min，最后用无菌水冲洗4次；
2）诱导培养：将消毒处理后的外植体接种在诱导培养基上，在温度22 ℃、黑暗条件下培养50d获得愈伤组织；
所述诱导培养基为pH=6.0的MS 培养基，诱导培养基中各成分及其浓度如下：
6- BA 3.0 mg·L-1
NAA 0.5 mg·L-1
2，4-D 0.3 mg·L-1
蔗糖 30000 mg·L-1
琼脂 7500 mg·L-1
3）增殖培养：在无菌条件下，将步骤2）获得的愈伤组织分切成3cm3大小后转入增殖培养基中，在温度26℃，黑暗条件下培养30 d，愈伤组织大量增殖；
所述增值培养基为pH=6.0的MS 培养基，增值培养基中各成分及其浓度如下：
6- BA 2.0 mg·L-1
NAA 0.2 mg·L-1
2，4-D 0.1 mg·L-1
蔗糖 30000 mg·L-1
琼脂 7500 mg·L-1
4）分化培养：将步骤3）获得的愈伤组织分切成3cm3大小后转入分化培养基中，在温度26℃，黑暗条件下培养50 d，愈伤组织即可分化出突起（即小块茎）；
所述分化培养基为pH=6.0的MS 培养基，分化培养基中各成分及其浓度如下：
6- BA 1.0 mg·L-1
NAA 0.2 mg·L-1
蔗糖 30000 mg·L-1
琼脂 7500 mg·L-1
5）膨大和生根培养：将步骤4）获得的小块茎分切成单个后转入膨大和生根培养基中，在温度26 ℃，黑暗条件下培养70 d，小块茎迅速膨大及生根；
所述膨大和生根培养基为pH=6.0的MS 培养基，膨大和生根培养基础中各成分及其浓度如下：
6- BA 1.0 mg·L-1
NAA 0.1 mg·L-1
IAA 0.1 mg·L-1
蔗糖 60000 mg·L-1
琼脂 7500 mg·L-1
6）移栽：当步骤5）培养的块茎的根长为2.0 cm时，取出块茎，洗去根部的培养基后移栽到草炭和珍珠岩体积比为1:1的混合基质中生长。

Claims (7)

1.一种高效诱导华重楼种苗繁殖的方法，包括无菌外植体的获取，其特征在于：经过下列步骤进行培养：
1）消毒处理：选择已分化出胚根的华重楼种子，洗净后将胚根切除干净，剩下的部分作为外植体，在超净工作台上将外植体先用酒精浸泡，再用升汞消毒，最后用无菌水冲洗3～4次；
2）诱导培养：将消毒处理后的外植体接种在诱导培养基上，在温度20±2 ℃、黑暗条件下培养50-60 d获得愈伤组织；
所述诱导培养基为MS 培养基，诱导培养基中各成分及其浓度如下：
6- BA 2.0-3.0 mg·L-1
NAA 0.3-0.5 mg·L-1
2，4-D 0.1-0.3 mg·L-1
蔗糖 28000-30000 mg·L-1
琼脂 7200-7500 mg·L-1
3）增殖培养：在无菌条件下，将步骤2）获得的愈伤组织分切成1-3 cm3大小后转入增殖培养基中，在温度24±2℃，黑暗条件下培养30-50 d，愈伤组织大量增殖；
所述增殖培养基为MS 培养基，增殖培养基中各成分及其浓度如下：
6- BA 1.0-2.0 mg·L-1
NAA 0.2 mg·L-1
2，4-D 0.1 mg·L-1
蔗糖 28000-30000 mg·L-1
琼脂 7200-7500 mg·L-1
4）分化培养：将步骤3）获得的愈伤组织分切成1-3 cm3大小后转入分化培养基中，在温度24±2℃，黑暗条件下培养50-70 d，愈伤组织即可分化出小块茎；
所述分化培养基为MS 培养基，分化培养基中各成分及其浓度如下：
6- BA 1.0 mg·L-1
NAA 0.2 mg·L-1
蔗糖 28000-30000 mg·L-1
琼脂 7200-7500 mg·L-1
5）膨大和生根培养：将步骤4）获得的小块茎分切成单个后转入膨大和生根培养基中，在温度24±2 ℃，黑暗条件下培养70-90 d，小块茎迅速膨大及生根；
所述膨大和生根培养基为MS 培养基，膨大和生根培养基中各成分及其浓度如下：
6- BA 1.0 mg·L-1
NAA 0.1 mg·L-1
IAA 0.1 mg·L-1
蔗糖 58000-60000 mg·L-1
琼脂 7200-7500 mg·L-1
6）移栽：当步骤5）培养的块茎的根长为0.5-2.0 cm时，取出块茎，洗去根部的培养基后移栽到基质中生长。
2.根据权利要求1所述的一种高效诱导华重楼种苗繁殖的方法，其特征在于：步骤1）中，所述浸泡用的酒精浓度为70-75%，浸泡时间为25-35 s。
3.根据权利要求1所述的一种高效诱导华重楼种苗繁殖的方法，其特征在于：步骤1）中，所述消毒用的升汞浓度为0.1-0.15%，消毒时间为8-10 min。
4.根据权利要求1所述的一种高效诱导华重楼种苗繁殖的方法，其特征在于：步骤2）-步骤5）中，培养基的pH均为5.6-6.0。
5.根据权利要求4所述的一种高效诱导华重楼种苗繁殖的方法，其特征在于：步骤2）-步骤5）中，培养基的pH均为5.8。
6.根据权利要求1所述的一种高效诱导华重楼种苗繁殖的方法，其特征在于：步骤6）中，所述基质是由草炭和珍珠岩组成的混合基质。
7.根据权利要求6所述的一种高效诱导华重楼种苗繁殖的方法，其特征在于：步骤6）中，所述混合基质中基草炭和珍珠岩的体积比为1:1。
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