JP6755391B2 - 胃癌の生物学的特性に基づく群区分および予後予測システム - Google Patents

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Description

本発明は、胃癌の生物学的特性に基づく群区分および予後予測システムに関する。
全世界的に、胃癌は、癌による死亡率のうち三番目に高い癌であり、特に韓国内では予後が比較的良いと知らている甲状腺癌を除いて最もありふれた癌である。韓国内では、国家次元の健康診断を通じた早期発見と手術の標準化および抗癌治療剤の発見などで胃癌患者の生存率が大きく向上したが、現在標準化された治療にもかかわらず、依然として２期、３期進行性胃癌の場合、約半分程度の患者が再発を経験する。
癌は、遺伝体疾患と認識されており、ＮＧＳ（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）等の遺伝体検査技術の発展に伴い、癌を既存の解剖学的、病理学的表現型による分類でなく、分子的生物学的特性によって分類しようとする努力があった。ＴＣＧＡ（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）プロジェクトにおいて胃癌がその多様な分子的特徴によって大きく４種類の形態に分けられることが、最近報告されたことがある。これは、解剖学的に同じ病期であるとしても、分子的生物学的特徴によって予後と抗癌剤に対する反応程度が異なり得ることを意味する。
最近に発表された２９５人の胃癌患者のＴＣＧＡプロジェクト結果を見れば、胃癌は、（１）ＥＢＶ陽性胃癌（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ、ＥＢＶ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）（２）マイクロサテライト不安定型（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ−ｈｉｇｈ、ＭＳＩ−Ｈ）、（３）染色体不安定型（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ、ＣＩＮ）（４）遺伝体安定型胃癌（Ｇｅｎｏｍｉｃａｌｌｙ ｓｔａｂｌｅ、ＧＳ）の４種類に区分される。このような膨大な癌ゲノムシーケンシング（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を通じて胃癌も一つの単一の癌腫でなく、分子遺伝学的に区別される異質な小グループに分けられるという点が分かる。したがって、胃癌の個人に合ったオーダーメード治療を実現するためには、分子遺伝学的特徴および病理学的特徴に基づくサブタイプを区別してそれぞれのターゲット遺伝子を発掘、適用が必要であることを示唆する。また、胃癌の研究の側面において、胃癌の亜型区分によって予後が区分され得る結果が報告されている。
胃癌手術による抗癌剤ｋ治療後、患者の予後を予測できるとすれば、各予後に応じてこれに合った治療戦略を樹立できる根拠資料になる。現在の標準化された治療慣行上、２、３期の進行性胃癌では、手術後に補助抗癌療法をすべての患者に使用されている。これは、予後が悪い群に対しては、過小治療（ｕｎｄｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ）でありうる。すなわち、予後が良くない患者群に対して現在の標準治療以外に他の追加的な治療方法に対する戦略を開発できる臨床学的な意味を有しているといえる。
２０１０年以後、現在２期、３期の進行性胃癌の場合、標準化されたＤ２胃切除手術以後、補助抗癌療法が胃癌患者の生存率を高めることを発見し、現在、これは、標準治療法に該当する。伝統的に、胃癌は、その解剖学的病理学的表現型によって分類し、ＴＮＭ病期分類法によって２期以上の場合、抗癌治療をしているが、抗癌治療による予後を予測できる方法がＴＮＭ病期以外にはない状況である。
本発明の目的は、進行性胃癌（２期−３期：ＡＪＣＣ６版基準）患者の手術後、予後を予測できる標的遺伝子群のｍＲＮＡ発現水準の定量値を基盤とする進行性胃癌の予後予測用組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、進行性胃癌患者の手術後、予後を予測できる標的遺伝子群のｍＲＮＡ発現水準の定量値を基盤として患者の生存率の側面で予後を予測するための情報を提供する方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、進行性胃癌患者の手術後、予後を予測できる標的遺伝子群のｍＲＮＡ発現水準の定量値を基盤として患者の生存率の側面で予後を予測する方法を提供することにある。
前記目的を達成するために、本発明は、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、ＶＳＩＧ１、ＣＮＮ１、ＮＥＸＮ、ＳＣＲＧ１、ＳＯＲＢＳ１、ＳＰＡＲＣＬ１、ＡＵＲＫＡ、ＢＵＢ１、ＣＤＣ２０、ＣＥＰ５５、ＰＴＴＧ１、ＵＢＥ２Ｃ、ＣＤ８Ａ、ＧＢＰ１、ＧＢＰ５、ＧＺＭＢ、ＮＫＧ７、ＷＡＲＳ、ＡＮＴＸＲ１、ＳＦＲＰ４、ＶＣＡＮ、ＣＤＨ１７、ＣＤＸ１およびＭＹＯ１Ａを含む標的遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定する製剤；およびＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定する製剤を含む胃癌２期および３期の進行性胃癌の予後予測用組成物を提供する。
また、本発明は、前記胃癌２期および３期の予後予測用組成物を含む胃癌２期および３期の進行性胃癌の予後予測用キットを提供する。
また、本発明は、統計的有意値を示すことができる程度のサンプル数を有する胃癌２期および３期の進行性胃癌患者から得た基準サンプルと生物学的サンプルで、
ＴＦＦ１、ＴＦＦ２およびＶＳＩＧ１からなる胃（ｇａｓｔｒｉｃ）シグネチャー；ＣＮＮ１、ＮＥＸＮ、ＳＣＲＧ１、ＳＯＲＢＳ１およびＳＰＡＲＣＬ１からなる間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）シグネチャー；ＡＵＲＫＡ、ＢＵＢ１、ＣＤＣ２０、ＣＥＰ５５、ＰＴＴＧ１およびＵＢＥ２Ｃからなる増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）シグネチャー；ＣＤ８Ａ、ＧＢＰ１、ＧＢＰ５、ＧＺＭＢ、ＮＫＧ７およびＷＡＲＳからなる免疫（ｉｍｍｕｎｅ）シグネチャー；ＡＮＴＸＲ１、ＳＦＲＰ４およびＶＣＡＮからなる幹細胞様（ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ）シグネチャー；およびＣＤＨ１７、ＣＤＸ１およびＭＹＯ１Ａからなる腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）シグネチャーを含む標的遺伝子群と、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子群のｍＲＮＡ発現水準を測定する段階；
下記の式１により基準サンプルと生物学的サンプルの標的遺伝子群のΔＣｑ値を計算して、コンピュータプログラムに入力する段階；および
前記コンピュータプログラムに入力した値に対してＮＭＦ（Ｎｏｎ−ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍａｔｒｉｘ Ｆａｃｔｏｒｉｚａｔｉｏｎ）およびＮＭＦ基盤クラスタリングを行い、複数個のクラスターに分類し、各クラスターで標的遺伝子群のスコア
を下記の式２に適用してＳＶ（Ｓｃｏｒｅ Ｖａｌｕｅ）を計算し、ＳＶによって腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）分子亜型、炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型、間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型、混合型間質（Ｍｉｘｅｄ−ｓｔｒｏｍａｌ）分子亜型および胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型に分類し、全体生存率（Ｏｖｅｒａｌｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ）の側面で予後を分析して、生物学的サンプルが属する分子亜型の予後を予測する段階を含み、
前記胃癌の分子亜型は、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）シグネチャーのＳＶが最大値を有するクラスターを胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型に定め；胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型に決定されたクラスターを除いたクラスターのうち間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）シグネチャーのＳＶが最大値を有し、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）シグネチャーのＳＶが最小値を有するクラスターを間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型に定め；胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型および間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型に決定されたクラスターを除いたクラスターのうち免疫（ｉｍｍｕｎｅ）シグネチャーのＳＶが最大値を有し、腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）シグネチャーのＳＶが最小値を有するクラスターを炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型に定め；胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型、間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型および炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型に決定されたクラスターを除いたクラスターのうち幹細胞様（ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ）シグネチャーのＳＶが最大値を有する場合、混合型間質（Ｍｉｘｅｄ−ｓｔｒｏｍａｌ）分子亜型に定め；最終的に残ったクラスターを腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）分子亜型に定めて分類し、
前記胃癌の分子亜型が炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型である場合、全体生存率の側面で良い予後群；腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）分子亜型および胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型である場合、中間予後群；混合型間質（Ｍｉｘｅｄ−ｓｔｒｏｍａｌ）分子亜型および間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型である場合、悪い予後群として予測する、胃癌２期および３期の予後予測のための情報を提供する方法、または、胃癌２期および３期の予後予測方法を提供する：
ここで、参考遺伝子群のＣｑ平均値は、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子群のＣｑ値の平均値を意味する。
ここで、ＳＶは、ＮＭＦ基盤クラスタリングに得たクラスターで各シグネチャーの発現平均値、ｔは、当該シグネチャーに属する遺伝子（ｉ）の数、
は、シグネチャー（θ＝６）、ｋは、クラスターの数であって、２〜７の整数であり、
は、各遺伝子の全体平均と各クラスター平均との間の距離をベースとするスコアであって、下記の式３により求める。
ここで、臨界値（Δ）は、０．１に定めて、分子亜型別の特異性がない遺伝子は、０に収斂させ、
は、
の符号を意味し、
は、下記の式４により求める。
ここで、各分子亜型（ｋ）内の当該遺伝子（ｉ）平均値
当該遺伝子（ｉ）の全体平均値
であり、
は、
の標準誤差を補正するための自由度
であり、
は、遺伝子（ｉ）の全体サンプルに対する当該分子亜型（ｋ）内の標準偏差であり、
は、
の中央値である。
本発明は、進行性胃癌の予後を予測できる標的遺伝子群のｍＲＮＡ発現水準の定量値を利用して全体生存率の側面で予後を予測できるアルゴリズムを開発して、胃癌患者の治療方法を決定するのに補助的情報として活用することができる。
図１は本発明の実験分析流れ図を示すものであり、段階Ｉは、一連の分析結果、胃癌（ＧＣ）分子亜型、分類器（ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）およびＧＣシグネチャーを確認する過程（ＮＭＦ、ｎｏｎ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍａｔｒｉｘ ｆａｃｔｏｒｉｚａｔｉｏｎ；ＳＡＭ、ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ；ＰＡＭ、ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ；ＧＳＥＡ、ｇｅｎｅ−ｓｅｔ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ；ＷＧＣＮＡ、ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｇｅｎｅ ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋ ａｎａｌｙｓｉｓ）であり、段階ＩＩは、患者サンプルでＧＣシグネチャーの発現をプロファイリングするための一連のプローブ、ｍｉｎｉＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ−２６の構築を通じて臨床効用を最大化するためのＧＣシグネチャーと分子亜型の同定過程である。 図２は、Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ−ＰＡＭ９３２でＮＭＦコンセンサスクラスタリングを行った結果を示すものであり、（ａ）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＳｉｇＤＢ）および以前の研究で分析された遺伝子セット（消化、痙攣抑制ポリペプチド−発現化生（ＳＰＥＭ）、 腸上皮化生（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｅｔａｐｌａｓｉａ（ＩＭ）、免疫系、基質、上皮間葉転換（ＥＭＴ）、および細胞周期）で特性糾明されたトレーニングセットＩのヒートマップ（ＧＳＥ１３８６１ｐ）を示す。ＧＳＴ、胃亜型；ＩＮＦ、炎症；ＭＳＣ、間葉；ＩＮＴ、臓器；ＭＸＤ、混合基質。独立テストセットＩとＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ−ＰＡＭ９３２を使用したＮＭＦコンセンサスクラスタリングの検証結果である。（ｂ）ＧＳＥ６２２５４（アジア癌研究グループ、ＡＣＲＧ）、（ｃ）ＴＣＧＡおよび（ｄ）ＧＳＥ１５４５９（シンガポール）のヒートマップを示す。以前の亜型情報は、各ヒートマップの上に共に提供される。 図３は、ＮＭＦクラスタリングを示すものであり、ＳＤ＝０．８、ＳＤ＝０．９、ＳＤ＝１．０での（ａ）クラスター番号（ｋ）２〜７および次の分散カットオフがあるコンセンサスマップ、（ｂ）コーフェン相関係数および（ｃ）シルエット幅を使用したサンプル指定を示す。 図４は、ＷＧＣＮＡ分析により発見された亜型を定義する胃癌シグネチャーを示すものであり、（ａ）は、ＧＳＥ１３８６１ｐの系統数であり、（ｂ）は、ＧＳＥ１３８６１ｐで探知されたモジュールおよびＧＳＥ６２２５４、ＴＣＧＡおよびＧＳＥ１５４５９の当該モジュールマップである。独立的なテストセットである各コホートのモジュールがＧＳＥ１３８６１ｐのモジュールと共通遺伝子を共有すれば、モジュールの色を視覚的便宜のために一対一で調整され、（ｃ）は、トレーニングセットで各亜型の上位２５％上位点数ＰＡＭｇｅｎｅｓマッピング結果である。（ｄ）は、ＧＣで一致するモジュールの組合せで表現される６個のＧＣシグネチャーを示す。（ｅ）は、５個のＧＣ亜型と６個のＧＣシグネチャーの関係性を分析するために、スピアマンの相関関係（Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）を使用して示すものである。赤色は、当該亜型と正の相関関係があるモジュールを示し、青色は、負の相関関係があるモジュールを示す。 図５は、段階ＩＩのトレーニングセットであるＭｅｒｇｅｄ１２５９（ＧＳＥ１３８６１ｐ、ＧＳＥ６２２５４（ＡＣＲＧ）、ＴＣＧＡ、およびＧＳＥ１５４５９（シンガポール））を使用して５個の亜型による全体生存率（ＯＳ）を示すものである（ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｒａｔｉｏ ｔｅｓｔ；ｐ＝３．４２ｅ−０９）。Ｍｅｒｇｅｄ１２５９コホートのサンプルのうち臨床情報がない６１個のサンプルを除いた１１９８個のサンプルに対する全体生存曲線である：各分子亜型別の５年生存率は、ＩＮＦの場合、７６．１％（９５％信頼区間６７．７−８５．７）、ＩＮＴの場合、６５．１％（９５％信頼区間５６．２−７５．４）、ＧＳＴの場合、６４．６％（９５％信頼区間５５．０−７５．９）、ＭＸＤの場合、５１．３％（９５％信頼区間４２．１−６２．４）、ＭＳＣの場合、４６．３％（９５％信頼区間３８．０−５６．５）である。 図６は、胃癌細胞株を利用して調査された胃癌基質シグネチャー（ｎ＝２６）を示すものであり、（ａ）は、癌細胞株データと併合されたトレーニングセットでＧＣ亜型を示すヒートマップである。（ｂ）は、基質モジュールｅｉｇｅｎｇｅｎｅと共に配列されたヒートマップである。Ｈｓ７４６、ＳＮＵ−４８４（ＭＳＣ）、ＭＫＮ−４５およびＮＣＩ−Ｎ８７（ＩＮＴ）細胞株は、矢先で表示される。 図７は、胃癌細胞株のＭＳＣおよびＩＮＴタイプは、（ａ）インビトロスクラッチ創傷治癒法、（ｂ）浸潤分析法、（ｃ）インビトロ腫瘍スフェロイド形成分析法（スケールバー、１００μｍ）、および（ｄ）生体内同所腫瘍形成（ｎ＝３）に比較される。Ｈｓ７４６ＴおよびＳＮＵ−４８４腫瘍の拡散成長およびＭＫＮ−４５およびＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍の閉じ込めは、ＭＲＩイメージ（軸方向の断面）で白色点線で境界付けられる。黒い点線からなるボックスの写真は、定位モデル構成を描写する。ＴＧＦ−β抑制剤（ＬＹ２１５７２９９（ＬＹ））で処理したＨｓ７４６Ｔ細胞の基質挙動の抑制は、試験管内スクラッチ創傷治癒法（ｅ）、浸潤法（ｆ）およびインビトロ腫瘍スフェロイド形成分析（ｇ）を通じて観察する。複合薬物治療（オキサリプラチンおよびフルオロウラシル）中にＴＧＦ−β抑制剤の同時投与下でマウス異種移植モデル（ｎ＝８）でＨｓ７４６ｔ腫瘍（ｈ）およびＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍（ｉ）の腫瘍成長を測定する生体内薬物抵抗分析結果である（Ｐ＜０．０５）。 図８は、ＧＣでｍｉｎｉＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ２６で区分された５個の分子亜型を示すものであり、（ａ）は、ＰＡＭで５個の分子亜型に対する２６個の代表遺伝子の相対的差異を示すものである。（ｂ）は、ＧＣのマイクロアレイデータに対するＮＭＦ基盤クラスタリング（２６個の遺伝子）のヒートマップ（ＣｏｍＢａｔ方法を利用して併合されたＮ＝１２５９；ＧＳＥ１３８６１ｐ、ＧＳＥ１５４５９、ＴＣＧＡおよびＧＳＥ６２２５４）である。（ｃ）は、ＧＣのｑＰＣＲデータに対するＮＭＦ基盤クラスタリング（２６個の遺伝子）のヒートマップである。（ｄ）と（ｅ）は、（ｂ）と（ｃ）でクラスタリングされた５個の分子亜型の全体生存率（ＯＳ）を示すものである。（ｄ）は、Ｍｅｒｇｅｄ１２５９コホートのサンプルのうち臨床情報がない６１個のサンプルを除いた１１９８個のサンプルに対する全体生存曲線である：各分子亜型別の５年生存率は、ＩＮＦの場合、６７．３％（９５％信頼区間６１．３〜７３．９％）、ＩＮＴの場合、５８．８％（９５％信頼区間５２．９〜６５．４％）、ＧＳＴの場合、５５．３％（９５％信頼区間４８．２〜６３．４％）、ＭＸＤの場合、４５．０％（９５％信頼区間３６．５〜５５．４％）、ＭＳＣの場合、３３．０％（９５％信頼区間２７．３〜４０．０％）である。（ｅ）は、ｑＰＣＲ３２５コホートのｑＰＣＲ測定結果から２６個の遺伝子で区分した群の５年全体生存曲線である：各分子亜型別の５年生存率は、ＩＮＦの場合、７８．５％（９５％信頼区間６９．４−８８．８％）、ＩＮＴの場合、７０．７％（９５％信頼区間６１．１−８１．８％）、ＧＳＴの場合、６８．４％（９５％信頼区間５５．１−８４．９％）、ＭＸＤの場合、５４．６％（９５％信頼区間４１．７−７１．４％）、ＭＳＣの場合、５７．５％（９５％信頼区間４８．４−６８．２％）である。 図９は、新鮮凍結組織のマイクロアレイデータとｑＰＣＲデータ、およびパラフィン包埋サンプルのｑＰＣＲで安定性を有する遺伝子２６個（ｍｉｎｉＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ−２６）を選定および分析する詳細なフローチャートを示すものである。 図１０は、ＮＭＦクラスタリングを通じて得た５個のクラスターを分子亜型で命名する方法を示すものである。
以下、本発明の構成を具体的に説明する。
本発明は、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、ＶＳＩＧ１、ＣＮＮ１、ＮＥＸＮ、ＳＣＲＧ１、ＳＯＲＢＳ１、ＳＰＡＲＣＬ１、ＡＵＲＫＡ、ＢＵＢ１、ＣＤＣ２０、ＣＥＰ５５、ＰＴＴＧ１、ＵＢＥ２Ｃ、ＣＤ８Ａ、ＧＢＰ１、ＧＢＰ５、ＧＺＭＢ、ＮＫＧ７、ＷＡＲＳ、ＡＮＴＸＲ１、ＳＦＲＰ４、ＶＣＡＮ、ＣＤＨ１７、ＣＤＸ１およびＭＹＯ１Ａを含む標的遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定する製剤；および
ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定する製剤を含む胃癌２期および３期の進行性胃癌の予後予測用組成物に関するものである。
本発明の胃癌２期および３期の予後予測用組成物は、標的遺伝子群のｍＲＮＡ発現水準を測定して、進行性胃癌患者の予後を生存率の側面で予測するための用途で使用できることを特徴とする。
本明細書で、用語「進行性胃癌」は、ＡＪＣＣ６版を基準として２期〜３期に該当する胃癌を意味する。
本明細書で、用語「標的遺伝子」または「マーカー遺伝子」は、明細書内で混用されて使用され、正常や病的な状態を区分できたり、治療後、５年生存率を予測したり、治療反応の予測を客観的に測定できる標識子を意味する。本発明では、進行性胃癌の予後を予測するのに使用できる遺伝子であり、予後に対して増加したり減少する差等的なｍＲＮＡ発現水準を示す遺伝子である。本発明の一具体例によれば、異形質性を有する胃癌に対して新鮮凍結組織のマイクロアレイデータとｑＰＣＲデータ、およびパラフィン包埋サンプル検体のｑＰＣＲデータで統計的有意性を確保して、５個の分子亜型、すなわち、腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）分子亜型、炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型、間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型、混合型間質（Ｍｉｘｅｄ−ｓｔｒｏｍａｌ）分子亜型および胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型に区分できる２６種の遺伝子、すなわち、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、ＶＳＩＧ１、ＣＮＮ１、ＮＥＸＮ、ＳＣＲＧ１、ＳＯＲＢＳ１、ＳＰＡＲＣＬ１、ＡＵＲＫＡ、ＢＵＢ１、ＣＤＣ２０、ＣＥＰ５５、ＰＴＴＧ１、ＵＢＥ２Ｃ、ＣＤ８Ａ、ＧＢＰ１、ＧＢＰ５、ＧＺＭＢ、ＮＫＧ７、ＷＡＲＳ、ＡＮＴＸＲ１、ＳＦＲＰ４、ＶＣＡＮ、ＣＤＨ１７、ＣＤＸ１およびＭＹＯ１Ａを選定した。
本明細書で、用語「参考遺伝子（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ）」は、常に安定して発現する遺伝子を指す。すなわちどんな組織でも一定に発現する遺伝子であって、参考遺伝子の発現量とマーカー遺伝子の発現量を比較することにより、マーカー遺伝子の発現量を調査するときに使用する。すなわち、サンプルごとに定性（ｑｕａｌｉｔｙ）的差異、保管機関による変移が存在するので、遺伝子の発現量を測定しても、その測定量が生物学的変移だと判断し難い。したがって、標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）を通じてサンプル間の遺伝子発現量（ΔＣｑ）を決定する。通常、標準化方法には、Ｑｕａｎｔｉｌｅによる方法、Ｇｌｏｂａｌ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ方法、参考遺伝子による方法などがあるが、本発明は、参考遺伝子による標準化を使用する。また、単一遺伝子を参考遺伝子として活用することは、正確度に劣ることがあり、多数の遺伝子を選定し、変異度を調査して組織の特性に適合した参考遺伝子を選定することができる。本発明では、胃癌と関連して文献に開示されていたり、既存の商用化製品で活用されている遺伝子を選定し、選定された遺伝子を対象として適格の可否を立証して参考遺伝子として使用する。本発明の一具体例によれば、文献に開示された２１個の参考遺伝子を対象として食道癌、すい臓癌、胃癌、大腸癌などの癌組織と正常組織を比較して、ｑＰＣＲを通じて最も変異度が小さい遺伝子を参考遺伝子として選定した。次に、商用化製品で使用する参考遺伝子として、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を選定してｑＰＣＲを行い、最終的に、本発明の進行性胃癌の再発または抗癌剤反応の可能性を予測するのに使用する参考遺伝子としてＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１からなる遺伝子群を使用した。
本明細書で、用語「ｍＲＮＡの発現水準測定」とは、進行性胃癌の再発を予測するために生物学的試料で予後マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現程度を確認する過程であり、ｍＲＮＡの量を測定することを意味する。例えば、ｑＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）が使用できるが、これに限定されるものではない。
本発明による組成物において、予後マーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現水準を測定する製剤は、予後マーカー遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合するプライマー、プローブまたはアンチセンスヌクレオチドを含む。本発明による予後マーカー遺伝子の情報は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔなどに知られているので、当業者ならこれを基に遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合するプライマー、プローブまたはアンチセンスヌクレオチドを容易にデザインすることができる。
本明細書で、用語「プライマー」は、標的遺伝子配列を認知する断片であって、正方向および逆方向のプライマー対を含むが、好ましくは、特異性および敏感性を有する分析結果を提供するプライマー対である。プライマーの核酸配列が試料内存在する非−標的配列と不一致する配列なので、相補的なプライマー結合部位を含有する標的遺伝子配列のみを増幅し、非特異的増幅を誘発しないプライマーであるとき、高い特異性が付与され得る。本発明の一具体例によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１〜６２に記載されたプライマーセットを使用することができる。各標的遺伝子群および参考遺伝子群のプライマーセットは、下記の表１および２に羅列される。
本明細書で、用語「プローブ」とは、試料内の検出しようとする標的物質と特異的に結合できる物質を意味し、前記結合を通じて特異的に試料内の標的物質の存在を確認できる物質を意味する。プローブの種類は、当業界で通常使用される物質であって、制限はないが、好ましくは、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。より具体的に、前記プローブは、バイオ物質として生物に由来するか、これと類似なものまたは生体他で製造されたものを含むものであり、例えば、酵素、蛋白質、抗体、微生物、動植物細胞および器官、神経細胞、ＤＮＡ、およびＲＮＡであってもよく、ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、オリゴヌクレオチドを含み、ＲＮＡは、ゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチドを含み、蛋白質の例としては、抗体、抗原、酵素、ペプチドなどを含むことができる。本発明の一具体例によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：６３〜９３に記載されたプローブが使用できる。好ましくは、前記プローブは、蛍光標識されたものであってもよい。各標的遺伝子群および参考遺伝子群のプローブは、下記表１および表２に羅列される。
本明細書で、用語「アンチセンス」は、アンチセンスオリゴマーがワトソン・クリック型塩基対の形成によってＲＮＡ内の標的配列と混成化されて、標的配列内で典型的にｍＲＮＡとＲＮＡ：オリゴマーヘテロ二重体の形成を許容する、ヌクレオチド塩基の配列およびサブユニット間バックボーンを有するオリゴマーを意味する。オリゴマーは、標的配列に対する正確な配列相補性または近似相補性を有することができる。
本明細書で、用語「予後予測」は、特定の疾病または疾患に対する対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を判定すること、特定の疾病または疾患にかかった対象の予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ；例えば、前−転移性または転移性癌状態の同定、癌の段階決定または治療に対する癌の反応性決定）を判定すること、またはセラメトリックス（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ；例えば、治療効能に対する情報を提供するためにオブジェクトの状態をモニタリングすること）を含む。本発明の目的上、手術後、胃癌患者の予後を全体生存率（Ｏｖｅｒａｌｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ）の側面で予測することである。
本発明の一具体例によれば、前記標的遺伝子は、次のように選別する。まず、進行性胃癌組織を対象にコンセンサス基盤のＮＭＦを進めて、高い関連性を示す５個の分子的特徴が区分される亜型を決定し、亜型特異的な遺伝子群を選別する。
前記ＮＭＦ（非負値行列因子分解、ｎｏｎｎｅｇａｔｉｖｅ ｍａｔｒｉｘ ｆａｃｔｏｒｉｚａｔｉｏｎ）は、次元縮小方法（Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）で発現パターンの類似性が高いサンプルを亜型に分類する方法である。
前記胃癌分子亜型を決定するためには、資源縮小方法で一つのマトリックスを二つの非負値行列で因数分解することにより、ＮＭＦアルゴリズムを通じて共通した部分（ｂａｓｉｓ）を分離することである。実際の情報集団をＶ、分離しようとする行列をＷ、Ｈという。Ｖ＝ＷＨを満たすようになり、Ｗは、基底行列を、Ｈは、符号化行列を示す。Ｖは、Ｗの基底の和で構成、Ｖは、（ｎ×ｍ）サイズ、Ｗは、（ｎ×ｒ）、Ｈは、（ｒ×ｍ）サイズの行列である。高次元のデータ行列を低次元の係数行列と基底行列に分解し、各行列が希少特性を有しているので、部分基盤表現が可能である。このアルゴリズムにより、胃癌は、類似性が高いもの同士の群を形成して胃癌亜型分類に適用することができる。
ＲプログラムのＮＭＦパッケージを利用して、コンセンサスマップ（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｍａｐ）とコーフェン（ｃｏｐｈｅｎｅｔｉｃ）グラフを根拠に胃癌亜型の適合したクラスターを選定する。それぞれのＳＤ（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ＝０．８、０．９、１．０）でｋ（クラスターの数）値にコンセンサスクラスタリング（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）されることを確認し、最終的に、胃癌亜型の個数を選択する（図３参照）。本発明の一具体例によれば、Ｋは、５に定めた。
前記各亜型別の特徴を生物学的遺伝子セットから導き出して分子的異形質性を区分した結果、５個の亜型、すなわち、腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）分子亜型、炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型、間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型、混合型間質（Ｍｉｘｅｄ−ｓｔｒｏｍａｌ）分子亜型および胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型に区分される。
コックス比例ハザードモデル（Ｃｏｘ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ ｈａｚａｒｄ ｍｏｄｅｌ）を利用して前記５個の分子亜型格別の生存分析を行った結果、炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型である場合、全体生存率の側面で良い予後、腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）分子亜型および胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型である場合、中間予後、混合型間質（Ｍｉｘｅｄ−ｓｔｒｏｍａｌ）分子亜型および間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型である場合、悪い予後を示す。
一方、胃癌の生物学的特性を分析するためには、ＷＧＣＮＡ（Ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋ ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用する。ＷＧＣＮＡは、発現様相が類似に現れる遺伝子間の相関関係を通じて発現関連性によって遺伝子を クラスタリングする分析技法であって、ＷＧＣＮＡを通じてモジュール（ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｉｎｔｅｒｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅｓ）を探し、モジュールの性格とモジュールの相関関係によって胃癌特性を反映したシグネチャーを選別する。本発明の一具体例によれば、胃癌で安定的に保存されている６個のシグネチャー、すなわち、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２およびＶＳＩＧ１からなる胃（ｇａｓｔｒｉｃ）シグネチャー；ＣＮＮ１、ＮＥＸＮ、ＳＣＲＧ１、ＳＯＲＢＳ１およびＳＰＡＲＣＬ１からなる間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）シグネチャー；ＡＵＲＫＡ、ＢＵＢ１、ＣＤＣ２０、ＣＥＰ５５、ＰＴＴＧ１およびＵＢＥ２Ｃからなる増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）シグネチャー；ＣＤ８Ａ、ＧＢＰ１、ＧＢＰ５、ＧＺＭＢ、ＮＫＧ７およびＷＡＲＳからなる免疫（ｉｍｍｕｎｅ）シグネチャー；ＡＮＴＸＲ１、ＳＦＲＰ４およびＶＣＡＮからなる幹細胞様（ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ）シグネチャー；およびＣＤＨ１７、ＣＤＸ１およびＭＹＯ１Ａからなる腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）シグネチャーを確認した。
これらの６個のシグネチャーを代表する遺伝子と５個の胃癌分子亜型の間をスピアマン相関関係で比較分析したとき、相互関連性を示した。これを通じて、共通して保存される遺伝子を選別した後、これらをサンプル方法（Ｆｒｅｓｈ Ｆｒｏｚｅｎ、ＦＦＰＥ）によって、そして、発現測定プラットフォーム（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ、ｑＰＣＲ）によって安定的に発現結果を示す２６個の遺伝子、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、ＶＳＩＧ１、ＣＮＮ１、ＮＥＸＮ、ＳＣＲＧ１、ＳＯＲＢＳ１、ＳＰＡＲＣＬ１、ＡＵＲＫＡ、ＢＵＢ１、ＣＤＣ２０、ＣＥＰ５５、ＰＴＴＧ１、ＵＢＥ２Ｃ、ＣＤ８Ａ、ＧＢＰ１、ＧＢＰ５、ＧＺＭＢ、ＮＫＧ７、ＷＡＲＳ、ＡＮＴＸＲ１、ＳＦＲＰ４、ＶＣＡＮ、ＣＤＨ１７、ＣＤＸ１およびＭＹＯ１Ａを選別した。
前記選別された２６個の遺伝子を標的遺伝子群に定め、各標的遺伝子のスコア
を利用して標的遺伝子群の各シグネチャーの発現平均値を計算し、これから分類された分子亜型を確認する。
前記で胃癌の分子亜型が決定されれば、各分子亜型の生存曲線を通じて予後を予測することである。例えば、前記分子亜型は、全体生存率の側面で良い予後群、中間予後群および悪い予後群に分類される。具体的に、胃癌分子亜型が炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型である場合、全体生存率の側面で良い予後群；腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）分子亜型および胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型である場合、中間予後群；混合型間質（Ｍｉｘｅｄ−ｓｔｒｏｍａｌ）分子亜型および間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型である場合、悪い予後群として予測することである。
本発明の胃癌２期および３期の予後予測用組成物は、薬剤学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。
前記薬剤学的に許容可能な担体は、医薬分野において通常使用される担体およびピヒクルを含み、具体的にイオン交換樹脂、アルミナ、アルミニウムステアレート、レシチン、血清蛋白質（例、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えば、各種燐酸塩、グリシン、ソルビン酸、カリウムソルベート、飽和植物性脂肪酸の部分的なグリセリド混合物）、水、塩または電解質（例、プロタミンサルフェート、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウムおよび亜鉛塩）、膠質性シリカ、マグネシウムトリシリケート、ポリビニルピロリドン、セルロース系基質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアリレート、ワックス、ポリエチレングリコールまたは羊毛脂などを含むが、これに制限されない。
また、本発明の組成物は、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、または保存剤などをさらに含むことができる。
また、本発明は、胃癌２期および３期の予後予測用組成物を含む胃癌２期および３期の予後予測用キットに関する。
好ましくは、前記キットは、ｑＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）キットなどであってもよい。
前記胃癌２期および３期の予後予測用キットは、分析方法に適合した一種類またはそれ以上の他の構成成分組成物、溶液または装置をさらに含むことができる。好ましくは、前記診断用キットは、ｑＰＣＲ反応を行うために必要な必須要素をさらに含むことができる。ｑＰＣＲキットは、マーカー蛋白質を暗号化する遺伝子に対して特異的なプライマー対を含む。プライマーは、前記遺伝子の核酸配列に特異的な配列を有するヌクレオチドであって、約７ｂｐ〜５０ｂｐの長さ、より好ましくは、約１０ｂｐ〜３０ｂｐの長さを有することができる。また、対照群遺伝子の核酸配列に特異的なプライマーを含むことができる。その他、ｑＰＣＲキットは、テストチューブまたは他の適切な容器、反応バッファー（ｐＨおよびマグネシウム濃度は多様）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑ−ポリメラーゼおよび逆転写酵素のような酵素、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ抑制剤ＤＥＰＣ−水（ＤＥＰＣ−ｗａｔｅｒ）、滅菌水などを含むことができる。
また、本発明の胃癌２期および３期の予後予測用キットは、ＤＮＡチップを行うために必要な必須要素を含むことができる。ＤＮＡチップキットは、遺伝子またはその断片に該当するｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）が付着している基板、および蛍光標識プローブを製作するための試薬、製剤、酵素などを含むことができる。また、基板は、対照群遺伝子またはその断片に該当するｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドを含むことができる。
また、本発明は、統計的有意値を示すことができる程度のサンプル数を有する胃癌２期および３期の進行性胃癌患者から得た基準サンプルと生物学的サンプルで、
ＴＦＦ１、ＴＦＦ２およびＶＳＩＧ１からなる胃（ｇａｓｔｒｉｃ）シグネチャー；ＣＮＮ１、ＮＥＸＮ、ＳＣＲＧ１、ＳＯＲＢＳ１およびＳＰＡＲＣＬ１からなる間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）シグネチャー；ＡＵＲＫＡ、ＢＵＢ１、ＣＤＣ２０、ＣＥＰ５５、ＰＴＴＧ１およびＵＢＥ２Ｃからなる増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）シグネチャー；ＣＤ８Ａ、ＧＢＰ１、ＧＢＰ５、ＧＺＭＢ、ＮＫＧ７およびＷＡＲＳからなる免疫（ｉｍｍｕｎｅ）シグネチャー；ＡＮＴＸＲ１、ＳＦＲＰ４およびＶＣＡＮからなる幹細胞様（ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ）シグネチャー；およびＣＤＨ１７、ＣＤＸ１およびＭＹＯ１Ａからなる腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）シグネチャーを含む標的遺伝子群と、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子群のｍＲＮＡ発現水準を測定する段階；
下記の式１により基準サンプルと生物学的サンプルの標的遺伝子群のΔＣｑ値を計算して、コンピュータプログラムに入力する段階；および
前記コンピュータプログラムに入力した値に対してＮＭＦ（Ｎｏｎ−ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍａｔｒｉｘ Ｆａｃｔｏｒｉｚａｔｉｏｎ）およびＮＭＦ基盤クラスタリングを行い、複数個のクラスターに分類し、各クラスターで標的遺伝子群のスコア
を下記の式２に適用してＳＶ（Ｓｃｏｒｅ Ｖａｌｕｅ）を計算し、ＳＶによって腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）分子亜型、炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型、間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型、混合型間質（Ｍｉｘｅｄ−ｓｔｒｏｍａｌ）分子亜型および胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型に分類し、全体生存率（Ｏｖｅｒａｌｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ）の側面で予後を分析して、生物学的サンプルが属する分子亜型の予後を予測する段階を含み、
前記胃癌の分子亜型は、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）シグネチャーのＳＶが最大値を有するクラスターを胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型に定め；胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型に決定されたクラスターを除いたクラスターのうち間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）シグネチャーのＳＶが最大値を有し、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）シグネチャーのＳＶが最小値を有するクラスターを間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型に定め；胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型および間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型に決定されたクラスターを除いたクラスターのうち免疫（ｉｍｍｕｎｅ）シグネチャーのＳＶが最大値を有し、腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）シグネチャーのＳＶが最小値を有するクラスターを炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型に定め；胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型、間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型および炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型に決定されたクラスターを除いたクラスターのうち幹細胞様（ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ）シグネチャーのＳＶが最大値を有する場合、混合型間質（Ｍｉｘｅｄ−ｓｔｒｏｍａｌ）分子亜型に定め；最終的に残ったクラスターを腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）分子亜型に定めて分類し、
前記胃癌の分子亜型が炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型である場合、全体生存率の側面で良い予後群；腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）分子亜型および胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型である場合、中間予後群；混合型間質（Ｍｉｘｅｄ−ｓｔｒｏｍａｌ）分子亜型および間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型である場合、悪い予後群として予測する、胃癌２期および３期の予後予測のための情報を提供する方法、または胃癌２期および３期の予後予測方法に関する：
ここで、参考遺伝子群のＣｑ平均値は、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子群のＣｑ値の平均値を意味する。
ここで、ＳＶは、ＮＭＦ基盤クラスタリングに得たクラスターで各シグネチャーの発現平均値、ｔは、当該シグネチャーに属する遺伝子（ｉ）の数、
は、シグネチャー（θ＝ ６）、ｋは、クラスターの数であって、２〜７の整数であり、
は、各遺伝子の全体平均と各クラスター平均の間の距離をベースとするスコアであり、下記の式３により求める。
ここで、臨界値（Δ）は、０．１に定めて、分子亜型別の特異性がない遺伝子は、０に収斂させ、
は、
の符号を意味し、
は、下記の式４により求める。
ここで、各分子亜型（ｋ）内の当該遺伝子（ｉ）平均値
当該遺伝子（ｉ）の全体平均値
であり、
は、
の標準誤差を補正するための自由度
であり、
は、遺伝子（ｉ）の全体サンプルに対する当該分子亜型（ｋ）内の標準偏差であり、
は、
の中央値である。
本発明の胃癌２期および３期の予後予測のための情報を提供する方法を段階別に具体的に説明すれば、次のとおりである。
第１段階で、胃癌２期および３期腫瘍で得た一定の数の基準サンプルで標的遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定し、胃癌２期および３期腫瘍で得た生物学的サンプルの標的遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定して、基準サンプルと生物学的サンプルの標的遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準に該当する値をコンピュータプログラムに入力する段階である。
前記一定の数、すなわち、統計的有意値を示すことができる程度の基準サンプル数は、標的遺伝子群のｍＲＮＡ発現水準に対してＮＭＦ（Ｎｏｎ−ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍａｔｒｉｘ Ｆａｃｔｏｒｉｚａｔｉｏｎ）を進める場合、有意値のｐ値が０．０１未満になり得るサンプル数を意味する。
また、前記基準サンプル数は、ＮＭＦ基盤クラスタリングによって差別化された遺伝子発現様相を示しながら、複数個のクラスターに分類され得る程度の数でなければならない。
このような条件を充足する基準サンプル数は、好ましくは、３００〜１０，０００であってもよい。
前記標的遺伝子群のｍＲＮＡ発現水準は、好ましくは、ｑＰＣＲを通じて測定することができ、ｑＰＣＲによるｍＲＮＡ発現水準は、ΔＣｑ値に定める。前記Ｃｑ値は、９５℃で１０分（初期変性）；９５℃で１０秒、４０〜４５回（変性）、６０℃で５秒（アニーリング）および７２℃で２５秒（延長）のＰＣＲ過程中に増幅が明確に増加し始めたサイクルの数値をいう。
標的遺伝子群と参考遺伝子群のＣｑ平均値を利用して下記の式１によりΔＣｑ値を計算する。
ここで、参考遺伝子群のＣｑ平均値は、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子群のＣｑ値の平均値を意味する。
したがって、コンピュータプログラムに入力する標的遺伝子群のｍＲＮＡ発現水準に該当する値は、前記ΔＣｑ値を意味する。
第２段階は、コンピュータプログラムに入力された基準サンプルと生物学的サンプルの標的遺伝子群のΔＣｑ値に対してＮＭＦおよびＮＭＦ基盤クラスタリングを行い、複数個のクラスターに分類し、各クラスターで標的遺伝子群のスコア
を下記の式２に適用してＳＶ（Ｓｃｏｒｅ Ｖａｌｕｅ）を計算し、ＳＶによって腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）分子亜型、炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型、間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型、混合型間質（Ｍｉｘｅｄ−ｓｔｒｏｍａｌ）分子亜型および胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型に分類し、全体生存率（Ｏｖｅｒａｌｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ）の側面で予後を分析して生物学的サンプルが属する分子亜型の予後を予測する段階である。
ここで、ＳＶは、ＮＭＦ基盤クラスタリングに得たクラスターで各シグネチャーの発現平均値、ｔは、当該シグネチャーに属する遺伝子（ｉ）の数、
は、シグネチャー（θ＝ ６）、ｋは、クラスターの数であって、２〜７の整数であり、
は、各遺伝子の全体平均と各クラスター平均の間の距離をベースとするスコアである。
本発明によれば、前記ｋは、好ましくは、５であってもよい。すなわち、ＮＭＦ基盤クラスタリングを通じて得た５個のクラスターを意味する。
前記スコア
は、各遺伝子の全体平均と各クラスター平均の間の距離をベースとするスコア、すなわち、当該遺伝子（ｉ）のｔ−統計値であり、同じ分子亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）内のサンプル遺伝子発現量に加重値を与えて標準化するもので、線形判別分析（ＬＤＡ；Ｌｉｎｅａｒ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ）で頻繁に使用される統計方法であって、下記の式３により求める：
ここで、臨界値（Δ）は、０．１に定めて、分子亜型別の特異性がない遺伝子は、０に収斂させ、
は、
の符号を意味し、
は、下記の式４により求める：
ここで、各分子亜型（ｋ）内の当該遺伝子（ｉ）平均値
当該遺伝子（ｉ）の全体平均値
であり、
は、
の標準誤差を補正するための自由度
であり、
は、遺伝子（ｉ）の全体サンプルに対する当該分子亜型（ｋ）内の標準偏差であり、
は、
の中央値である。
前記スコア
で正数は、遺伝子の高発現、負数は、遺伝子の低発現、０は、遺伝子の発現変化がないことを意味する。したがって、正数の値が大きいほど発現がさらに高くなり、負数の値が大きいほど発現はさらに低くなる。
前記胃癌の分子亜型は、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）シグネチャーのＳＶが最大値を有するクラスターを胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型に定め；胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型に決定されたクラスターを除いたクラスターのうち間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）シグネチャーのＳＶが最大値を有し、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）シグネチャーのＳＶが最小値を有するクラスターを間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型に定め；胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型および間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型に決定されたクラスターを除いたクラスターのうち免疫（ｉｍｍｕｎｅ）シグネチャーのＳＶが最大値を有し、腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）シグネチャーのＳＶが最小値を有するクラスターを炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型に定め；胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型、間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型および炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型に決定されたクラスターを除いたクラスターのうち幹細胞様（ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ）シグネチャーのＳＶが最大値を有する場合、混合型間質（Ｍｉｘｅｄ−ｓｔｒｏｍａｌ）分子亜型に定め；最終的に残ったクラスターを腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）分子亜型に定めて分類する。
前記で分類された分子亜型に対して各分子亜型の生存曲線を通じて全体生存率の側面で予後を予測する。
前記胃癌の分子亜型は、生存曲線で差別化された予後様相を示し、炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型である場合、全体生存率の側面で良い予後群；腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）分子亜型および胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型である場合、中間予後群；混合型間質（Ｍｉｘｅｄ−ｓｔｒｏｍａｌ）分子亜型および間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型である場合、悪い予後群として予測することができる。
したがって、生物学的サンプルが属する分子亜型を定め、前記分子亜型の生存曲線を通じて予後を予測することができる。
前記生物学的サンプルは、新鮮腫瘍組織、新鮮凍結腫瘍組織、パラフィン包埋腫瘍組織、微細針吸引液、腹水、管洗浄液または胸膜液などであってもよく、好ましくは、パラフィン包埋腫瘍組織であってもよい。
また、前記標的遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準の測定は、ｑＰＣＲによって行われ得る。
本発明の利点および特徴、そしてそれらを達成する方法は、詳細に後述されている実施例を参照すれば明確になるだろう。しかし、本発明は、以下で開示される実施例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態で具現されるものであり、単に本実施例は、本発明の開示が完全になりようにし、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は、請求項の範疇によって定義されるだけである。
＜実施例＞
（患者およびサンプル）
２０００年から２０１０年まで延世大学校セブランス病院で１次治療時に胃癌切除手術を受けた胃癌患者の新鮮−凍結腫瘍標本および臨床データを確保した。すべてのサンプルは、患者から書面同意を得た後に収集され、研究は、ＹＵＳＨの機関検討委員会の承認を受けた。サンプルに注釈を付けたが、患者識別が可能な情報からそれらを分離した。後ろ向きに臨床データを得た。ＯＳ（ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ）は、手術から死亡までの時間として定義し、再発ない生存は、手術後に最初の再発までの時間として定義した。最後の接触時に再発なしに患者が生きているとき、データが検閲された。
４８，８０３個の遺伝子特徴を有するＨｕｍａｎＨＴ−１２ ｖ３．０ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐ ａｒｒａｙ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して外科的に除去された凍結ＧＣ腫瘍組織の４９７個のサンプルからの遺伝子発現プロファイルを測定した（ＧＳＥ１３８６１ｐ）。簡単に話せば、ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（登録商標）ｔｏｔａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）またはｍｉｒＶａｎａ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して新鮮−凍結組織でトータルＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ濃度と純度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して２６０ｎｍと２８０ｎｍ（Ａ２６０：Ａ２８０＝１．８）で測定した。ＲＮＡの完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）は、ＲＮＡ Ｎａｎｏ ６０００チップ（Ａｇｉｌｅｎｔ）（ＲＩＮ＞７）を使用して評価した。ＴｏｔａｌＰｒｅｐ（登録商標）ＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して製造業者のプロトコルにより５００ｎｇのトータルＲＮＡを標識した後、ＢｅａｄＣｈｉｐアレイプラットフォームを使用して遺伝子発現水準を測定した。
（ＧＣランニングのためのトレーニングセットおよびテストセット）
ＧＣ分子亜型を探すためのトレーニングセットＩは、ＧＳＥ１３８６１ｐ（ｎ＝４９７、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｕｍａｎＨＴ−１２ ｖ３．０ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐアレイ）で構成した。これを確認するためのテストセットＩは、ＧＳＥ１５４５９（ｎ＝２００、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ｐｌｕｓ ２．０ Ａｒｒａｙ）、ＴＣＧＡ（ｎ＝２６２、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２０００）およびＧＳＥ６２２５４（ｎ＝３００、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ｐｌｕｓ ２．０ Ａｒｒａｙ）のデータセットで構成した。
最終ｍｉｎｉＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ−２６（２６個の遺伝子）を選定するために、トレーニングセットＩＩは、ＧＳＥ１３８６１ｐ（ｎ＝４９７）、ＧＳＥ１５４５９（ｎ＝２００）、ＴＣＧＡ（ｎ＝２６２）、ＧＳＥ６２２５４（ｎ＝３００）をＣｏｍＢａｔ方法で併合されたＭｅｒｇｅｄ１２５９（ｎ＝１２５９）で構成し、ｑＰＣＲ基盤測定可能な２６個の遺伝子は、ｑＰＣＲ３２５（ｎ＝３２５）をテストセットＩＩで構成して確認した。ｑＰＣＲ３２５を得るために、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（登録商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＤＮＡとＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）を使用してトータルＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡは、Ｍ−ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して生成した。ｃＤＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００を使用して決めた。ＳｅｎｓｉＦＡＳＴ Ｐｒｏｂｅ Ｌｏ−ＲＯＸキット（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、５' ＦＡＭ／３' ＢＨＱ−１プローブ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、遺伝子特異プライマーおよびＶｉｉＡ（登録商標）７リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｑＰＣＲを行い、５ｎｇのトータルｃＤＮＡを使用した。
（データ加工）
データ前加工：マイクロアレイデータセットは、主にＲ言語環境で処理された。正規化は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＣｈｉｐアレイプラットフォームのデータセットに対する「マイクロアレイデータ用線形モデル（ｌｉｍｍａ）」パッケージのＢｅｔｗｅｅｎ−Ａｒｒａｙ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ（ｑｕａｎｔｉｌｅ）により行われた。ＧＳＥ １５４５９およびＧＳＥ６２２５４は、堅固な多重アレイ平均正規化を含むＲ「ａｆｆｙ」パッケージを使用して標準化された。ｑＰＣＲデータセットは、内部標準によって標準化された。遺伝子フィルタリングのためには、プラットフォーム由来プローブ有効性と遺伝子発現の差異を考慮しなければならない。トレーニングセットの場合、データセットを一括調整した後、「遺伝子発現マイクロアレイデータ（ＣｏｍＢａｔ）の配置を結合するとき、一括処理効果防止」方法と結合した。
ＮＭＦ基盤分類：ＣｏｍＢａｔ併合データは、「Ｎｏｎｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍａｔｒｉｘ Ｆａｃｔｏｒｉｚａｔｉｏｎ（ＮＭＦ）アルゴリズムおよびフレームワーク」パッケージを使用して分類された。クラスター数ｋは、２から７に設定された。Ｂｒｕｎｅｔ方法は、反復近似のためのアップデートアルゴリズムで使用された。ＮＭＦ派生クラスターを特性化する前に、「Ｓｉｌｈｏｕｅｔｔｅ」Ｒパッケージを使用して各クラスターで異常値サンプルを除いた。それぞれのＮＭＦクラスターを代表する遺伝子を定義するために、ＳＡＭおよびＰＡＭは、それぞれＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージ「ｓｉｇｇｅｎｅｓ」および「ｐａｍｒ」を使用して行われた。
ＷＧＣＮＡ分析：ＷＧＣＮＡは、Ｒ「ｗｇｃｎａ」パッケージを使用して４９７ＧＣサンプルで行われた。ネットワーク構成のために加重ネットワーク隣接性は、６の自乗で表現された類似性によって定義される。任意カットオフ選択を避けるために、ＷＧＣＮＡで提供した「ソフト臨界設定手続」に従った。モジュール−探知方法でＲ「ｄｙｎａｍｉｃＴｒｅｅＣｕｔ」パッケージの動的混成化が適用された。各モジュールが生存および臨床病理学的変数と関連があるかを評価するために、連結性、モジュール重要性およびモジュールｅｉｇｅｎｇｅｎｅのような多様なモジュール特性が活用された。
Ｇｅｎｅ ｓｅｔ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ）：ＧＳＥＡはＲ「ＧＳＥＡＢａｓｅ」パッケージを使用して行われた。事前定義された遺伝子セットは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＳｉｇＤＢ；ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｍｓｉｇｄｂ）から持ってきた。エンリッチメント分析は、Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ）の遺伝子オントロジーを使用して行われた。
生存分析：生存分析は、Ｒ「ｓｕｒｖｉｖａｌ」および「ｍｅｔａ」パッケージでＨＲのＣｏｘ比例危険モデルおよびメタ分析を使用して行われた。
遺伝子発現プロファイルの階層的クラスタリングおよびイラストレーション：マイクロアレイデータセットの遺伝子クラスタリングは、Ｇｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ ３．０を使用して行われた。階層的クラスタリング結果は、Ｒ「ｇｐｌｏｔｓ」パッケージを使用して視覚的に視覚化された。
（統計的分析）
統計的試験として超幾何分布検定／Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔ、Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ、Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎおよびＷｉｌｃｏｘｏｎ ｒａｎｋ−ｓｕｍ ｔｅｓｔを使用した。
（プライマリ細胞−特異的遺伝子発現プロファイリング）
プライマリ細胞培養：一次組織を２％抗生剤（Ｗｅｌｇｅｎｅ ＬＳ２０３−０１）を含有したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（Ｗｅｌｇｅｎｅ ＬＢ００−０２）で洗浄し、滅菌ブレードで細切れにした。０．２μｍ注射器で濾過した後、細切れにされた組織をα−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ Ａ１０４９０）および１５０Ｕ／ｍＬ Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と３７℃で２４時間５％ＣＯ２の加湿の雰囲気で培養した。培養された組織を２００×ｇで５分間遠心分離した後、新鮮な培地に移した。収穫された細胞を５％ＣＯ２大気下で３７℃で２〜３日間培養した。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００シーケンシングシステムを利用したトータルＲＮＡシーケンシング：ＲＮＡ純度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ８０００分光光度計で１μＬのトータルＲＮＡ抽出物を分析して決定した。トータルＲＮＡ完全性は、ＲＮＡ完全性番号（ＲＩＮ）値とＲＮＡ断片＞２００ｎｔ断片分配値（ＤＶ２００）の百分率でＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して確認した。トータルＲＮＡシーケンシングライブラリーは、メーカーの指針（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ Ａｃｃｅｓｓ Ｌｉｂｒａｒｙ ｋｉｔ）によって準備された。その後、１００ｎｇのトータルＲＮＡを高温で２価カチオンを使用して小さい断片で***させた。第１および第２ストランド合成の間に、ランダムプライミングを使用して切断されたＲＮＡ断片からｃＤＮＡを生成し、シーケンシングアダプタを生成された二本鎖ｃＤＮＡ断片にライゲイションさせた。転写体のコーディング領域は、最終ライブラリーを生成するために配列特異的プローブを使用してこのライブラリーからキャプチャーされた。増幅されたライブラリーの品質は、毛細管電気泳動（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ）により確認された。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｑＰＣＲ後、同量のモルのタグがついた索引されたライブラリーをプールに結合させた。クラスターの生成は、ｃＢｏｔ自動化クラスター生成システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）のフローセルで実現された。引き続いて、前記フローセルをＨｉＳｅｑ２５００シーケンシングシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上にローディングさせ、配列分析は、２×１００ｂｐ読み取り長さを使用して行った。
（インビトロおよびインビボ実験検証）
細胞株：ヒト胃癌細胞株ＳＮＵ−１、ＳＮＵ−５、ＳＮＵ−１６、ＳＮＵ−２１６、ＳＮＵ−４８４、ＳＮＵ−５２０、ＳＮＵ−６０１、ＳＮＵ−６２０、ＳＮＵ−６３８、ＳＮＵ−６６８、ＳＮＵ−７１９、ＭＫＮ, ＭＫＮ−４５、ＭＫＮ−７４、ＫＡＴＯＩＩＩ、ＮＣＩ−Ｎ８７およびＨｓ７４６Ｔは、韓国細胞株銀行（ソウル、韓国）で購入した；また、ＹＣＣ−１、ＹＣＣ−２、ＹＣＣ−３、ＹＣＣ−６、ＹＣＣ−７、ＹＣＣ−９、ＹＣＣ−１０、ＹＣＣ−１１およびＹＣＣ−１６は、延世癌研究所（ソウル、韓国）で購入した。ＳＮＵ−１、ＳＮＵ−５、ＳＮＵ−１６、ＳＮＵ−２１６、ＳＮＵ−４８４、ＳＮＵ−５２０、ＳＮＵ−６０１、ＳＮＵ−６２０、ＳＮＵ−６３８、ＳＮＵ−６６８、ＳＮＵ−７１９、ＭＫＮ−２８、ＭＫＮ−４５、ＭＫＮ−７４、ＫＡＴＯＩＩＩおよびＮＣＩ−Ｎ８７は、ＲＰＭＩ１６４０（Ｗｅｌｇｅｎｅ、大邱、韓国）で成長させた；Ｈｓ７４６Ｔは、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｗｅｌｇｅｎｅ、大邱、韓国）で成長させた；また、ＹＣＣ−１、ＹＣＣ−２、ＹＣＣ−３、ＹＣＣ−６、ＹＣＣ−７、ＹＣＣ−９、ＹＣＣ−１０、ＹＣＣ−１１、およびＹＣＣ−１６は、Ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉａ Ｅａｇｌｅ（ＭＥＭ；Ｗｅｌｇｅｎｅ、大邱、韓国）で成長させた。すべての細胞を３７℃で１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）と１％抗生剤−抗菌溶液（１０，０００単位ペニシリン、１０ｍｇストレプトマイシン、２５μｇアムホテリシンＢ／ｍＬを含む、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が補充された完全培地で５％ＣＯ２を含有する加湿の雰囲気で培養した。すべての細胞は、ｅ−Ｍｙｃｏ（登録商標）とＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ｉＮｔＲＯＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、城南、韓国）によりマイコプラズマに対して陰性であると確認された。
浸湿分析：分析のために培養培地（Ｍ１９９）に２×１０４ＨＵＶＥＣ細胞をピブロネクティンがコートされたトランスウェルに入れ、底を０．２％ゼラチンでコートした後、単層の形成まで４８時間培養した。次に、ＦＢＳがないＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｃ２９２５）が含まれた１×１０５／５０μＬのＨｓ７４６ＴおよびＮＣＩ−Ｎ８７細胞を別にトランスウェルに添加した。１０％ＦＢＳを含有する培養培地を下部チャンバーに添加した。４８時間培養した後、メンブレインの上部細胞を綿棒で除去した。下部メンブレインの細胞を室温で２〜３時間２００μＬの溶解バッファーで溶解させた。Ｅｘ／Ｅｍ４９２／５１７で蛍光を測定した。ＴＧＦ−β抑制剤が細胞の侵入能力に及ぼす影響を調べるために、ＬＹ２１５７２９９（ＡｄｏｏＱ、カリフォルニア、米国）を５０μＭ投与した。
移動分析：Ｈｓ７４６ＴおよびＮＣＩ−Ｎ８７細胞を１０％ＦＢＳおよび１％抗生剤が含有された培養培地で単層に成長させた。密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）が７０％に到達すれば、細胞単層を１００μＬのピペットの先でかき出した。７２時間後に創傷の幅を測定し、かき出した直後に測定した創傷の幅で標準化した。ＴＧＦ−β抑制剤が細胞移動に及ぼす影響を評価するために、ＬＹ２１５７２９９（５０μＭ）を投与した。
腫瘍スフェロイド形成分析：９６−ウェルプレートで、１０個の細胞をｂＦＧＦ、ＥＧＦ、Ｂ２７、１０％ＦＢＳおよび１％抗生剤が添加された５０μｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。培養３０日後、各ウェルで腫瘍スフェロイドを計数した。また、ＬＹ２１５７２９９（５０μＭ）を投与して、ＴＧＦ−β抑制剤が腫瘍スフェロイド形成に及ぼす影響を調査した。
同所マウスモデルでインビボ腫瘍形成：すべての動物実験は、国際実験動物管理評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）の承認を受けて行われた。同所移植マウスモデルを確立するために、約１時間略５ｍｍで上部の正中線に沿って皮膚と腹膜を切開して、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（男性）の外装型胃壁に１×１０７ＧＣ細胞（Ｈｓ７４６ＴおよびＮＣＩ−Ｎ８７）を移植した。胃を腹膜に戻して、腹壁を１層の創傷縫合で閉鎖した。モデルで腫瘍成長を観察するために、Ｂｒｕｋｅｒ動物性コイル（ＲＦ ＳＵＣ ４００ １Ｈ Ｍ−ＢＲ−ＬＩＮ ＲＯＡＤ、Ｂｒｕｋｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）が装着された９．４Ｔ動物磁気共鳴映像（ＭＲＩ）装備を使用して癌の有無およびサイズを追跡した（磁気共鳴映像測定条件：Ｅｃｈｏ＝１、ＴＲ＝２３００ｍｓ、ＴＥ＝２２．０ｍｓ、ＦＡ＝１８０ｄｅｇ、ＴＡ＝Ｏｈ４ｍ５４ｓ４００ｍｓ、ＮＥＸ＝２、およびＦＯＶ＝４．００ｃｍ）。
移植マウスモデルで薬物反応：異種移植マウスモデルを確立するために、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（雄性）の近位大腿部位に１×１０７ＧＣ細胞（Ｈｓ７４６ＴおよびＮＣＩ−Ｎ８７）を移植した。腫瘍体積が４００ｍｍ３に増加するとき、腫瘍保有マウスを３個の他の治療群（ＰＢＳ対照群、Ｏｘａｌ＋５ＦＵ／ＰＢＳ処理群およびＯｘａｌ＋５ＦＵ／ＬＹ２１５７２９９（ＴＢＦβ阻害剤）処理群、各群当たりｎ＝８）で無作為抽出した。オキサリプラチン（単一用量当たり６０μｇ）とフルオロウラシル（単一用量当たり１ｍｇ）を混合して、マウスに一週間に３回腹腔注射した。ＬＹ２１５７２９９（１．５ｍｇ／マウス）を週２回腫瘍内注射モデルに投与した。移植された腫瘍のサイズは、週当たり３回検査し、腫瘍のサイズは、（４／３）×π×（短軸／２）２×（長軸／２）ｍｍ３で計算した。
ｑＰＣＲ分析のためのｍｉｎｉＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ−２６の異質性検査：空間的異質性がＦＦＰＥ標本で組織サンプルを準備する本発明の手続に影響を及ぼす可能性を調査するために、ＲＮＡ抽出のために単一ＦＦＰＥ標本で３個の組織サンプルを得た。ｃＤＮＡを製造した後、ｑＰＣＲを３回施行して、単一腫瘍標本で３個の各標本に対して平均を求めた。各遺伝子に対する分散係数を評価して、三種類の標本の異質性を決定した。
（組織マイクロアレイ構築）
各ホルマリン固定、パラフィン内蔵基本腫瘍で代表的な３ｍｍ直径腫瘍組織コア２個を組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）ブロックで組み立てた。各ＴＭＡブロックは、標識および内部統制として１４個の腫瘍および一つの正常胃粘膜組織コアを含有する。引き続いて、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析のために、各ＴＭＡブロックから４μｍ厚さのセクションを準備した。
（免疫組織化学分析）
ＩＨＣは、ＭｕｔＬホモログ１（ＭＬＨ１、使用準備、Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＭｕｔＳ蛋白質ホモログ２（ＭＳＨ２、使用準備、複製Ｇ２１９−１１２９）用抗体があるＶｅｎｔａｎａＸＴシステム（Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｒｏｃｈｅ）、ＩＨＣは、前述したように行った。ＭＬＨ１およびＭＳＨ２の場合、腫瘍細胞で核染色がないものは発現消失であり、正常発現は、腫瘍細胞での核発現の存在として定義された。すべてのＩＨＣ結果は、臨床病理学的特徴に対する知識なしに評価された。
（エプスタイン・バーウイルス−暗号化されたＲＮＡインシチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション（ＥＢＥＲ ＩＳＨ））
ＥＢＥＲ ＩＳＨは、Ｖｅｎｔａｎａ Ｂｅｎｃｈ Ｍａｒｋシステム（ＩＳＨ ｉＶｉｅｗキット、Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＡＺ、米国）で行った。パラフィン包埋された組織切片をＥＺ Ｐｒｅｐバッファー（Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で脱パラフィン化させ、プロテアーゼＩで４分間分解させた。引き続いて、ＥＢＥＲに対するプローブを８５℃で１０分間変性させた後、３７℃で１時間混成化させた。混成化した後、組織を５７℃で２×ＳＳＣバッファーで洗浄した。引き続いて、抗−フルオレシン単クローン抗体とのインキュベーションを２０分間行った後、アルカリブルー検出キット（Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をメーカーのプロトコルによって使用した。スライドを１０分間ニュークリア・ファスト・レッドで対照染色した。
＜実施例１＞進行性胃癌の５個の分類
本発明の実験フローチャートは、図１に示した。本発明者らは、コンセンサス基盤のＮＭＦをベースに５個のＧＣ分子亜型を確認した。本発明者らは、ＧＣ（ＧＳＥ１３８６１ｐトレーニングセットＩ；ＨｕｍａｎＨＴ−１２ ｖ３．０ Ａｒｒａｙ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ））患者で胃の切除手術サンプル（ｎ＝４９７）の遺伝子発現プロファイルを調査した。５個の分子亜型に対するＧＣの分類は、高い一致を示し、ヒートマップは、独特の遺伝子発現様相を示した（図２ａおよび図３）。本発明者らは、マイクロアレイ（ＳＡＭ、ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ（ＦＤＲ）＝０）の有意性分析に引き続いて、マイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ；ｏｖｅｒａｌｌ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ＝０．１０）を使用して９３２個の亜型特異遺伝子を確認した（Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ−ＰＡＭ９３２）。
Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ−ＰＡＭ９３２を使用してＧＣ患者の独立的な遺伝子発現データセット（Ｔｅｓｔ ｓｅｔ Ｉ）で分子亜型化を安定的に確認した。
＜実施例２＞ＧＣ亜型を記述する６個の分子シグネチャー確認
先験的に定義された遺伝子セットの表記法を拡張するために監督されない更なる遺伝子格別のクラスタリングを行った。ＧＳＥ１３８６１ｐでＷＧＣＮＡは、３２個の遺伝子モジュール（高度で相互連結された遺伝子のクラスター）を検出した（図４ａ、ｂ）。全体的に、（ｉ）いくつかのモジュールがコホートで顕著に保存されたという事実が観察された（超幾何分布検定；Ｐ＜０．０１）（図４ｂ）、（ｉｉ）保存されたモジュールは、ＰＡＭｇｅｎｅｓの上位２５％ＰＡＭ分析の相対的な差異による（図４ｃ）、（ｉｉｉ）このような関連性は、ＧＣ生物学と有意な関連があった（図４ｄ）。保存されたモジュールをベースに６個のＧＣシグネチャーは、５個のＧＣ亜型と顕著に関連している。本発明者らは、ＧＣシグネチャーの遺伝子を再抽出してスピアマンの相関関係を使用してＧＣシグネチャーの特定の組合せを５個のＮＭＦ派生亜型に変換することができることを示した（図４ｅ）。５個の亜型に対する本発明者らの注釈は、ネットワーク分析に基づく亜型の特性により生物学的にさらに関連がある。
＜実施例３＞５個のＧＣ亜型の臨床的特性糾明
ＧＣ亜型と臨床病理学的情報（年齢、性別、腫瘍位置、ＡＪＣＣ ｓｔａｇｅ（６ｔｈ）、ＷＨＯ分類、Ｌａｕｒｅｎ ｔｙｐｅ）間の関係を調査した。５個の亜型の生存分析は、亜型と全体生存率の間の有意な相関関係を確認した（Ｐ＝３．４２ｅ−０９、図５）。各亜型の５年生存率を決定した：各分子亜型別の５年生存率は、ＩＮＦの場合、７６．１％（９５％信頼区間６７．７〜８５．７）、ＩＮＴの場合、６５．１％（９５％信頼区間５６．２〜７５．４）、ＧＳＴの場合、６４．６％（９５％信頼区間５５．０〜７５．９）、ＭＸＤの場合、５１．３％（９５％信頼区間４２．１〜６２．４）、ＭＳＣの場合、４６．３％（９５％信頼区間３８．０〜５６．５）である。ＩＮＦ亜型は、トレーニングセットＩのＭＸＤおよびＭＳＣ亜型より有意に低い死亡危険と関連があった。
最後に、前記分類の類似点と差異点をアジア癌研究グループ（ＡＣＲＧ）（ＧＳＥ６２２５４）、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）およびシンガポール研究グループ（ＧＳＥ１５４５９）により報告されたＧＣ亜型と比較した：すなわち、ｉ）最悪の臨床結果を示すＭＳＣ亜型は、ＡＣＲＧ ＥＭＴ亜型、ＴＣＧＡ ＧＳ亜型およびシンガポール研究グループ浸潤性亜型の４個の分類体系で共通した亜型であり、ｉｉ）最上の臨床結果を有するＩＮＦ亜型多くのエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）陽性患者およびＴＣＧＡおよびＡＣＲＧにより確認された部分的なマイクロサテライトの高い不安定性（ＭＳＩ）グループが含まれた。そうではない場合、ＧＳＴおよびＩＮＴ亜型は、シンガポール研究グループで部分的に説明した。ＭＸＤ亜型は、ＴＣＧＡによる構造的染色体不安定性と関連している。ｎｏｎ−ＭＳＣおよびｎｏｎ−ＩＮＦ ＧＣ集団で亜型マッチングは、病理学的に曖昧な傾向があったが、おそらくＴＣＧＡとＡＣＲＧが体細胞コピー数およびＴＰ５３活性の程度を分類器（Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）として使用したからであると認められる。
＜実施例４＞ＩＮＴ亜型と比較してＭＳＣ亜型の前臨床治療反応
モジュール基質分析で、基質特性は、Ｌａｕｒｅｎ分類で再発だけでなく、拡散タイプ（Ｄｉｆｆｕｓｅ ｔｙｐｅ）と有意な関連があった。これは、ＧＣ細胞株を使用してＭＳＣ亜型の間葉および幹細胞類似の行動を検証するように刺激した。さらに、最近の証拠がＥＭＴと関連した薬物耐性の獲得が多様な類型の癌で予後が良くないことを示すので、ＭＳＣ亜型の前臨床治療反応を評価した。ＧＣ細胞株（ｎ＝２６）は、細胞株の遺伝子発現データを患者ＧＣ腫瘍サンプルのデータと併合した後、５個の亜型に分類した（距離加重値識別方法）（図６ａ）。基質モジュールｅｉｇｅｎｇｅｎｅで順位を付けることにより、Ｈｓ７４６ＴおよびＳＮＵ４８４ ＧＣ細胞株をＭＳＣ−亜型細胞株でモデル細胞株として選択した。ＩＮＴ亜型に割り当てられたＮＣＩ−Ｎ８７およびＭＫＮ−４５細胞を基質シグネチャーがない対照群として使用した（図６ｂ）。試験管内浸潤および創傷治癒分析で、Ｈｓ７４６ＴおよびＳＮＵ４８４細胞は、ＮＣＩ−Ｎ８７およびＭＫＮ−４５細胞より浸湿的な性能および運動性を示した（図７ａ、ｂ）。３Ｄスフェロイド形成の分析結果、Ｈｓ７４６ＴおよびＳＮＵ４８４細胞は、幹細胞類似特性を示した（図７ｃ）。生体内同所腫瘍モデルのＴ２加重軸磁気共鳴映像は、ＮＣＩ−Ｎ８７およびＭＫＮ−４５細胞が制限された腫瘍を形成するのに対し、Ｈｓ７４６ＴおよびＳＮＵ４８４腫瘍が胃壁の壁に沿って拡散されることを示した（図７ｅ、白色点線）。また、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞と比較してＨｓ７４６Ｔの基質特性に対するＴＧＦ−β抑制剤（ＬＹ２１５７２９９）の影響を観察した。ＴＧＦ−β抑制剤を使用した治療は、試験館内でＨｓ７４６Ｔ細胞の創傷治癒、侵犯および３Ｄスフェロイド形成能力を遅延させた（図７ｅ〜ｇ）。ＥＭＴ関連薬物耐性を確認するために、Ｈｓ７４６Ｔ細胞を使用して生体内異種移植マウスモデル（群別ｎ＝８）にＴＧＦ−β抑制剤と抗癌剤の組合せ（オキサリプラチン＋５−ＦＵ）を共同投与した。オキサリプラチン＋５−ＦＵ治療がＨｓ７４６Ｔモデルで腫瘍成長に対して単に若干効果的であったが、ＴＧＦ−β抑制剤／オキサリプラチン＋５−ＦＵの併用投与は、Ｈｓ７４６Ｔで薬物耐性と腫瘍の量を有意に減少させた（図７ｈ）。その代わりに、抗癌剤の組合せだけでＴＧＦ−β抑制剤の助けなく、非基質性ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍で腫瘍成長を減少させた（図７ｉ）。
＜実施例５＞臨床適用のためのｑＰＣＲプローブセットとしてＧＣ ｍｉｎｉＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ−２６
Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ−ＰＡＭ９３２をｑＰＣＲプローブセットでｍｉｎｉＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ−２６で精製して、安定的且つ臨床的に活用可能な分類システムを構築した（図８）（図９は、ｍｉｎｉＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ−２６で選定および分析する流れ図を示す）。分類器（Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）選別のために、ＧＣ安定性の代表性の程度を考慮した。本発明者らは、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）シグネチャー、間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）シグネチャー、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）シグネチャー、免疫（ｉｍｍｕｎｅ）シグネチャーおよび腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）シグネチャーの６個のＧＣシグネチャーによりｍｉｎｉＣｌａｓｓｉｆｉｅｒサブセットを分類して、亜型別およびコホート保存型モジュールで候補遺伝子を選別した。候補者は、ｉ）亜型判別点数（ＰＡＭ分析）とｉｉ）モジュール内連結性により追加にフィルタリングされた（ＷＧＣＮＡ分析）。プローブ安定性は、プラットフォーム（マイクロアレイおよびｑＰＣＲ）およびサンプリング方法（新鮮−凍結およびＦＦＰＥ標本）の独立性に基づいて評価された。最後に、癌生物学の先験的生物学的知識により遺伝子を減少させて、ｍｉｎｉＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ−２６ ｑＰＣＲプローブセットを得た。また、選択されたｍｉｎｉＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ−２６プローブセットがＦＦＰＥ標本の可能な空間異質性（分散係数５％）の影響を受けないことを確認した。
トレーニングセットＩＩ（ｎ＝１２５９、新鮮−凍結サンプルで様々なプラットフォームで得たＭｅｒｇｅｄ１２５９）を使用してｍｉｎｉＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ−２６プローブセットを作った（図８）。ｍｉｎｉＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ−２６プローブセットに分類されたＧＣ亜型は、生存分析で高い予後と関連があった（ＬＲテスト、Ｐ＝２．４８ｅ−０９）（図８ｄ）。Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ−ＰＡＭ９３２により分類された亜型と同様に、ＩＮＦ亜型は、最も良い予後（５年生存率６７．３％、９５％ ＣＩ６１．３−７３．９％）、そしてＭＸＤ（５年生存率４５．０％、９５％ ＣＩ３６．５−５５．４％）とＭＳＣ（５年生存率３３．０％、９５％ＣＩ２７．３〜４０．０％）は、最悪の予後を示した。ＧＣ亜型（図８ｄ）の生存曲線の傾向の一貫性は、ｑＰＣＲ３２５テストセットでも確認した（図８ｅ、Ｐ＝０．０００５３４）。最も予後が良いＩＮＦ亜型は、５年生存率が７８．５％（９５％ＣＩ６９．４〜８８．８％）であり、最も予後が良くないＭＸＤ、ＭＳＣ亜型５年生存率は、それぞれ５４．６％（９５％ＣＩ４１．７〜７１．４％）、５７．５％（９５％ＣＩ４８．４〜６８．２％）であった。
前記で確認された胃癌の５個の分子亜型に対して個人および公知のデータセット（ＧＳＥ１３８６１ｐ、ＧＳＥ１５４５９、ＴＣＧＡおよびＳＧＥ６２２５４）で同定した。
図８のように、炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型は、免疫（ｉｍｍｕｎｅ）シグネチャーと関連し、腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）分子亜型は、ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ遺伝子の高発現と関連し、胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型は、ｇａｓｔｒｉｃ ｍｕｃｏｓａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ遺伝子の高発現と関連する。混合型間質（Ｍｉｘｅｄ−ｓｔｒｏｍａｌ）分子亜型は、異質性ｔｒａｎｓｉｔ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ特徴を示し、間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型は、ＥＭＴおよび間葉特性と関連する。
表３は、図８ａの標的遺伝子発現パターンをスコア
で示したものである。表３のスコア
で正数は、遺伝子の高発現、負数は、遺伝子の低発現、０は、遺伝子の発現変化がないことを意味する。したがって、正数の値が大きいほど発現がさらに高くなり、負数の値が大きいほど発現はさらに低くなる。
前記スコア
は、下記の式２に適用してＳＶ（Ｓｃｏｒｅ Ｖａｌｕｅ）を計算し、ＳＶによって腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）分子亜型、炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型、間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型、混合型間質（Ｍｉｘｅｄ−ｓｔｒｏｍａｌ）分子亜型および胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型に分類することができる：
ここで、ＳＶは、ＮＭＦ基盤クラスタリングに得たクラスターで各シグネチャーの発現平均値、ｔは、当該シグネチャーに属する遺伝子（ｉ）の数、
は、シグネチャー（θ＝ ６）、ｋは、クラスターの数であって、２〜７の整数であり、
は、各遺伝子の全体平均と各クラスター平均の間の距離をベースとするスコアである。
図１０は、５個のクラスターを分子亜型で命名する方法を図示すものであり、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）シグネチャーのＳＶが最大値を有するクラスターを胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型に決めて、残りの４個のクラスターのうち間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）シグネチャーのＳＶが最大値を有し、且つ増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）シグネチャーのＳＶが最小値を有するクラスターを間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型に定め、残りの３個のクラスターのうち免疫（ｉｍｍｕｎｅ）シグネチャーのＳＶが最大値を有し、且つ腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）シグネチャーのＳＶが最小値を有するクラスターを炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型に定め、残りの２個のクラスターのうち幹細胞様（ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ）シグネチャーのＳＶが最大値を有する場合、混合型間質（Ｍｉｘｅｄ−ｓｔｒｏｍａｌ）分子亜型に定め、最終的に残ったクラスターを腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）分子亜型に定めて命名する。
表３のスコア
は、当該遺伝子別ｔ−統計値で臨界値に補正し、下記の式３および４により
値を計算して、分子亜型基準を設定することができる：
ここで、各分子亜型（ｋ）内の当該遺伝子（ｉ）平均値
大部分がノイズであり、当該遺伝子（ｉ）の全体平均値
に近くなり得るので、臨界値（Δ）に補正して
値が０に収斂する遺伝子を除外させる。これにより、各分子亜型（ｋ）内遺伝子（ｉ）の信頼できる平均値を計算することができる。前記式３の
を計算するために下記の式４に従う：
ここで、
は、当該遺伝子（ｉ）のｔ−統計値であり、同じ分子亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）内のサンプル遺伝子発現量に加重値を与えて標準化するもので、線形判別分析（ＬＤＡ；Ｌｉｎｅａｒ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ）で頻繁に使用される統計方法である。
は、遺伝子（ｉ）の全体サンプルに対する当該分子亜型（ｋ）内の標準偏差である。ｊは、当該分子亜型（ｋ）内のサンプルであり、
は、
の標準誤差を補正するための自由度であり、
は、
の中央値である。
表３は、分子亜型分類基準表であり、赤色は、最大値、青色は、最小値を意味し、３２５個のサンプルに対して２６個の標的遺伝子のスコア
から式３および４により計算された
を基盤として作成された分子亜型分類基準表である。
テストサンプルの分子亜型を把握しようとするとき、テストサンプルの標的遺伝子群の発現値に対して前記式３と４で計算された値を式５に適用して、表３のスコア
を分子亜型分類基準表としてテストサンプル
の分子亜型（ｋ）を判別することができる：
ここで、テストサンプル
は、２６個の標的遺伝子Ｃｑ値を３２５個のテストセットＩＩの２６個の標的遺伝子Ｃｑ値とメディアンセンタリング（ｍｅｄｉａｎ ｃｅｎｔｅｒｉｎｇ）した値であり、
は、テストサンプル
の分子亜型「ｋ」を判別するスコアであって、テストサンプルの判別スコアが最も小さい値の分子亜型（ｋ）を選択して分類する。表４は、
によって３２５個のサンプルに対する分子亜型決定に一致率およびエラー率である。
本発明は、胃癌予後予測分野に適用することができる。

Claims (12)

  1. ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、ＶＳＩＧ１、ＣＮＮ１、ＮＥＸＮ、ＳＣＲＧ１、ＳＯＲＢＳ１、ＳＰＡＲＣＬ１、ＡＵＲＫＡ、ＢＵＢ１、ＣＤＣ２０、ＣＥＰ５５、ＰＴＴＧ１、ＵＢＥ２Ｃ、ＣＤ８Ａ、ＧＢＰ１、ＧＢＰ５、ＧＺＭＢ、ＮＫＧ７、ＷＡＲＳ、ＡＮＴＸＲ１、ＳＦＲＰ４、ＶＣＡＮ、ＣＤＨ１７、ＣＤＸ１およびＭＹＯ１Ａを含む標的遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定する製剤；および
    ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定する製剤を含み、
    上記標的遺伝子群または参考遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定する製剤は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１〜６２に記載されたプライマーセット；またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：６３〜９３に記載されたプローブを含む胃癌２期および３期の進行性胃癌の予後予測用組成物。
  2. 前記組成物は、全体生存率の側面で胃癌２期および３期の進行性胃癌の予後を予測するものである、請求項１に記載の胃癌２期および３期の進行性胃癌の予後予測用組成物。
  3. 請求項１に記載の胃癌２期および３期の進行性胃癌の予後予測用組成物を含む胃癌２期および３期の進行性胃癌の予後予測用キット。
  4. キットは、ｑＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）キットを含む、請求項３に記載の胃癌２期および３期の進行性胃癌の予後予測用キット。
  5. 統計的有意値を示すことができる程度のサンプル数を有する胃癌２期および３期の進行性胃癌患者から得た基準サンプルと生物学的サンプルで、
    ＴＦＦ１、ＴＦＦ２およびＶＳＩＧ１からなる胃（ｇａｓｔｒｉｃ）シグネチャー；ＣＮＮ１、ＮＥＸＮ、ＳＣＲＧ１、ＳＯＲＢＳ１およびＳＰＡＲＣＬ１からなる間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）シグネチャー；ＡＵＲＫＡ、ＢＵＢ１、ＣＤＣ２０、ＣＥＰ５５、ＰＴＴＧ１およびＵＢＥ２Ｃからなる増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）シグネチャー；ＣＤ８Ａ、ＧＢＰ１、ＧＢＰ５、ＧＺＭＢ、ＮＫＧ７およびＷＡＲＳからなる免疫（ｉｍｍｕｎｅ）シグネチャー；ＡＮＴＸＲ１、ＳＦＲＰ４およびＶＣＡＮからなる幹細胞様（ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ）シグネチャー；およびＣＤＨ１７、ＣＤＸ１およびＭＹＯ１Ａからなる腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）シグネチャーを含む標的遺伝子群と、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子群のｍＲＮＡ発現水準を測定する段階であり、
    上記標的遺伝子群または参考遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定する製剤は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１〜６２に記載されたプライマーセット；またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：６３〜９３に記載されたプローブを含み；
    下記の式１により基準サンプルと生物学的サンプルの標的遺伝子群のΔＣｑ値を計算して、コンピュータプログラムに入力する段階；および
    前記コンピュータプログラムに入力した値に対してＮＭＦ（Ｎｏｎ−ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍａｔｒｉｘ Ｆａｃｔｏｒｉｚａｔｉｏｎ）およびＮＭＦ基盤クラスタリングを行い、複数個のクラスターに分類し、各クラスターで標的遺伝子群のスコア
    を下記の式２に適用してＳＶ（Ｓｃｏｒｅ Ｖａｌｕｅ）を計算し、ＳＶによって腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）分子亜型、炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型、間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型、混合型間質（Ｍｉｘｅｄ−ｓｔｒｏｍａｌ）分子亜型および胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型に分類し、全体生存率（Ｏｖｅｒａｌｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ）の側面で予後を分析して、生物学的サンプルが属する分子亜型の予後を予測する段階を含み、
    前記胃癌の分子亜型は、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）シグネチャーのＳＶが最大値を有するクラスターを胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型に定め；胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型に決定されたクラスターを除いたクラスターのうち間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）シグネチャーのＳＶが最大値を有し、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）シグネチャーのＳＶが最小値を有するクラスターを間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型に定め；胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型および間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型に決定されたクラスターを除いたクラスターのうち免疫（ｉｍｍｕｎｅ）シグネチャーのＳＶが最大値を有し、腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）シグネチャーのＳＶが最小値を有するクラスターを炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型に定め；胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型、間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型および炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型に決定されたクラスターを除いたクラスターのうち幹細胞様（ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ）シグネチャーのＳＶが最大値を有する場合、混合型間質（Ｍｉｘｅｄ−ｓｔｒｏｍａｌ）分子亜型に定め；最終的に残ったクラスターを腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）分子亜型に定めて分類し、
    前記胃癌の分子亜型が炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型である場合、全体生存率の側面で良い予後群；腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）分子亜型および胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型である場合、中間予後群；混合型間質（Ｍｉｘｅｄ−ｓｔｒｏｍａｌ）分子亜型および間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型である場合、悪い予後群として予測する、胃癌２期および３期の予後予測のための情報を提供する方法：
    ここで、参考遺伝子群のＣｑ平均値は、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子群のＣｑ値の平均値を意味する。
    ここで、ＳＶは、ＮＭＦ基盤クラスタリングに得たクラスターで各シグネチャーの発現平均値、ｔは、当該シグネチャーに属する遺伝子（ｉ）の数、
    は、シグネチャー（θ＝ ６）、ｋは、クラスターの数であって、２〜７の整数であり、
    は、各遺伝子の全体平均と各クラスター平均の間の距離をベースとするスコアであり、下記の式３により求める。
    ここで、臨界値（Δ）は、０．１に定めて、子亜型別特異性がない遺伝子は０に収斂させ、
    は、
    の符号を意味し、
    は、下記の式４により求める。
    ここで、各分子亜型（ｋ）内の当該遺伝子（ｉ）平均値
    当該遺伝子（ｉ）の全体平均値
    であり、
    は、
    の標準誤差を補正するための自由度
    であり、
    は、遺伝子（ｉ）の全体サンプルに対する当該分子亜型（ｋ）内の標準偏差であり、
    は、
    の中央値である。
  6. 統計的有意値を示すことができる程度のサンプルの数は、３００〜１０，０００である、請求項５に記載の胃癌２期および３期の予後予測のための情報を提供する方法。
  7. 生物学的サンプルは、新鮮腫瘍組織、新鮮凍結腫瘍組織、パラフィン包埋腫瘍組織、微細針吸引液、腹水、管洗浄液および胸膜液で構成される群から選択される、請求項５に記載の胃癌２期および３期の予後予測のための情報を提供する方法。
  8. 標的遺伝子群または参考遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準測定は、ｑＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）により行われる、請求項５に記載の胃癌２期および３期の予後予測のための情報を提供する方法。
  9. 統計的有意値を示すことができる程度のサンプル数を有する胃癌２期および３期の進行性胃癌患者から得た基準サンプルと生物学的サンプルで、
    ＴＦＦ１、ＴＦＦ２およびＶＳＩＧ１からなる胃（ｇａｓｔｒｉｃ）シグネチャー；ＣＮＮ１、ＮＥＸＮ、ＳＣＲＧ１、ＳＯＲＢＳ１およびＳＰＡＲＣＬ１からなる間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）シグネチャー；ＡＵＲＫＡ、ＢＵＢ１、ＣＤＣ２０、ＣＥＰ５５、ＰＴＴＧ１およびＵＢＥ２Ｃからなる増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）シグネチャー；ＣＤ８Ａ、ＧＢＰ１、ＧＢＰ５、ＧＺＭＢ、ＮＫＧ７およびＷＡＲＳからなる免疫（ｉｍｍｕｎｅ）シグネチャー；ＡＮＴＸＲ１、ＳＦＲＰ４およびＶＣＡＮからなる幹細胞様（ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ）シグネチャー；およびＣＤＨ１７、ＣＤＸ１およびＭＹＯ１Ａからなる腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）シグネチャーを含む標的遺伝子群と、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子群のｍＲＮＡ発現水準を測定する段階であり、
    上記標的遺伝子群または参考遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定する製剤は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１〜６２に記載されたプライマーセット；またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：６３〜９３に記載されたプローブを含み；
    下記の式１により基準サンプルと生物学的サンプルの標的遺伝子群のΔＣｑ値を計算して、コンピュータプログラムに入力する段階；および
    前記コンピュータプログラムに入力した値に対してＮＭＦ（Ｎｏｎ−ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍａｔｒｉｘ Ｆａｃｔｏｒｉｚａｔｉｏｎ）およびＮＭＦ基盤クラスタリングを行い、複数個のクラスターに分類し、各クラスターで標的遺伝子群のスコア
    を下記の式２に適用してＳＶ（Ｓｃｏｒｅ Ｖａｌｕｅ）を計算して、ＳＶによって腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）分子亜型、炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型、間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型、混合型間質（Ｍｉｘｅｄ−ｓｔｒｏｍａｌ）分子亜型および胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型で分類して、全体生存率（Ｏｖｅｒａｌｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ）の側面で予後を分析して生物学的サンプルが属する分子亜型の予後を予測する段階を含み、
    前記胃癌の分子亜型は、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）シグネチャーのＳＶが最大値を有するクラスターを胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型に定め；胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型に決定されたクラスターを除いたクラスターのうち間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）シグネチャーのＳＶが最大値を有し、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）シグネチャーのＳＶが最小値を有するクラスターを間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型に定め；胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型および間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型に決定されたクラスターを除いたクラスターのうち免疫（ｉｍｍｕｎｅ）シグネチャーのＳＶが最大値を有し、腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）シグネチャーのＳＶが最小値を有するクラスターを炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型に定め；胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型、間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型および炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型に決定されたクラスターを除いたクラスターのうち幹細胞様（ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ）シグネチャーのＳＶが最大値を有する場合、混合型間質（Ｍｉｘｅｄ−ｓｔｒｏｍａｌ）分子亜型に定め；最終的に残ったクラスターを腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）分子亜型に定めて分類し、
    前記胃癌の分子亜型が炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子亜型である場合、全体生存率の側面で良い予後群；腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）分子亜型および胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）分子亜型である場合、中間予後群；混合型間質（Ｍｉｘｅｄ−ｓｔｒｏｍａｌ）分子亜型および間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）分子亜型である場合、悪い予後群として予測する、胃癌２期および３期の予後予測方法：
    ここで、参考遺伝子群のＣｑ平均値は、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子群のＣｑ値の平均値を意味する。
    ここで、ＳＶは、ＮＭＦ基盤クラスタリングに得たクラスターで各シグネチャーの発現平均値、ｔは、当該シグネチャーに属する遺伝子（ｉ）の数、
    は、シグネチャー（θ＝ ６）、ｋは、クラスターの数であって、２〜７の整数であり、
    は、各遺伝子の全体平均と各クラスター平均の間の距離をベースとするスコアであり、下記の式３により求める。
    ここで、臨界値（Δ）は、０．１に定めて、分子亜型別の特異性がない遺伝子は、０に収斂させ、
    は、
    の符号を意味し、
    は、下記の式４により求める。
    ここで、各分子亜型（ｋ）内の当該遺伝子（ｉ）平均値
    当該遺伝子（ｉ）の全体平均値
    であり、
    は、
    の標準誤差を補正するための自由度
    であり、
    は、遺伝子（ｉ）の全体サンプルに対する当該分子亜型（ｋ）内の標準偏差であり、
    は、
    の中央値である。
  10. 統計的有意値を示すことができる程度のサンプルの数は、３００〜１０，０００である、請求項９に記載の胃癌２期および３期の予後予測方法。
  11. 生物学的サンプルは、新鮮腫瘍組織、新鮮凍結腫瘍組織、パラフィン包埋腫瘍組織、微細針吸引液、腹水、管洗浄液および胸膜液で構成される群から選択される、請求項９に記載の胃癌２期および３期の予後予測方法。
  12. 標的遺伝子群または参考遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準測定は、ｑＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）により行われる、請求項９に記載の胃癌２期および３期の予後予測方法。
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