CN107400644A - 一种培养基及其在类球红细菌发酵中的应用与一种山梨酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种培养基及其在类球红细菌发酵中的应用与一种山梨酸的制备方法。利用本发明提供的培养基，通过流加山梨醛的方式，发酵类球红细菌，能够将山梨醛转化为山梨酸，转化率可达74.98％～79.94％，在培养液中的浓度可达7.55g/L～8.05g/L。本发明提供的制备方法，安全且不会对环境造成污染，所得山梨酸的产量较大，发酵时间较短。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种培养基及其在类球红细菌发酵中的应用与一种山梨酸的制备方法。
背景技术
山梨酸是一种不饱和脂肪酸，英文名为Sorbic acid，又名2，4－已二烯酸、2－丙烯基丙烯酸。与其他天然的脂肪酸一样，山梨酸在人体内参与新陈代谢过程，并被人体消化和吸收，产生二氧化碳和水。山梨酸对酵母、霉菌、好氧菌、细菌、丝状菌均有抑制作用，还能防止肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门杆菌的生长繁殖。从安全性方面来讲，山梨酸是一种国际公认安全(GRAS)的防腐剂，安全性很高。***粮农组织、世界卫生组织、美国FDA都对其安全性给予了肯定。因此，山梨酸及其盐因被广泛应用于食品、烟草、化妆品领域，作为防腐剂或保鲜剂。
目前山梨酸及其盐的制备主要通过化学方法完成，但化学合成山梨酸的工艺非常复杂、控制难度高并会产生大量的废料，对生态环境造成严重污染。而我国生产企业普遍存在的问题是：合成技术落后、工艺不完善、生产成本高。因此，落后的山梨酸生产工艺已经不能满足日益扩大的山梨酸用量。因此，进一步研究山梨酸的生产方法，提高山梨酸的产量并降低对环境的污染，是亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种培养基及其在类球红细菌发酵中的应用与一种山梨酸的制备方法；本发明提供的培养基适宜类球红细菌的生长，而适宜的发酵条件充分提高了山梨酸的得率。
本发明提供的培养基包括水和：
本发明一些实施例中，培养基包括水和：
本发明一些实施例中，培养基包括水和：
本发明一些实施例中，培养基包括水和：
本发明中，FeCl3、CuSO4、MnSO4、ZnCl2采用水合物或非水合物皆可，在采用水合物时，只要培养液中无机盐的含量与上述培养基配方保持一致即可，其皆在本发明的保护范围之内。
本发明提供的培养基更适合于类球红细菌的培养，实验表明，采用其他培养基对类球红细菌进行培养，菌体生长不佳，影响山梨醛向山梨酸转化。
本发明提供的培养基用于类球红细菌发酵制备山梨酸中的应用。
本发明提供的山梨酸的制备方法为，以山梨醛为底物，以本发明所述的培养基发酵类球红细菌，获得含有山梨酸的发酵液。
本发明采用的类球红细菌为保藏编号为CGMCC1.3368的类球红细菌。
本发明中，所述发酵包括菌体生长步骤和山梨醛转化步骤；
所述菌体生长步骤为：将菌体接种至本发明所述的培养基起，温度为28～35℃，搅拌转速为300～500rpm，通气量为3mL/min，pH为6.8～7.4；培养至菌液的OD600值为9～12.5；
所述山梨醛转化步骤为：向OD600值达到9～12.5的菌液中流加山梨醛，搅拌转速为300～500rpm，30℃，通气量为3～7mL/min，发酵时间为60～84h。
所述菌体指活化的种子液，接种的体积分数为10％～15％；优选为10％、13％或15％。
培养至菌液OD600值为9～12.5需要96～120h。
菌体生长步骤中，维持pH值的方式为流加酸液。具体为流加盐酸溶液，一些实施例中，流加浓度为2M的盐酸溶液。
本发明实施例中，流加山梨醛至培养液中山梨醛的终浓度为10mL/L。
一些实施例中，所述菌体生长步骤为：将菌体接种至本发明所述的培养基起，温度为35℃，搅拌转速为300rpm，通气量为3mL/min，pH为7.0；培养至菌液的OD600值为9～12.5；
所述山梨醛转化步骤为：向OD600值达到9～12.5的菌液中流加山梨醛，搅拌转速为300rpm，30℃，通气量为7mL/min，发酵时间为72h。
一些实施例中，所述菌体生长步骤为：将菌体接种至本发明所述的培养基起，温度为30℃，搅拌转速为500rpm，通气量为3mL/min，pH为6.8；培养至菌液的OD600值为9～12.5；
所述山梨醛转化步骤为：向OD600值达到9～12.5的菌液中流加山梨醛，搅拌转速为400rpm，30℃，通气量为3mL/min，发酵时间为72h。
一些实施例中，所述菌体生长步骤为：将菌体接种至本发明所述的培养基起，温度为35℃，搅拌转速为300rpm，通气量为3mL/min，pH为7；培养至菌液的OD600值为9～12.5；
所述山梨醛转化步骤为：向OD600值达到9～12.5的菌液中流加山梨醛，搅拌转速为500rpm，30℃，通气量为5mL/min，发酵时间为72h。
一些实施例中，所述菌体生长步骤为：将菌体接种至本发明所述的培养基起，温度为28℃，搅拌转速为400rpm，通气量为3mL/min，pH为7.4；培养至菌液的OD600值为9～12.5；
所述山梨醛转化步骤为：向OD600值达到9～12.5的菌液中流加山梨醛，搅拌转速为300rpm，30℃，通气量为7mL/min，发酵时间为72h。
一些实施例中，所述菌体生长步骤为：将菌体接种至本发明所述的培养基起，温度为30℃，搅拌转速为500rpm，通气量为3mL/min，pH为6.8；培养至菌液的OD600值为9～12.5；
所述山梨醛转化步骤为：向OD600值达到9～12.5的菌液中流加山梨醛，搅拌转速为400rpm，30℃，通气量为3mL/min，发酵时间为72h。
一些实施例中，所述菌体生长步骤为：将菌体接种至本发明所述的培养基起，温度为28℃，搅拌转速为400rpm，通气量为3mL/min，pH为7.4；培养至菌液的OD600值为9～12.5；
所述山梨醛转化步骤为：向OD600值达到9～12.5的菌液中流加山梨醛，搅拌转速为500rpm，30℃，通气量为5mL/min，发酵时间为72h。
本发明中，所述发酵前还包括种子活化的步骤，所述种子活化采用的培养基包括：水和蛋白胨15g/L；酵母浸粉5g/L；葡萄糖5g/L。
本发明中，活化的温度为28～35℃，搅拌转速为150～200rpm，时间为24～48h。
具体实施例中，活化分为两步，甘油冻存的菌种接种至活化培养基，30℃摇床150rpm培养48h后，将所得菌液再次接种至活化培养基35℃，转速150rpm，培养时间36小时。再次接种的接种量为1.5％。
本发明提供了一种培养基，利用该培养基，通过流加山梨醛的方式，发酵类球红细菌，能够将山梨醛转化为山梨醇，转化率可达74.98％～79.94％，在培养液中的浓度可达7.55g/L～8.05g/L。本发明提供的制备方法，安全且不会对环境造成污染，所得山梨醇的产量较大，发酵时间较短。
附图说明
图1示实施例1测量山梨酸酸含量的色谱图，其中横坐标为时间，纵坐标为高度；
图2示实施例2测量山梨酸酸含量的色谱图，其中横坐标为时间，纵坐标为高度；
图3示实施例3测量山梨酸酸含量的色谱图，其中横坐标为时间，纵坐标为高度；
图4示实施例4测量山梨酸酸含量的色谱图，其中横坐标为时间，纵坐标为高度；
图5示实施例5测量山梨酸酸含量的色谱图，其中横坐标为时间，纵坐标为高度；
图6示实施例6测量山梨酸酸含量的色谱图，其中横坐标为时间，纵坐标为高度；
图7示对比例1测量山梨酸酸含量的色谱图，其中横坐标为时间，纵坐标为高度；
图8示对比例2测量山梨酸酸含量的色谱图，其中横坐标为时间，纵坐标为高度。
具体实施方式
本发明提供了一种培养基及其在类球红细菌发酵中的应用与一种山梨酸的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
一、预处理
将常规甘油保藏的类球红细菌按1％的接种量接种于装有种子培养基的三角瓶中，置于30℃摇床150rpm培养48h。按重量体积百分比(g/L)计，种子培养基的成分为，蛋白胨15g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖5g/L，余量为水，pH 7.0。
二、种子液
将上述培养所得菌种按照1％的接种量无菌转入装有种子培养基的三角瓶中，置于30℃摇床200rpm培养24h。按重量体积百分比(g/L)计，种子培养基的成分为，蛋白胨15g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖5g/L，余量为水，pH 7.0。
三、生产发酵
1、在10L发酵罐中投入6L发酵培养基，发酵培养基成分：按重量百分比计，蛋白胨：30g/L、酵母浸粉：5g/L、糖蜜7g/L、FeCl3 45mg/L、CuSO4 16mg/L、MnSO4 94mg/L、ZnCl250mg/L、钼酸钠40mg/L，余量为水。
2、将种子液按照10％的接种量接种于发酵罐中；
菌体生长：培养温度为35℃，搅拌速率300rpm，并保持空气3mL/min的持续充入。培养时将pH值维持在7，培养120h，OD600达到11.25。
3、发酵生产：菌体培养120h后，流加山梨醛使其终浓度为10ml/L，30℃，搅拌转数为300rpm，通气量7ml/min，发酵72h，离心收集上清液，高效液相色谱法测量山梨酸含量(样品稀释50倍)，山梨酸含量为7.9g/L(图1)，转化率为78.45％。
实施例2
一、预处理
将常规甘油保藏的类球红细菌按1％的接种量接种于装有种子培养基的三角瓶中，置于30℃摇床150rpm培养48h。按重量体积百分比(g/L)计，种子培养基的成分为，蛋白胨15g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖5g/L，余量为水，pH 7.0。
二、种子液
将上述培养所得菌种按照1％的接种量无菌转入装有种子培养基的三角瓶中，置于30℃摇床200rpm培养24h。按重量体积百分比(g/L)计，种子培养基的成分为，蛋白胨15g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖5g/L，余量为水，pH 7.0。
三、生产发酵
1、在10L发酵罐中投入6L发酵培养基，发酵培养基成分：按重量百分比计，蛋白胨：20g/L、酵母浸粉：25g/L、糖蜜1g/L、FeCl3 27mg/L、CuSO410mg/L、MnSO4 56mg/L、ZnCl230mg/L、钼酸钠24mg/L，余量为水。
2、将种子液按照15％的接种量接种于发酵罐中；
菌体生长：培养温度为30℃，搅拌速率500rpm，并保持空气3mL/min的持续充入。培养时将pH值维持在6.8，培养108h，OD600达到10.35。
3、发酵生产：菌体培养108h后，流加山梨醛使其终浓度为10ml/L，30℃，搅拌转数为400rpm，通气量3ml/min，发酵72h，离心收集上清液，高效液相色谱法测量山梨酸含量(样品稀释50倍)，山梨酸含量为7.8g/L(图2)，转化率为77.46％。
实施例3
一、预处理
将常规甘油保藏的类球红细菌按1％的接种量接种于装有种子培养基的三角瓶中，置于30℃摇床150rpm培养48h。按重量体积百分比(g/L)计，种子培养基的成分为，蛋白胨15g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖5g/L，余量为水，pH 7.0。
二、种子液
将上述培养所得菌种按照1.5％的接种量无菌转入装有种子培养基的三角瓶中，置于35℃摇床150rpm培养36h。按重量体积百分比(g/L)计，种子培养基的成分为，蛋白胨15g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖5g/L，余量为水，pH 7.0。
三、生产发酵
1、在10L发酵罐中投入6L发酵培养基，发酵培养基成分：按重量百分比计，蛋白胨：10g/L、酵母浸粉：12g/L、糖蜜15g/L、FeCl3 9mg/L、CuSO43mg/L、MnSO4 19mg/L、ZnCl2 10mg/L、钼酸钠8mg/L，余量为水。
2、将种子液按照13％的接种量接种于发酵罐中；
菌体生长：培养温度为35℃，搅拌速率300rpm，并保持空气3mL/min的持续充入。培养时将pH值维持在7，培养120h，OD600达到12.13。
3、发酵生产：菌体培养120h后，流加山梨醛使其终浓度为10ml/L，30℃，搅拌转数为500rpm，通气量5ml/min，发酵72h，离心收集上清液，高效液相色谱法测量山梨酸含量(样品稀释50倍)，山梨酸含量为8.05g/L(图3)，转化率为79.94％。经验证，本实施例的转化率显著优于其他各实施例，该效果具有统计学意义，p<0.05。
实施例4
一、预处理
将常规甘油保藏的类球红细菌按1％的接种量接种于装有种子培养基的三角瓶中，置于30℃摇床150rpm培养48h。按重量体积百分比(g/L)计，种子培养基的成分为，蛋白胨15g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖5g/L，余量为水，pH 7.0。
二、种子液
将上述培养所得菌种按照1.5％的接种量无菌转入装有种子培养基的三角瓶中，置于35℃摇床150rpm培养36h。按重量体积百分比(g/L)计，种子培养基的成分为，蛋白胨15g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖5g/L，余量为水，pH 7.0。
三、生产发酵
1、在10L发酵罐中投入6L发酵培养基，发酵培养基成分：按重量百分比计，蛋白胨：20g/L、酵母浸粉：25g/L、糖蜜1g/L、FeCl3 27mg/L、CuSO410mg/L、MnSO4 56mg/L、ZnCl230mg/L、钼酸钠24mg/L，余量为水。
2、将种子液按照15％的接种量接种于发酵罐中；
菌体生长：培养温度为28℃，搅拌速率400rpm，并保持空气3mL/min的持续充入。培养时将pH值维持在7.4，培养96h，OD600达到9.96。
3、发酵生产：菌体培养96h后，流加山梨醛使其终浓度为10ml/L，30℃，搅拌转数为300rpm，通气量7ml/min，发酵72h，离心收集上清液，高效液相色谱法测量山梨酸含量(样品稀释50倍)，山梨酸含量为7.55g/L(图4)，转化率为74.98％。
实施例5
一、预处理
将常规甘油保藏的类球红细菌按1％的接种量接种于装有种子培养基的三角瓶中，置于30℃摇床150rpm培养48h。按重量体积百分比(g/L)计，种子培养基的成分为，蛋白胨15g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖5g/L，余量为水，pH 7.0。
二、种子液
将上述培养所得菌种按照2％的接种量无菌转入装有种子培养基的三角瓶中，置于28℃摇床180rpm培养48h。按重量体积百分比(g/L)计，种子培养基的成分为，蛋白胨15g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖5g/L，余量为水，pH 7.0。
三、生产发酵
1、在10L发酵罐中投入6L发酵培养基，发酵培养基成分：按重量百分比计，蛋白胨：10g/L、酵母浸粉：12g/L、糖蜜15g/L、FeCl3 9mg/L、CuSO43mg/L、MnSO4 19mg/L、ZnCl2 10mg/L、钼酸钠8mg/L，余量为水。
2、将种子液按照13％的接种量接种于发酵罐中；
菌体生长：培养温度为30℃，搅拌速率500rpm，并保持空气3mL/min的持续充入。培养时将pH值维持在6.8，培养108h，OD600达到10.48。
3、发酵生产：菌体培养108h后，流加山梨醛使其终浓度为10ml/L，30℃，搅拌转数为400rpm，通气量3ml/min，发酵72h，离心收集上清液，高效液相色谱法测量山梨酸含量(样品稀释50倍)，山梨酸含量为7.70g/L(图5)，转化率为76.47％。
实施例6
一、预处理
将常规甘油保藏的类球红细菌按1％的接种量接种于装有种子培养基的三角瓶中，置于30℃摇床150rpm培养48h。按重量体积百分比(g/L)计，种子培养基的成分为，蛋白胨15g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖5g/L，余量为水，pH 7.0。
二、种子液
将上述培养所得菌种按照2％的接种量无菌转入装有种子培养基的三角瓶中，置于28℃摇床180rpm培养48h。按重量体积百分比(g/L)计，种子培养基的成分为，蛋白胨15g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖5g/L，余量为水，pH 7.0。
三、生产发酵
1、在10L发酵罐中投入6L发酵培养基，发酵培养基成分：按重量百分比计，蛋白胨：30g/L、酵母浸粉：5g/L、糖蜜7g/L、FeCl3 45mg/L、CuSO4 16mg/L、MnSO4 94mg/L、ZnCl250mg/L、钼酸钠40mg/L，余量为水。
2、将种子液按照10％的接种量接种于发酵罐中；
菌体生长：培养温度为28℃，搅拌速率400rpm，并保持空气3mL/min的持续充入。培养时将pH值维持在7.4，培养96h，OD600达到10.01。
3、发酵生产：菌体培养96h后，流加山梨醛使其终浓度为10ml/L，30℃，搅拌转数为500rpm，通气量5ml/min，发酵72h，离心收集上清液，高效液相色谱法测量山梨酸含量(样品稀释50倍)，山梨酸含量为7.65g/L(图6)，转化率为75.97％。
对比例1
一、预处理
将常规甘油保藏的类球红细菌按1％的接种量接种于装有种子培养基的三角瓶中，置于30℃摇床150rpm培养48h。按重量体积百分比(g/L)计，种子培养基的成分为，蛋白胨15g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖5g/L，余量为水，pH 7.0。
二、种子液
将上述培养所得菌种按照1.5％的接种量无菌转入装有种子培养基的三角瓶中，置于35℃摇床150rpm培养36h。按重量体积百分比(g/L)计，种子培养基的成分为，蛋白胨15g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖5g/L，余量为水，pH 7.0。
三、生产发酵
1、在10L发酵罐中投入6L发酵培养基，发酵培养基成分：按重量百分比计，蛋白胨：10g/L、酵母浸粉：12g/L、蔗糖15g/L、余量为水。
2、将种子液按照13％的接种量接种于发酵罐中；
菌体生长：培养温度为35℃，搅拌速率300rpm，并保持空气3mL/min的持续充入。培养时将pH值维持在7，培养120h，OD600达到8.9。
3、发酵生产：菌体培养120h后，流加山梨醛使其终浓度为10ml/L，30℃，搅拌转数为500rpm，通气量5ml/min，发酵72h，离心收集上清液，高效液相色谱法测量山梨酸含量(样品稀释50倍)，山梨酸含量为4.8g/L(图7)，转化率为47.67％。
对比例2
一、预处理
将常规甘油保藏的类球红细菌按1％的接种量接种于装有种子培养基的三角瓶中，置于30℃摇床150rpm培养48h。按重量体积百分比(g/L)计，种子培养基的成分为，蛋白胨15g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖5g/L，余量为水，pH 7.0。
二、种子液
将上述培养所得菌种按照1.5％的接种量无菌转入装有种子培养基的三角瓶中，置于35℃摇床150rpm培养36h。按重量体积百分比(g/L)计，种子培养基的成分为，蛋白胨15g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖5g/L，余量为水，pH 7.0。
三、生产发酵
1、在10L发酵罐中投入6L发酵培养基，发酵培养基成分：按重量百分比计，蛋白胨：10g/L、酵母浸粉：12g/L、葡萄糖15g/L、FeCl3 9mg/L、CuSO43mg/L、MnSO4 19mg/L、ZnCl210mg/L、钼酸钠8mg/L，余量为水。
2、将种子液按照13％的接种量接种于发酵罐中；
菌体生长：培养温度为35℃，搅拌速率300rpm，并保持空气3mL/min的持续充入。培养时将pH值维持在7，培养120h，OD600达到9.2。
3、发酵生产：菌体培养120h后，流加山梨醛使其终浓度为10ml/L，30℃，搅拌转数为500rpm，通气量5ml/min，发酵72h，离心收集上清液，高效液相色谱法测量山梨酸含量(样品稀释50倍)，山梨酸含量为6.05g/L(图8)，转化率为60.08％。
实施例1～6和对比例1～2的结果表明，实施例1～6提供的方法制备山梨酸，其转化率高于对比例1～2，该效果具有统计学意义，p<0.05。而在各实施例中，实施例3的转化率显著优于其他各实施例，该效果具有统计学意义，p<0.05。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种培养基，其特征在于，包括水和：
2.权利要求1所述的培养基在类球红细菌发酵制备山梨酸中的应用。
3.一种山梨酸的制备方法，其特征在于，以山梨醛为底物，以权利要求1所述的培养基发酵类球红细菌，获得含有山梨酸的发酵液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述类球红细菌为保藏编号为CGMCC1.3368的类球红细菌。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述发酵包括菌体生长步骤和山梨醛转化步骤；
所述菌体生长步骤为：将菌体接种至权利要求1所述的培养基，温度为28～35℃，搅拌转速为300～500rpm，通气量为3mL/min，pH为6.8～7.4；培养至菌液的OD600值为9～12.5；
所述山梨醛转化步骤为：向OD600值达到9～12.5的菌液中流加山梨醛，搅拌转速为300～500rpm，30℃，通气量为3～7mL/min，发酵时间为60～84h。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述流加山梨醛至培养液中山梨醛的终浓度为10mL/L。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述发酵前还包括种子活化的步骤，所述种子活化采用的培养基包括：水和蛋白胨15g/L；酵母浸粉5g/L；葡萄糖5g/L。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述活化的温度为28～35℃，搅拌转速为150～200rpm，时间为24～48h。
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