CN104745545B - 一种高效生产l‑谷氨酸氧化酶的方法 - Google Patents

一种高效生产l‑谷氨酸氧化酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高效生产L‑谷氨酸氧化酶的方法，属于发酵工程和酶工程技术领域。本发明方法中L‑谷氨酸氧化酶重组菌最优诱导条件25‑30℃，乳糖5g/L诱导5h；通过分批补料发酵不同的补料方式研究，发现采用指数补料和DO‑stat相结合的方式有利于菌体密度的增加；通过对分批发酵的诱导条件优化，发现最佳诱导条件为对数期OD600＝40、10g/L乳糖诱导12h，酶活最高达到156.1U/mL；将高表达重组湿菌体添加到含有110g/L的谷氨酸pH8.0的缓冲液中，37℃转化24h可以生产107.9g/L的α‑酮戊二酸，转化率达到90％以上，所需菌液量仅为摇瓶发酵的1/50。

Description

一种高效生产L-谷氨酸氧化酶的方法
技术领域
本发明涉及一种高效生产L-谷氨酸氧化酶的方法，属于发酵工程和酶工程技术领域。
背景技术
α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,简称α-KG)作为一种重要的高值精细化学品(20-25万元/吨)，广泛应用于食品、医药、化工和化妆品等工业领域中。在医药领域中，α-KG能减轻肾病患者的肾脏负担、减少并发症和促进患者手术后快速恢复；与精氨酸等氨基酸复配，能快速帮助运动员补充能量，广泛应用于功能性营养强化剂；除此以外，由于α-KG特殊的化学性质，被广泛用于化学合成行业。随着α-KG应用领域的不断拓展，导致国内和国际市场对α-KG的需求不断增加。从海关了解到的数据，目前国际市场对食品级α-KG需求量缺口达5万吨以上，而目前食品级α-KG市场价格为20-25万元/吨，且面临有价无市的窘境。α-KG的生产方法包括：化学合成法、酶催化法和微生物发酵法。目前，工业化生产α-KG主要采用有机合成法，涉及一系列复杂的化学反应过程，从而引起原料来源、环境污染等方面一系列问题。同时由于化学法合成α-KG过程中存在严重的安全问题，导致α-KG难以直接用于食品、医药和化妆品等领域。因此，如何采用生物技术法大规模制备安全性高的α-KG，是国内外学术界和产业界所关注的焦点问题。
本研究室前期构建完成一株L-谷氨酸氧化酶生产菌株FMME089，并利用酶法生产α-KG能达到较好的效果，但是此酶的获得量相对较少，因此利用高密度手段规模化高效制备L-谷氨酸氧化酶，降低α-KG生产成本，具有很好的工业前景。
发明内容
本发明的目的是利用高密度手段规模化高效制备L-谷氨酸氧化酶。
本发明的第一个目的是提供一种高效表达L-谷氨酸氧化酶的方法。
所述方法是以表达L-谷氨酸氧化酶的重组大肠杆菌为生产菌株，在发酵罐上进行分批补料培养生产L-谷氨酸氧化酶；所述分批补料培养是指在分批发酵过程中，采用DO-stat补料方式进行补料或者采用指数补料和DO-stat两种补料方式相结合的策略进行补料培养。
所述重组大肠杆菌，在本发明的一种实施方式中，为以E.coliBL21，以pET28a表达载体，表达来源于StreptomycesghanaensisATCC14672的L-谷氨酸氧化酶的重组菌。
所述DO-stat补料方式，在本发明的一种实施方式中，是指当发酵过程的DO突然升高时开始补料，控制DO关联补料，每当DO高于设定的参数值时就进行片刻的补料。从而将发酵过程溶氧控制在较低的范围内，比如10-30％。
在本发明的一种实施方式中，所述DO-stat设定的关联参数为20％-30％中的任意一个值。
所述单独使用DO-stat补料的方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：(1)将重组大肠杆菌种子液按照3-6％的接种量接入发酵罐中，控制温度35-40℃，转速300-500rpm，通气量1-3vvm，补料前控制DO在30％以上；(2)补料培养阶段：当DO突然升高时候开始补料，控制DO关联补料，每当DO高于设定的参数值时就进行片刻的补料；(3)诱导培养阶段：当菌体达到对数生长中后期或者稳定期时采用终浓度为5g/L-15g/L-的乳糖进行诱导。
所述指数补料和DO-stat两种补料方式相结合的策略，在本发明的一种实施方式中，是指在分批发酵过程中，当DO突然上升时开始采用比生长速率0.15-0.45h-1进行指数补料，指数补料过程中维持DO不低于20％，当达到发酵罐溶氧限制，补料方式改为DO-stat并控制溶氧不高于设定的参数值，当菌体OD600达到30-60时采用乳糖进行诱导。
所述诱导，在本发明的一种实施方式中，诱导温度为25-30℃。
所述诱导，在本发明的一种实施方式中，诱导时间为8-16h。
所述溶氧限制，就是发酵罐设备所能达到的最大溶氧量。在本发明的一种实施方式中，是指在最高转速800-900rpm、通气量3vvm下能达到的最大溶氧。
所述两种补料方式结合的方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：将重组大肠杆菌种子液按照3-6％的接种量接入发酵罐中，控制温度35-40℃，转速300-500rpm，通气量1-3vvm，补料前控制DO在30％以上；(2)指数补料培养阶段：当DO突然上升时开始采用比生长速率0.15-0.45h-1进行指数补料，指数补料过程中维持DO高于20％；(3)DO-stat补料阶段：当达到发酵罐溶氧限制，补料方式改为DO-stat并控制溶氧不高于设定的参数值；(3)诱导培养阶段：当菌体OD600达到30-60时，采用终浓度为5g/L-15g/L的乳糖进行诱导，诱导温度为25-30℃。
所述DO-stat设定的参数值，在本发明的一种实施方式中，为20％-30％中的任意一个值。
所述两种补料方式结合的方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：以4％的接种量转接到含发酵罐中，初始发酵条件为转速300rpm、温度37℃、通气量1vvm，当DO突然上升是开始采用比生长速率0.25h-1进行补料，补料过程中通过调节转速维持DO高于30％，4h后达到发酵罐溶氧限制，补料方式改为DO-stat并控制溶氧不高于30％，当菌体浓度为OD600＝40时采用终浓度10g/L的乳糖进行诱导，于25-30℃下诱导12h。
所述方法中，对于发酵罐中的发酵培养基，本领域技术人员完全可以根据现有的大肠杆菌培养基，选择适合产酶的培养基或者是进一步对培养基进行优化。
本发明的第二个目的是提供一种按所述方法得到的L-谷氨酸氧化酶或重组大肠杆菌菌体。
本发明的第三个目的是提供L-谷氨酸氧化酶或重组大肠杆菌菌体在转化生产α-酮戊二酸方面的应用。
所述应用，在本发明的一种实施方式中，是以L-谷氨酸或谷氨酸钠为底物，在pH7.0-9.0，温度35-42℃下，转化18-24h，催化生产α-酮戊二酸。
所述底物在本发明的一种实施方式中，其浓度为110-135g/L。
本发明的有益效果：1、应用本发明方法得到的L-谷氨酸氧化酶酶活达35U/mL以上，最高可达156U/mL，实现了L-谷氨酸氧化酶的高效表达；2、发酵得到的发酵液可以直接用于转化生产α-KG，底物转化率可达98.7％且全细胞转化投入的菌液体积仅为摇瓶水平的1/50。
附图说明
图1：乳糖优化条件的优化；
图2：分批发酵发酵曲线；
图3：DO-stat发酵曲线；
图4：指数发酵和DO-stat相结合发酵曲线；
图5：最终确定高密度策略的发酵曲线。
具体实施方式
实施例1乳糖诱导条件优化
以本实验室构建的重组菌FMME089(PanqingNiu,Enzymaticproductionofα-ketoglutaric acidfromL-glutamicacidviaL-glutamateoxidase,JournalofBiotechnology,2014,56-62)为出发菌种，优化乳糖诱导条件。
1)将重组菌株接种于LB培养基中，OD600为0.5-0.6之间时，分别加入1、3、5、7g/L的乳糖37℃诱导4h，比较LGOX的表达量。发现5g/L的乳糖诱导效果最好酶活达到4.53U/mL(图1A)。
2)在最优乳糖诱导浓度的基础上，分别测定诱导后3、4、5、6h的LGOX的表达量。结果显示诱导5h效果最好，酶活达到4.73U/mL(图1B)。
实施例2分批发酵
先将重组菌接种于LB种子培养基上10-12h后，以4％的接种量转接到含有2LLB培养基的5L发酵罐中。初始发酵条件为：转速300rpm，温度37℃，通气量1vvm。当OD600＝0.5-0.7时，采用终浓度5g/L的乳糖进行诱导，测定不同时间点的菌体浓度和酶活表达量，结果显示诱导后4h酶活达到最大值9.43U/mL。
实施例3基于DO-stat的补料分批发酵
发酵罐开始条件和分批发酵相同，在补料前控制DO在30％以上，当DO突然升高时候开始补料，控制DO关联补料，每当DO高于30％时就进行片刻的补料。补料液成分为500g/L的甘油，当菌体浓度不再增长时候采用5g/L的乳糖进行诱导。发酵16h，菌体浓度OD＝47.7，酶活35.55U/mL(图3)。
实施例4指数补料和DO-stat相结合的补料分批发酵
发酵前期条件与分批发酵相同，当DO突然上升是开始采用比生长速率0.25h-1进行补料，补料过程中通过调节转速维持DO高于30％。4h后达到发酵罐溶氧限制，补料方式改为DO-stat，当菌体浓度不再增长时候采用总浓度5g/L的乳糖进行诱导，并时刻监控菌体浓度和酶活。发酵18h可以获得的菌体浓度OD600为92-100，谷氨酸氧化酶酶活达到59U/mL(图4)。因此确定补料策略为指数补料和DO-stat相结合。
实施例5指数补料和DO-stat相结合的补料分批发酵优化
在实施例5的基础上，分别在对数生长期(OD约40)和对数生长后期(OD约60)进行诱导，发酵相同时间发现对数生长期诱导酶活达到97.77U/mL，高于对数生长期后期的73.73U/mL。
在对数生长期诱导的基础上，采用不同浓度的乳糖进行诱导，分别采用5g/L、10g/L、15g/L终浓度的乳糖进行诱导，发现10g/L在相同发酵时间诱导效果高于其他浓度，达到156.1U/mL。因此确定最优的高密度发酵策略，发酵曲线见图5。
实施例6酶的应用
将上述发酵得到的菌体，用于高密度菌体转化生产α-KG。
将发酵液离心8000rpm、5min后去上清获得菌体，用于生物转化反应，底物为110g/L的L-谷氨酸，采用pH7.0的磷酸盐缓冲液，37℃转化24h测定α-KG的产量。分别把高密度产品和摇瓶产品采用相同体积发酵液、相同的细胞量和相同的LGOX酶活用于转化实验。结果如表1所示，可以得出结论：1mL的高密度发酵液完全能够替代50mL摇瓶发酵获得的菌体的转化效果，α-KG产量达到107.9g/L，转化率高达98.7％。
表1 酶的应用效果
实施例7基于诱导前不同的比生长速率设定的优化
在实施例4和实施例5的基础上，通过不同的比生长速率μ设定0.15，0.25，0.35，0.45h-1进行补料，指数补料结束立即进行诱导并改为DO-stat方式进行补料。诱导条件指数生长期，10g/L的乳糖进行诱导，结果显示发酵20h后，μ＝0.35h-1获得最好的LGOX酶活，达到176.3U/mL。
实施例8单独使用DO-stat补料
按以下方法发酵：
(1)将重组大肠杆菌种子液按照3-6％的接种量接入发酵罐中，控制温度35-40℃，转速300-500rpm，通气量1-3vvm，补料前控制DO在30％以上；
(2)补料培养阶段：当DO突然升高时候开始补料，控制DO关联补料，每当DO高于设定的参数(20-30％中的任意值)时就进行片刻的补料；
(3)诱导培养阶段：当菌体达到对数生长中后期或者稳定期时采用终浓度为5g/L-15g/L-的乳糖进行诱导。
根据上述方法发酵得到的LGOX酶活为30-45U/mL。
实施例9指数补料和DO-stat联合补料发酵
按以下方法发酵：
将重组大肠杆菌种子液按照3％的接种量接入发酵罐中，控制温度35℃，转速300-500rpm，通气量1-3vvm，补料前控制DO在30％以上；(2)指数补料培养阶段：当DO突然上升时开始采用比生长速率0.15h-1进行指数补料，指数补料过程中维持DO高于20％；(3)DO-stat补料阶段：当达到发酵罐溶氧限制，补料方式改为DO-stat并控制溶氧不高于20％；(3)诱导培养阶段：当菌体OD600达到30时，采用终浓度为5g/L的乳糖进行诱导，诱导温度为25℃，诱导培养16h。
根据上述方法发酵得到的LGOX酶活为65U/mL，菌体浓度为OD600＝87。
实施例10指数补料和DO-stat联合补料发酵
按以下方法发酵：
将重组大肠杆菌种子液按照6％的接种量接入发酵罐中，控制温度40℃，转速300-500rpm，通气量1-3vvm，补料前控制DO在30％以上；(2)指数补料培养阶段：当DO突然上升时开始采用比生长速率0.45h-1进行指数补料，指数补料过程中维持DO高于30％；(3)DO-stat补料阶段：当达到发酵罐溶氧限制，补料方式改为DO-stat并控制溶氧不高于25％；(3)诱导培养阶段：当菌体OD600达到60时，采用终浓度为15g/L的乳糖进行诱导，诱导温度为30℃，诱导培养8h。
根据上述方法发酵得到的LGOX酶活为135U/mL，菌体浓度为OD600＝109。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (2)

1.一种高效表达L-谷氨酸氧化酶的方法，其特征在于，所述方法是以表达L-谷氨酸氧化酶的重组大肠杆菌为生产菌株，在发酵罐上进行分批补料培养生产L-谷氨酸氧化酶；
所述分批补料培养是指在分批发酵过程中，采用指数补料和DO-stat两种补料方式相结合的策略进行补料培养；
所述指数补料和DO-stat两种补料方式相结合的策略是指在分批发酵过程中，当DO突然上升时开始采用比生长速率0.15-0.45h-1进行指数补料，指数补料过程中维持DO不低于20％，当达到发酵罐溶氧限制，补料方式改为DO-stat并控制溶氧不高于设定的参数值，当菌体OD600达到30-60时采用乳糖进行诱导；所述DO-stat设定的参数值为20％-30％中的任意一个值；
所述方法具体是：(1)将重组大肠杆菌种子液按照3-6％的接种量接入发酵罐中，控制温度35-40℃，转速300-500rpm，通气量1-3vvm，补料前控制DO在30％以上；(2)指数补料培养阶段：当DO突然上升时开始采用比生长速率0.15-0.45h-1进行指数补料，指数补料过程中维持DO高于20％；(3)DO-stat补料阶段：当达到发酵罐溶氧限制，补料方式改为DO-stat并控制溶氧不高于设定的参数值；(4)诱导培养阶段：当菌体OD600达到30-60时，采用终浓度为5g/L-15g/L的乳糖进行诱导；所述DO-stat设定的参数值为20％-30％中的任意一个值；
所述重组大肠杆菌为以E.coli BL21为宿主，以pET28a为表达载体，表达来源于Streptomyces ghanaensis ATCC14672的L-谷氨酸氧化酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：以4％的接种量转接到发酵罐中，初始发酵条件为转速300rpm、温度37℃、通气量1vvm，当DO突然上升时开始采用比生长速率0.25h-1进行补料，补料过程中通过调节转速维持DO高于30％，4h后达到发酵罐溶氧限制，补料方式改为DO-stat并控制溶氧不高于30％，当菌体浓度为OD600＝40时采用终浓度10g/L的乳糖进行诱导，诱导12h。
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