CN107385012A - 一种h2o2偶联的指示***检测唾液酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种H2O2偶联的指示***检测唾液酸的方法，所述的方法其原理基于利用H2O2偶联的指示***，利用神经氨酸苷酶、神经氨酸醛缩酶分解唾液酸生成N‑乙酰甘露糖胺，酮胺氧化酶将N‑乙酰甘露糖胺分解生成H2O2，最后H2O2在过氧化物酶、4‑氨基安替比林和酚的作用下生成醌亚胺色团。与传统方法相比，本方法灵敏度高，稳定性好，值得进一步推广使用。

Description

一种H2O2偶联的指示***检测唾液酸的方法
技术领域
本发明涉及唾液酸的检测技术领域，尤其是涉及一种H2O2偶联的指示***检测唾液酸的方法。
背景技术
唾液酸(Sialic acid，SA)：是9-碳单糖的衍生物。通常以低聚糖，糖脂或者糖蛋白的形式存在。是细胞膜糖蛋白的重要组成部分，与生物体的许多生物学功能有关，且与细胞恶变、癌转移、浸润、失去接触性抑制、细胞粘附性降低以及肿瘤抗原性密切相关。测定血清唾液酸浓度，可作为癌肿诊断辅助性指标和疗效观察指标。
唾液酸明显升高的疾病有：急性白血病、食道癌、贲门癌、胃癌、肠癌、肝癌、肺癌以及卵巢癌等，其中以急性白血病患者为最高。肿瘤患者血清唾液酸增高可能是肿瘤细胞涎糖蛋白合成增加和代谢的改变在血中的反映，可以用于早期发现肿瘤的转移和复发。
目前唾液酸检测技术常用的方法有如下几种：硫代巴比妥酸法、R-试剂法、间苯二酚-过碘酸/盐酸法、HPLC法、薄层层析法、酶法等。硫代巴比妥酸法、R-试剂法、间苯二酚-过碘酸/盐酸法操作繁复，不适用于自动化分析，HPLC法、薄层层析法仪器成本偏高，酶法普遍以NAD+-NADH指示***测定物质的浓度或活性，但NADH稳定性较差，血浆中有许多以NADH为辅酶的脱氢酶，用NADH易产生负反应，存在内源性丙酮酸干扰，因此，一种准确度高，精密度好的唾液酸检测方法，是本领域亟需解决的技术问题。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种H2O2偶联的指示***检测唾液酸的方法，该方法可以排除唾液酸待测样本中维生素C、胆红素等物质的干扰，该检测方法具有准确度高、精密度好的优点。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种H2O2偶联的指示***检测唾液酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：①在待测样品中加入PH＝6.5-7.5、浓度为20～100mmol/L的Tris-HCL缓冲体系，加入0.3～0.8g/L亚铁***为抗干扰剂，并添加酶量为1～5KU/L神经氨酸苷酶，神经氨酸苷酶将待测样本中的结合型唾液酸分解成N-乙酰神经氨酸，其反应方程式为：
②以N-乙酰神经氨酸为底物，添加酶量为1～5KU/L神经氨酸醛缩酶使得N-乙酰神经氨酸被分解生成N-乙酰甘露糖胺，其反应方程式为：
③以N-乙酰甘露糖胺为底物，添加酶量为5～10KU/L酮胺氧化酶将N-乙酰甘露糖胺分解生成H2O2，其反应方程式为：
④在H2O2溶液中添加0.8～1.2g/L四羟基苯甲酸钠与2～5g/L EDTA二钠作为稳定剂，并加入酶量为2～5KU/L过氧化物酶、1-10g/L 4-氨基安替比林和1g/L苯酚，使得H2O2在过氧化物酶、4-氨基安替比林和苯酚的作用下生成醌亚胺色团，其反应方程式为：
⑤将含有醌亚胺色团的液体以及校准品分别置于主波长510nm/副波长660nm段读取吸光度的增加值ΔAT和ΔAS，并根据公式：样品中唾液酸含量(mg/dl)＝ΔAT/ΔAS×校准液浓度，计算出待测样本中的唾液酸含量。
采用上述方案，本发明利用神经氨酸苷酶、神经氨酸醛缩酶分解待测样品中的唾液酸使其生成N-乙酰甘露糖胺，酮胺氧化酶将N-乙酰甘露糖胺分解生成H2O2，最后H2O2在过氧化物酶、4-氨基安替比林和酚的作用下生成醌亚胺色团。将醌亚胺色团和校准品分别置于主波长510nm/副波长660nm下读取各管的吸光度增加值，而吸光度增加的程度与待测样本中的唾液酸含量成正比；本发明利用H2O2偶联的指示***检测唾液酸，该检测方法在提升精密度同时，其反应得到的生色基团具有较好的显色度和溶解度，规避了NADH稳定性较差、产生负反应、存在内源性丙酮酸干扰等问题，其过程中通过添加EDTA二钠，提高H2O2的稳定性，添加亚铁***作为抗干扰剂，排除维生素C，胆红素等物质的干扰，进一步提高了整个检测过程的准确度。
下面结合附图对本发明作进一步描述。
附图说明
附图1为本发明低值的线性相关图；
附图2为本发明中值的线性相关图；
附图3为本发明高值的线性相关图；
附图4为本发明中值与使用NAD+-NADH指示***检测唾液酸方法的市售试剂的线性相关图。
具体实施方式
本发明结合具体实施例说明技术方案，本发明的保护范围不局限于上述具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。
实施例1分别取试剂组分浓度低值，中值，高值进行添加，按照上述本发明采用的技术方案进行操作，其添加的具体浓度如下：
低值：Tris-HCL缓冲液(PH6.5-7.5)20mmol/L，神经氨酸苷酶1KU/L，酮胺氧化酶5KU/L，亚铁***0.3g/L，四羟基苯甲酸钠0.8g/L，神经氨酸醛缩酶1KU/L，过氧化物酶2KU/L，EDTA二钠2g/L，4-氨基安替比林1g/L，苯酚1g/L，所用溶剂为纯化水。(以下简称低值)。
中值：Tris-HCL缓冲液(PH6.5-7.5)60mmol/L，神经氨酸苷酶3KU/L，酮胺氧化酶8KU/L，亚铁***0.5g/L，四羟基苯甲酸钠1.0g/L，神经氨酸醛缩酶3KU/L，过氧化物酶3KU/L，EDTA二钠3g/L，4-氨基安替比林5g/L，苯酚1g/L，所用溶剂为纯化水。(以下简称中值)。
高值：Tris-HCL缓冲液(PH6.5-7.5)100mmol/L，神经氨酸苷酶5KU/L，酮胺氧化酶10KU/L，亚铁***0.8g/L，四羟基苯甲酸钠1.2g/L，神经氨酸醛缩酶5KU/L，过氧化物酶5KU/L，EDTA二钠5g/L，4-氨基安替比林10g/L，苯酚1g/L，所用溶剂为纯化水。(以下简称高值)。
精密度测定：用试剂组分浓度低值，中值，高值按照上述本发明采用的技术方案进行操作，分别对同一样品连续抽取20次进行测定，计算测定值的均数、标准差和变异系数，
表1精密度检测结果
变异系数CV通常用于衡量一项测定方法的精密度，CV值越小，表示该测定方法的结果精密度越好。对于临床化学检验项目而言，CV小于5％的方法精密度公认是可以接受的。表1中CV值均小于3％，表明本发明具有优良的精密度。
线性测定：用试剂组分浓度低值，中值，高值按照上述本发明采用的技术方案进行操作，分别做线性测定。使用去离子水将试剂稀释成5个梯度浓度，每个梯度浓度检测3次，取平均值，对测定值与预期值作回归分析，计算r值和相对偏差(结果见图1、图2、图3，单位mg/dl)。
表2低值线性相关检测结果
稀释浓度 30.00 50.00 100.00 150.00 200.00
测定值 29.89 49.72 103.40 141.38 201.93
27.81 50.45 101.71 140.50 205.91
25.93 52.31 98.06 142.61 209.18
均值 28 51 101 141 206
绝对偏差 0.48 2.20 1.75 8.49 5.01
相对偏差 1.68％ -4.53％ -1.77％ 5.66％ -2.50％
通过表2得到相关系数：r2＝0.9948，线性方程为：y＝1.0136x-2.0530，结果表明低值相关性良好。
表3中值线性相关检测结果
通过表3得到相关系数：r2＝0.9968，线性方程为：y＝0.9634x+3.0406，结果表明中值相关性良好。
表4高值线性相关检测结果
稀释浓度 30.00 50.00 100.00 150.00 200.00
测定值 29.37 47.14 106.70 150.02 199.81
29.72 47.40 109.15 151.81 192.16
28.38 48.27 111.24 158.62 195.38
均值 29 48 109 153 196
绝对偏差 2.24 3.69 7.99 2.69 4.76
相对偏差 7.12％ 7.19％ -7.91％ -1.79％ 2.37％
通过表4得到相关系数：r2＝0.9942，线性方程为：y＝0.9950x+1.5424，结果表明高值相关性良好。
实施例2本发明与使用NAD+-NADH指示***检测唾液酸方法的相关性研究对照的使用NAD+-NADH指示***检测唾液酸方法的市售试剂，其信息如下：
产品名称：唾液酸测定试剂盒【永和阳光(湖南)生物科技有限公司】
方法：酶法
剂型：液体双试剂(3：1)
试剂成份：
试剂1：
Tris-HCl 100mmol/L pH 7.0
神经氨酸苷酶 0.2KU/L
乳酸脱氢酶(LDH) 2KU/L
试剂2：
烟酰腺嘌呤二核苷酸(NADH) 0.13mmol/L
N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NANA-醛缩酶) 2KU/L
分析方法：
计算：
检测仪器：AU480
线性相关测定：使用试剂组分的浓度为中值，按照上述本发明采用的技术方案进行操作，市售试剂按其说明书进行操作，采用AU480全自动生化分析仪，分别对50份样本(包含正常和异常样本)，按各自参数进行测定，并对测定值进行相关分析(结果见图4，X轴表示的是本发明中值的测定值，Y轴表示的是市售试剂的测定值)。相关系数：r2＝0.9930，线性方程为：y＝1.005x+1.060，结果表明本发明中值与使用NAD+-NADH指示***检测唾液酸方法的市售试剂相关性良好。
表5线性相关检测结果
精密度测定：使用试剂组分的浓度为中值，按照上述本发明采用的技术方案进行操作，市售试剂按其说明书进行操作，分别对同一样品中连续抽取20次进行测定，计算测定值的均数、标准差和变异系数，
表6精密度检测结果
变异系数CV通常用于衡量一项测定方法的精密度，CV值越小，表示该测定方法的结果精密度越好。对于临床化学检验项目而言，CV小于5％的方法精密度公认是可以接受的。表6中本发明中值的CV为2.90％，相较使用NAD+-NADH指示***检测唾液酸方法的市售试剂具有更好的精密度。
准确度测定：使用试剂组分的浓度为中值，按照上述本发明采用的技术方案进行操作，市售试剂按其说明书进行操作，分别用同一质控品，重复测定3次，取平均值，与质控品靶值相对偏差应在±15％范围内。
表7准确度检测结果
表7中本发明中值所测得的相对偏差为4.49％，相较使用NAD+-NADH指示***检测唾液酸方法的市售试剂具有更好的准确度。
特异性测定：进行干扰实验测定，分别取5份质控，其中一份做为对照，其他四份分别加入4种潜在干扰物：胆红素、维生素C、血红蛋白和乳酸，分别用本发明中值与市售试剂进行操作测定，结果如表8，表9所示：
表8本发明中值特异性检测结果
模拟干扰物 加入浓度 对照组测定值 本发明测定值 准确(CB％)
胆红素 50mg/dl 50mg/dl 51.56mg/dl 3.12％
维生素C 4g/L 50mg/dl 51.01mg/dl 2.02％
血红蛋白 500mg/dl 50mg/dl 52.41mg/dl 4.82％
乳酸 450mg/dl 50mg/dl 48.77mg/dl -2.46％
表9市售试剂特异性检测结果
模拟干扰物 加入浓度 对照组测定值 市售试剂测定值 准确(CB％)
胆红素 50mg/dl 50mg/dl 53.21mg/dl 6.42％
维生素C 4g/L 50mg/dl 48.55mg/dl -2.90％
血红蛋白 500mg/dl 50mg/dl 54.23mg/dl 8.46％
乳酸 450mg/dl 50mg/dl 48.12mg/dl -3.76％
对于临床化学检验项目而言，CB％在±5％之间公认是可以接受的。表8，表9中本发明中值所测得的CB％处在±5％之间公认是可以接受的，相对使用NAD+-NADH指示***检测唾液酸方法的市售试剂具有更好的特异性。

Claims (1)

1.一种H2O2偶联的指示***检测唾液酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：①在待测样品中加入PH＝6.5-7.5、浓度为20～100mmol/L的Tris-HCL缓冲体系，加入0.3～0.8g/L亚铁***为抗干扰剂，并添加酶量为1～5KU/L神经氨酸苷酶，神经氨酸苷酶将待测样本中的结合型唾液酸分解成N-乙酰神经氨酸，其反应方程式为：
②以N-乙酰神经氨酸为底物，添加酶量为1～5KU/L神经氨酸醛缩酶使得N-乙酰神经氨酸被分解生成N-乙酰甘露糖胺，其反应方程式为：
③以N-乙酰甘露糖胺为底物，添加酶量为5～10KU/L酮胺氧化酶将N-乙酰甘露糖胺分解生成H2O2，其反应方程式为：
④在H2O2溶液中添加0.8～1.2g/L四羟基苯甲酸钠与2～5g/L EDTA二钠作为稳定剂，并加入酶量为2～5KU/L过氧化物酶、1-10g/L 4-氨基安替比林和1g/L苯酚，使得H2O2在过氧化物酶、4-氨基安替比林和苯酚的作用下生成醌亚胺色团，其反应方程式为：
⑤将含有醌亚胺色团的液体以及校准品分别置于主波长510nm/副波长660nm段读取吸光度的增加值ΔAT和ΔAS，并根据公式：样品中唾液酸含量(mg/dl)＝ΔAT/ΔAS×校准液浓度，计算出待测样本中的唾液酸含量。
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