CN110346316A - 偶联丙酮酸氧化酶测定唾液酸（sia）的方法及测定试剂盒 - Google Patents
偶联丙酮酸氧化酶测定唾液酸（sia）的方法及测定试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明是用神经氨酸苷酶和神经氨酸醛缩酶，偶联丙酮酸氧化酶，测定唾液酸的方法。原理是：用神经氨酸苷酶分解唾液酸，生成N‑乙酰神经氨酸，N‑乙酰神经氨酸在神经氨酸醛缩酶的催化下生成丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸氧化酶的催化下生成过氧化氢，再进行Trinder反应显色。本发明同时还可以做成唾液酸测定试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及唾液酸的检测技术和唾液酸检测试剂盒，属于医学体外诊断试剂领域。
背景技术
唾液酸(N-乙酰神经氨酸)是9碳单糖的衍生物，主要分布于哺乳动物体内，最初发现于颌下腺粘蛋白，特别是血管内皮细胞含量最丰富。血清中的唾液酸是总唾液酸，含量在1.5～2.5mmol/L，包括游离唾液酸和结合唾液酸，与糖蛋白和脂蛋白结合的称结合型唾液酸，是血清唾液酸的主要成份，与细胞的识别、分化，以及粘附有关，参与受体组成，并诱导细胞增殖、调亡。
唾液酸是细胞膜蛋白主要成份，有很多生物学功能，特别是在多数情况下与恶性肿瘤有关，在发生腺癌时，细胞恶变、浸润、转移、肿瘤抗原的生成，都能产生大量的唾液酸，并释放到血液中，可作为肿瘤诊断的辅助性指标和疗效观察指标。可用于早期发现肿瘤的转移和复发。
检测血清唾液酸的方法很多，一般都是检测总唾液酸，这里就不多叙述。目前最常用的方法是酶紫外检测法，原理如下：
在波长340nm下检测吸光度的下降速率，来计算出唾液酸的含量。该方法特异性高，操作简便快捷，但是存在三个缺点：一是灵敏不高，由于唾液酸含量很低，该方法在检测低值血清时重复性差，变异系数比较大；二是用还原性辅酶Ⅰ作为显色剂，易氧化，试剂的稳定性较差，三是受样本中丙酮酸的干扰明显。
另外，也有人使用了Trinder反应，原理如下：
该方法试剂稳定，灵敏度高，也不受样本中丙酮酸的干扰，特别是检测低值时重复性好，做室内、室间质评时很重要。但是酮胺氧化酶的特异性较差，样本中的有些氨基酸也和酮氨氧化酶反应，而且酮胺氧化酶比较贵，增加了试剂的成本。
发明内容
本发明采用的是灵敏度高的Trinder反应，检测反应过程中产生的丙酮酸，克服了以上的不足，增加了试剂的稳定性，提高了检测低值的灵敏度，重复性好，变异系数小。特别是把丙酮酸氧化酶放在试剂一中，先氧化掉样本中原有的丙酮酸，排除了干扰。反应原理如下：
试剂一的反应：
以清除样品中原有的丙酮酸。
加入试剂二后的反应：
试剂配方结构
试剂一：
试剂二：
按试剂的组成，可配成试剂一∶试剂二＝1∶1～4︰1不同的浓度比，优选试剂一∶试剂二＝2∶1～4︰1。样品∶试剂＝1∶20～1∶80，优选为1︰50。
缓冲液为甘氨酸盐、磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷、2-吗啉乙磺酸、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、4-羟乙基哌嗪丙磺酸等中的一种或两种。优选用磷酸盐和三羟甲基氨基甲烷，用量为20～120mmol/L。试剂一、试剂二的缓冲液pH均为6.0～8.0。
防腐剂为叠氮化钠、ProClin-300、对羟基苯甲酸及酯类等中的一种或多种，但是，以叠氮化钠为优选，对反应体系没有什么影响，价格也低，用量范围在0.2～10mmol/L。
稳定剂为小牛血清蛋白，氨基酸类，糖类，多元醇类等，可以单用，也可以两种或多种以上联用，首选小牛血清蛋白。黄素腺嘌呤二核苷酸，糖类可选用甘露醇，海藻糖，多元醇可选用乙二醇，PEG6000等。
所述表面活性剂为吐温类、聚乙二醇醚类或聚氧乙烯醚类非离子表面活性剂，优选TritonX-100。
反应体系中可适当加入表面活性剂，能加速反应，增加酶的稳定性，包括吐温类，聚氧乙烯醚类等非离子表面活性剂，特别优选的是聚氧乙烯醚类。
酶激活剂为Ca2+或Mg2+。用量在0.05～10mmol/L，
显色剂为4-氨基安替比林，苯酚类、苯胺类。苯酚类包括：苯酚、2，4-二氯酚、4-氯酚、对羟基苯甲酸、三溴羟基苯甲酸、3、5-二氯-2-羟基苯磺酸钠等，检测波长在500～520nm；苯胺类包括：N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐、N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐等等，很多，就不多叙述了。检测波长在540～600nm之间，灵敏度比苯酚类的高，因此，优选使用苯胺类显色剂，是目前生化检测试剂中常用的。使用不同的显色剂就有相对应的波长。
附图说明
图1为本发明检测试剂盒检测结果线性图；
图2为本发明检测试剂盒与外购唾液酸测定试剂盒检测试验对比图。
具体实施方式
实施例一
试剂一：
试剂二：
TOOS：N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺
试剂一︰试剂二为2︰1,速率法，正反应，波长：546nm，被测样品︰试剂一︰试剂二为6.0︰180︰90，温度37℃，血清与试剂一反应5分钟，加入试剂二，延迟1分钟，检测2分钟的吸光度变化率。
实施例二
试剂一
试剂二：
试剂一︰试剂二为3︰1,速率法，正反应，波长：510nm，被测样品︰试剂一︰试剂二为6.0︰210︰70，温度37℃，血清与试剂一反应5分钟，加入试剂二，延迟1分钟，检测2分钟的吸光度变化率。
实施例三
试剂一：
试剂二：
ADPS：N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐。
试剂一︰试剂二为4︰1,速率法，正反应，波长：546nm，被测样品︰试剂一︰试剂二为7︰240︰60，温度37℃，血清与试剂一反应5分钟，加入试剂二，延迟1分钟，检测2分钟的吸光度变化率。
以实施例三为例，检测数据如下：
检测试剂盒线性结果为
| 理论值mmol/L | 0.000 | 0.625 | 1.250 | 1.875 | 2.500 | 3.125 | 3.750 | 4.375 | 5.000 |
| 实测值mmol/L | 0.013 | 0.632 | 1.256 | 1.881 | 2.515 | 3.129 | 3.682 | 4.268 | 4.706 |
线性方程：y＝0.955x+0.066，R2＝0.998。见说明书附图1。
检测外购质控品(1.68～2.10～2.52mmol/L)，重复检测20次，结果如下：
SD＝0.0465，CV＝2.247％。
用该检测试剂盒(Trinder法)与外购唾液酸测定试剂盒(紫外法)检测50份临床血清做对比试验，对比试验结果如下：
50例临床样本的对比试验
两种方法所得的结果相关性良好，r2＝0.996。见说明书附图2。
稳定性检测：检测外购质控品(1.68～2.10～2.52mmol/L)，每月标准品、质控品重新复溶，试剂重新开瓶进行检测一次，每次重复检测10次，求均值，共13个月。结果如下：
质控品定值为：1.68～2.10～2.52mmol/L，根据国家规定，企业制定的试剂有效期为12个月，应在超过有效期一个月内仍稳定，才符合要求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种测定唾液酸的方法，步骤如下：
1)、试剂一的反应：
以清除样品中原有的丙酮酸；
2)、加入试剂二后，试剂二中的神经氨酸苷酶开始反应，氧化显色剂生成红色的醌亚胺，在特定波长下检测，来计算唾液酸的含量；
3)、检测最终反应物在波长500～600nm吸光度，测算出唾液酸的含量。
2.根据权利要求1所述测定唾液酸的方法，其特征在于：被测样品与试剂的比例控制在1∶20至1∶80。
3.一种唾液酸检测试剂盒，其特征在于：包括试剂一和试剂二；
试剂一：
试剂二：
所述试剂一与试剂二的比为1/1到8/1。
4.根据权利要求3所述唾液酸检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液为磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷、2-吗啉乙磺酸、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、4-羟乙基哌嗪丙磺酸中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述唾液酸检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液pH为6.5～8.5。
6.根据权利要求3所述唾液酸检测试剂盒，其特征在于：所述防腐剂为叠氮化钠、ProClin-300、对羟基苯甲酸及酯类中的一种或多种。
7.根据权利要求3所述唾液酸检测试剂盒，其特征在于：所述稳定剂为小牛血清白蛋白，氨基酸，糖类衍生物、多元醇、黄素腺嘌呤二核苷酸中的一种或多种。
8.根据权利要求3所述唾液酸检测试剂盒，其特征在于：所述表面活性剂为吐温类、聚乙二醇醚类或聚氧乙烯醚类非离子表面活性剂。
9.根据权利要求3所述唾液酸检测试剂盒，其特征在于：所述酶激活剂为Ca2+或Mg2+。
10.根据权利要求3所述唾液酸检测试剂盒，其特征在于：所述显色剂为4-氨基安替比林，苯酚类、苯胺类。
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