CN110346316A - 偶联丙酮酸氧化酶测定唾液酸(sia)的方法及测定试剂盒 - Google Patents
偶联丙酮酸氧化酶测定唾液酸(sia)的方法及测定试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明是用神经氨酸苷酶和神经氨酸醛缩酶,偶联丙酮酸氧化酶,测定唾液酸的方法。原理是:用神经氨酸苷酶分解唾液酸,生成N‑乙酰神经氨酸,N‑乙酰神经氨酸在神经氨酸醛缩酶的催化下生成丙酮酸,丙酮酸在丙酮酸氧化酶的催化下生成过氧化氢,再进行Trinder反应显色。本发明同时还可以做成唾液酸测定试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及唾液酸的检测技术和唾液酸检测试剂盒,属于医学体外诊断试剂领域。
背景技术
唾液酸(N-乙酰神经氨酸)是9碳单糖的衍生物,主要分布于哺乳动物体内,最初发现于颌下腺粘蛋白,特别是血管内皮细胞含量最丰富。血清中的唾液酸是总唾液酸,含量在1.5~2.5mmol/L,包括游离唾液酸和结合唾液酸,与糖蛋白和脂蛋白结合的称结合型唾液酸,是血清唾液酸的主要成份,与细胞的识别、分化,以及粘附有关,参与受体组成,并诱导细胞增殖、调亡。
唾液酸是细胞膜蛋白主要成份,有很多生物学功能,特别是在多数情况下与恶性肿瘤有关,在发生腺癌时,细胞恶变、浸润、转移、肿瘤抗原的生成,都能产生大量的唾液酸,并释放到血液中,可作为肿瘤诊断的辅助性指标和疗效观察指标。可用于早期发现肿瘤的转移和复发。
检测血清唾液酸的方法很多,一般都是检测总唾液酸,这里就不多叙述。目前最常用的方法是酶紫外检测法,原理如下:
在波长340nm下检测吸光度的下降速率,来计算出唾液酸的含量。该方法特异性高,操作简便快捷,但是存在三个缺点:一是灵敏不高,由于唾液酸含量很低,该方法在检测低值血清时重复性差,变异系数比较大;二是用还原性辅酶Ⅰ作为显色剂,易氧化,试剂的稳定性较差,三是受样本中丙酮酸的干扰明显。
另外,也有人使用了Trinder反应,原理如下:
该方法试剂稳定,灵敏度高,也不受样本中丙酮酸的干扰,特别是检测低值时重复性好,做室内、室间质评时很重要。但是酮胺氧化酶的特异性较差,样本中的有些氨基酸也和酮氨氧化酶反应,而且酮胺氧化酶比较贵,增加了试剂的成本。
发明内容
本发明采用的是灵敏度高的Trinder反应,检测反应过程中产生的丙酮酸,克服了以上的不足,增加了试剂的稳定性,提高了检测低值的灵敏度,重复性好,变异系数小。特别是把丙酮酸氧化酶放在试剂一中,先氧化掉样本中原有的丙酮酸,排除了干扰。反应原理如下:
试剂一的反应:
以清除样品中原有的丙酮酸。
加入试剂二后的反应:
试剂配方结构
试剂一:
试剂二:
按试剂的组成,可配成试剂一∶试剂二=1∶1~4︰1不同的浓度比,优选试剂一∶试剂二=2∶1~4︰1。样品∶试剂=1∶20~1∶80,优选为1︰50。
缓冲液为甘氨酸盐、磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷、2-吗啉乙磺酸、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、4-羟乙基哌嗪丙磺酸等中的一种或两种。优选用磷酸盐和三羟甲基氨基甲烷,用量为20~120mmol/L。试剂一、试剂二的缓冲液pH均为6.0~8.0。
防腐剂为叠氮化钠、ProClin-300、对羟基苯甲酸及酯类等中的一种或多种,但是,以叠氮化钠为优选,对反应体系没有什么影响,价格也低,用量范围在0.2~10mmol/L。
稳定剂为小牛血清蛋白,氨基酸类,糖类,多元醇类等,可以单用,也可以两种或多种以上联用,首选小牛血清蛋白。黄素腺嘌呤二核苷酸,糖类可选用甘露醇,海藻糖,多元醇可选用乙二醇,PEG6000等。
所述表面活性剂为吐温类、聚乙二醇醚类或聚氧乙烯醚类非离子表面活性剂,优选TritonX-100。
反应体系中可适当加入表面活性剂,能加速反应,增加酶的稳定性,包括吐温类,聚氧乙烯醚类等非离子表面活性剂,特别优选的是聚氧乙烯醚类。
酶激活剂为Ca2+或Mg2+。用量在0.05~10mmol/L,
显色剂为4-氨基安替比林,苯酚类、苯胺类。苯酚类包括:苯酚、2,4-二氯酚、4-氯酚、对羟基苯甲酸、三溴羟基苯甲酸、3、5-二氯-2-羟基苯磺酸钠等,检测波长在500~520nm;苯胺类包括:N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐、N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐等等,很多,就不多叙述了。检测波长在540~600nm之间,灵敏度比苯酚类的高,因此,优选使用苯胺类显色剂,是目前生化检测试剂中常用的。使用不同的显色剂就有相对应的波长。
附图说明
图1为本发明检测试剂盒检测结果线性图;
图2为本发明检测试剂盒与外购唾液酸测定试剂盒检测试验对比图。
具体实施方式
实施例一
试剂一:
试剂二:
TOOS:N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺
试剂一︰试剂二为2︰1,速率法,正反应,波长:546nm,被测样品︰试剂一︰试剂二为6.0︰180︰90,温度37℃,血清与试剂一反应5分钟,加入试剂二,延迟1分钟,检测2分钟的吸光度变化率。
实施例二
试剂一
试剂二:
试剂一︰试剂二为3︰1,速率法,正反应,波长:510nm,被测样品︰试剂一︰试剂二为6.0︰210︰70,温度37℃,血清与试剂一反应5分钟,加入试剂二,延迟1分钟,检测2分钟的吸光度变化率。
实施例三
试剂一:
试剂二:
ADPS:N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐。
试剂一︰试剂二为4︰1,速率法,正反应,波长:546nm,被测样品︰试剂一︰试剂二为7︰240︰60,温度37℃,血清与试剂一反应5分钟,加入试剂二,延迟1分钟,检测2分钟的吸光度变化率。
以实施例三为例,检测数据如下:
检测试剂盒线性结果为
理论值mmol/L | 0.000 | 0.625 | 1.250 | 1.875 | 2.500 | 3.125 | 3.750 | 4.375 | 5.000 |
实测值mmol/L | 0.013 | 0.632 | 1.256 | 1.881 | 2.515 | 3.129 | 3.682 | 4.268 | 4.706 |
线性方程:y=0.955x+0.066,R2=0.998。见说明书附图1。
检测外购质控品(1.68~2.10~2.52mmol/L),重复检测20次,结果如下:
SD=0.0465,CV=2.247%。
用该检测试剂盒(Trinder法)与外购唾液酸测定试剂盒(紫外法)检测50份临床血清做对比试验,对比试验结果如下:
50例临床样本的对比试验
两种方法所得的结果相关性良好,r2=0.996。见说明书附图2。
稳定性检测:检测外购质控品(1.68~2.10~2.52mmol/L),每月标准品、质控品重新复溶,试剂重新开瓶进行检测一次,每次重复检测10次,求均值,共13个月。结果如下:
质控品定值为:1.68~2.10~2.52mmol/L,根据国家规定,企业制定的试剂有效期为12个月,应在超过有效期一个月内仍稳定,才符合要求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例,凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种测定唾液酸的方法,步骤如下:
1)、试剂一的反应:
以清除样品中原有的丙酮酸;
2)、加入试剂二后,试剂二中的神经氨酸苷酶开始反应,氧化显色剂生成红色的醌亚胺,在特定波长下检测,来计算唾液酸的含量;
3)、检测最终反应物在波长500~600nm吸光度,测算出唾液酸的含量。
2.根据权利要求1所述测定唾液酸的方法,其特征在于:被测样品与试剂的比例控制在1∶20至1∶80。
3.一种唾液酸检测试剂盒,其特征在于:包括试剂一和试剂二;
试剂一:
试剂二:
所述试剂一与试剂二的比为1/1到8/1。
4.根据权利要求3所述唾液酸检测试剂盒,其特征在于:所述缓冲液为磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷、2-吗啉乙磺酸、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、4-羟乙基哌嗪丙磺酸中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述唾液酸检测试剂盒,其特征在于:所述缓冲液pH为6.5~8.5。
6.根据权利要求3所述唾液酸检测试剂盒,其特征在于:所述防腐剂为叠氮化钠、ProClin-300、对羟基苯甲酸及酯类中的一种或多种。
7.根据权利要求3所述唾液酸检测试剂盒,其特征在于:所述稳定剂为小牛血清白蛋白,氨基酸,糖类衍生物、多元醇、黄素腺嘌呤二核苷酸中的一种或多种。
8.根据权利要求3所述唾液酸检测试剂盒,其特征在于:所述表面活性剂为吐温类、聚乙二醇醚类或聚氧乙烯醚类非离子表面活性剂。
9.根据权利要求3所述唾液酸检测试剂盒,其特征在于:所述酶激活剂为Ca2+或Mg2+。
10.根据权利要求3所述唾液酸检测试剂盒,其特征在于:所述显色剂为4-氨基安替比林,苯酚类、苯胺类。
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