CN107384963A - 一种可控型cd20嵌合抗原受体修饰t细胞的制备方法及其应用 - Google Patents

一种可控型cd20嵌合抗原受体修饰t细胞的制备方法及其应用 Download PDF

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CN107384963A CN201710635839.6A CN201710635839A CN107384963A CN 107384963 A CN107384963 A CN 107384963A CN 201710635839 A CN201710635839 A CN 201710635839A CN 107384963 A CN107384963 A CN 107384963A
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    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Abstract

本发明公开了一种可控型抗CD20嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法及其应用，合成Leader‑CD20‑CD8‑4‑1BB‑CD3ζ‑T2A‑HSV‑TK的基因片段，将Leader‑CD20‑CD8‑4‑1BB‑CD3ζ‑T2A‑HSV‑TK基因片段***到pLent‑C‑GFP载体，包装成携带有重组pLent‑C‑GFP‑CD20的慢病毒，将重组pLent‑C‑GFP‑CD20慢病毒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞，得到可控型抗CD20嵌合抗原受体修饰T细胞；该发明制备的可控型抗CD20嵌合抗原受体修饰T细胞具有增殖速度快、识别肿瘤的机制、杀瘤谱广等特点。

Description

一种可控型CD20嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法及其 应用
技术领域
本发明涉及生物与新医药技术领域，更具体的说，是一种可控型CD20嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法及其应用。
背景技术
癌症，即恶性肿瘤，为人类仅次于心血管疾病的高死亡率疾病。白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他非造血组织和器官，同时抑制正常造血功能。临床可见不同程度的贫血、出血、感染发热以及肝、脾、***肿大和骨骼疼痛。据报道，我国各地区白血病的发病率在各种肿瘤中占第六位。
非霍奇金氏淋巴瘤(Non Hodgkin’s lymphoma,NHL)是最常见的淋巴***恶性肿瘤，其中绝大多数为B细胞淋巴瘤。CD20是一种非糖基化的III型跨膜蛋白，具高度的保守性。CD20仅在前B淋巴细胞、未成熟B淋巴细胞、成熟B淋巴细胞及激活的B淋巴细胞中表达，而在浆细胞、淋巴多能干细胞以及其它组织中均无表达。超过95％的B细胞淋巴瘤表达CD20，且没有明显的CD20内吞或脱落现象，这些特征使得CD20成为治疗B细胞淋巴瘤的理想靶抗原。
效应细胞毒性T细胞是人体免疫防护***中最有力的“杀手”。T细胞的主要功能是识别并迅速地破坏那些已经被病毒感染或遭受恶性转化的细胞或组织。T细胞的激活是其发挥细胞杀伤作用的根本前提。T细胞的激活不是简单的一步反应，而是受一系列的细胞表面蛋白的控制，以此来保证T细胞只作用于特定的靶标。这些表面蛋白包括一个能特异地识别靶细胞表面抗原与MHC I类分子复合物的T细胞受体、CD3信号复合物、共刺激分子和粘附分子。在它们的作用下，T细胞和靶细胞之间形成一个免疫连接，静态的T细胞被激活，从而发挥杀伤靶细胞的效应。此外，肿瘤细胞还可能通过“免疫逃避”策略来对付T细胞的杀伤作用，如降低肿瘤细胞表面MHC I类分子的表达，使之不能与表面抗原形成复合物，进而不能被T细胞受体所识别。T细胞激活过程的复杂调控和肿瘤细胞的免疫逃避机制大大限制了T细胞杀伤肿瘤细胞潜能的充分发挥。
为了使肿瘤细胞不能逃避T细胞的杀伤作用，并且使T细胞具有靶向性的特点。本发明利用第二代CAR-T细胞技术修饰的T细胞来***。CAR修饰的T细胞***，是一种利用人体自身或者直系亲属外周血分离得到T细胞，并对其修饰，使其能够识别肿瘤细胞进行精准杀伤的治疗手段。相对于目前临床使用的放疗、化疗而言，具有毒副作用小的特点。
由于CAR-T细胞***是最前言的生物治疗方法，人们担心其引起的副作用无法控制，寻找可控的CAR-T细胞成为目前临床应用中面临的重要问题。
发明内容
为了弥补以上不足，本发明提供了一种可控型CD20嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法及其应用。
本发明的方案是：
一种可控型抗CD20嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法，按顺序将导引子、人源化抗人B细胞淋巴瘤CD20单链抗体、CD8Hinge区、CD8跨膜区、4-1BB胞内区、CD3ζ胞内区、自切割多肽T2A与HSV-TK序列合成，构成Leader-CD20-CD8-4-1BB-CD3ζ-T2A-HSV-TK的基因片段，将Leader-CD20-CD8-4-1BB-CD3ζ-T2A-HSV-TK基因片段***到pLent-C-GFP载体，转化后提取质粒，获得慢病毒表达质粒pLent-C-GFP-CD20，转染，包装成携带有重组pLent-C-GFP-CD20的慢病毒，将重组Lent-C-GFP-CD20慢病毒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞，得到可控型抗CD20嵌合抗原受体修饰T细胞。
作为优选的技术方案，所述Leader-CD20-CD8-4-1BB-CD3ζ-T2A-HSV-TK的基因片段为序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供一种单核细胞诱导的异质T淋巴细胞制备如下：取患者自体外周血，分离外周血单个核细胞，用重组干扰素α2a的培养基诱导培养24小时后，加入重组白细胞介素、OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养；每隔三天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测T细胞中的CD3+、CD56+的阳性表达率；CD3+阳性率>80％，CD3+CD56+双阳性率>20％，视为T细胞诱导成功，并留取该T细胞待病毒感染。
本发明还提供还包括包装成重组pLent-C-GFP-CD20慢病毒的方法：复苏293T细胞，培养2天，使其细胞状态达到最佳；取6×105个细胞在六孔板中培养，为第二天的转染做准备；转染前将六孔板换成新鲜DMEM培养基，37℃温箱中培养1h；质粒pLent-C-GFP-CD20与慢病毒包装质粒采用脂质体转染法转染293T细胞；48小时后，显微镜下观察293T细胞转染后的形态变化；72h后将含有病毒的细胞培养上清吸入EP管中，4℃，2000g离心10min，转移至新的EP管中，过滤后，获得慢病毒，-80℃保存。
本发明还提供一种将重组pLent-C-GFP-CD20慢病毒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞的方法：从-80℃拿出重组pLent-C-GFP-CD20慢病毒液解冻后加入培养基，将聚凝胺加入上述培养基稀释，使其终浓度为10μg/ml；用该病毒液重悬1×106个上述诱导的T细胞。将细胞悬液加入到6孔板中，使病毒颗粒数与T细胞数比例约为3:1，400g，90min；37℃，5％的CO2培养箱中培养16小时后，用新鲜培养基稀释一倍，继续培养1天后收集细胞去除剩余的病毒颗粒进行正常培养，培养15-17天使细胞扩增至足够的用量。
本发明还提供一种治疗恶性肿瘤的药物，含有权利要求1所述的可控型抗CD20嵌合抗原受体修饰T细胞。
由于采用了上述技术方案，一种可控型抗CD20嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法，按顺序将导引子、人源化抗人B细胞淋巴瘤CD20单链抗体、CD8Hinge区、CD8跨膜区、4-1BB胞内区、CD3ζ胞内区、自切割多肽T2A与HSV-TK序列合成，构成Leader-CD20-CD8-4-1BB-CD3ζ-T2A-HSV-TK的基因片段，将Leader-CD20-CD8-4-1BB-CD3ζ-T2A-HSV-TK基因片段***到pLent-C-GFP载体，转化后提取质粒，获得慢病毒表达质粒pLent-C-GFP-CD20，转染，包装成携带有重组pLent-C-GFP-CD20的慢病毒，将重组pLent-C-GFP-CD20慢病毒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞，得到可控型抗CD20嵌合抗原受体修饰T细胞。
本发明的优点，本发明所述的CAR-CD20，活性“开关”元件是由***基因单纯疱疹胸腺嘧啶激酶(herpes-simplex-thymidine-kinase，HSV-TK)构成。通过自切割多肽T2A与嵌合抗原受体的CD3ζ相连。CAR-CD20在转入T细胞翻译成蛋白后，T2A可以使分子“开关“元件与CD3ζ切割，使得嵌合抗原受体和分子“开关”元件的蛋白结构不受影响，并且两者的表达水平一致。分子“开关”元件的活性是由药物更昔洛韦控制，在CAR-T细胞引起严重的副作用时，注射更昔洛韦可导致CAR-T细胞的裂解死亡，从而减缓副作用。
本发明增殖速度快、具有识别肿瘤的机制、杀瘤谱广、典型的个性化生物治疗模型。
本发明中包含有嵌合抗原受体的T细胞，是自体的T细胞；所用T细胞的数量为0.5×106-1×109/Kg；通常所用的T细胞的剂量为0.5×106-1.0×107/kg。
附图说明
图1为本发明所述的嵌合抗原受体Leader-CD20-CD8-4-1BB-CD3ζ-T2A-HSV-TK的融合基因片段的设计图。
图2为本发明所述的慢病毒表达质粒pLent-C-GFP-CD20的示意图。
图3为本发明所述的流式细胞术检测CAR-CD20感染T细胞的效率图。
图4为本发明中CAR-T细胞对人B淋巴瘤细胞系RAMOS杀伤活性图。
图5为本发明中CAR-T细胞对615小鼠肿瘤生长的抑制效率图。
具体实施方式
为了弥补以上不足，本发明提供了一种可控型CD20嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法及其应用，以解决上述背景技术中的问题。
实施例1pLent-C-GFP-CD20表达载体的构建
Leader-CD20-CD8-4-1BB-CD3ζ-T2A-HSV-TK模块示意见图1(完整核酸序列见附录SEQ ID NO.1)。
Leader-CD20-CD8-4-1BB-CD3ζ-T2A-HSV-TK各模块序列
(1)导引子Leader(SEQ ID NO.2)
(2)人源化抗人B细胞淋巴瘤CD20单链抗体(SEQ ID NO.3)
(3)CD8Hinge区(SEQ ID NO.4)
(4)CD8跨膜区(SEQ ID NO.5)
(5)4-1BB胞内区(SEQ ID NO.6)
(6)CD3ζ胞内区(SEQ ID NO.7)
(7)自切割多肽T2A(SEQ ID NO.8)
(8)HSV-TK序列(SEQ ID NO.9)
分别按照上述从(1)-(8)的顺序委托北京博迈德基因技术有限公司合成其整个表达框，***pLent-C-GFP载体(购自Vigene公司)AsiSI-NotI位点(见图2)，转化到E.coli(Top10)，经测序正确后，使用OMEGA公司的质粒提取试剂盒提取质粒，获得重组表达载体pLent-C-GFP-CD20。
实施例2pLent-C-GFP-CD20修饰T细胞的制备
1.异质性T细胞的制备
取75ml患者自体外周血，用TBD样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，分离外周血单个核细胞。用含有1000IU/ml的重组干扰素α2a(购自沈阳三生制药)的培养基(购自CORNING公司，88-551-CM)诱导培养24小时后，加入1500IU/ml的重组白细胞介素2(购自沈阳三生制药)、50ng/ml的OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养。每隔三天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测T细胞中的CD3+、CD56+的阳性表达率(CD3-FITC，CD16/CD56-PE抗体购自BECKMAN公司，A07735)。CD3+阳性率>80％，CD3+CD56+双阳性率>20％，视为T细胞诱导成功，并留取该T细胞待病毒感染。
2.慢病毒包装
复苏293T细胞，培养2天，使其细胞状态达到最佳。取6×105个细胞在六孔板中培养，为第二天的转染做准备。转染前将六孔板换成新鲜DMEM培养基(购自Gibco公司)，37℃温箱中培养1h。重组质粒pLent-C-GFP-CD20和空载质粒pLent-C-GFP分别与慢病毒包装质粒psPAX2、pMDNA2G采用脂质体转染法转染293T细胞。48小时后，显微镜下观察293T细胞转染后的形态变化。72h后将含有病毒的细胞培养上清吸入EP管中，4℃，2000g离心10min，转移至新的EP管中，4.5μm滤器过滤后-80℃保存。
3.慢病毒感染T细胞及感染后T细胞的扩增培养
用上述重组和空载慢病毒分别感染T细胞。从-80℃拿出2ml病毒液解冻后加入培养基，将聚凝胺(购自Sigma公司)加入上述培养基稀释，使其终浓度为10μg/ml。用该病毒液重悬1×106个上述诱导的T细胞。将细胞悬液加入到6孔板中，使病毒颗粒数与T细胞数比例约为3:1，400g，90min。37℃，5％的CO2培养箱中培养16小时后，用新鲜培养基稀释一倍，继续培养1天后收集细胞去除剩余的病毒颗粒进行正常培养，培养15-17天使细胞扩增至足够的用量。通过流式细胞术检测嵌合抗原受体表达(如图3)。以未感染的T淋巴细胞作为阴性对照，重组慢病毒感染T细胞其阳性率45.2％，空载慢病毒感染T细胞其阳性率为49.3％。
实施例3：具有***基因***的CAR-T细胞杀伤活性研究
取人B淋巴瘤细胞系RAMOS作为靶细胞，效应细胞为CAR-T细胞和空载慢病毒感染T细胞。
1.***基因***对CAR-T细胞活性的控制
将CAR-T细胞按照密度6×104个/ml接种96孔板中，每孔100ul，置于5％CO2、37℃培养箱培养24h；加入10ng更昔洛韦(武汉海特生物制药股份有限公司)，每24小时一次，共3次。以未加更昔洛韦的CAR-T细胞作为阴性对照。用MTT法检测96孔板中剩余细胞量，细胞存活率＝(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)，***基因***对修饰后T细胞活性的控制率＝(1-细胞存活率)×100％。***基因***对CAR-T细胞活性的控制率为90.15％±1.78％；结果说明本发明设计的CAR-T细胞活性受***基因***的控制。
2.CAR-T细胞对人B淋巴瘤细胞系RAJI杀伤活性分析
利用7-AAD/CFSE细胞毒性测试试剂盒(购自Gayman)评估CAR-T细胞对人B淋巴瘤细胞RAJI的杀伤力。接种100。Sn10104/孔的靶细胞RAJI到96孔板中，分别按照10:1、5:1、1:1效靶比加入效应细胞即CAR-T细胞，置于5％CO2、37℃培养箱培养24h。以加入不感染慢病毒T细胞和空载慢病毒感染T细胞作为对照组。收集细胞，清洗之后用7AAD染色，BDFacsCanto II用于获取染色细胞，FlowJo用于分析结果。结果显示效靶比10：1的效果最好。如图4所示，相对于不感染病毒和感染空载体病毒液的对照组，CAR-T细胞对靶细胞RAJI有明显的杀伤作用。CAR-T细胞对人B淋巴瘤细胞RAJI细胞的杀伤效率为83.23％±1.85％；结果说明本发明设计的CAR-CD20修饰的T细胞对人B淋巴瘤细胞系具有很高杀伤作用。
实施例4：CAR-T细胞对615小鼠肿瘤生长抑制作用
18-22g雄性615小鼠(购自沈阳蓝谱达斯实验用品科技有限公司)于动物房饲养(室温23±2℃，湿度50％±10％)，收集对数期的人B淋巴瘤细胞RAJI细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至2×105个/mL。无菌条件下，小鼠左腋下接种0.2mL人B淋巴瘤细胞RAJI细胞悬浮液，观察3-5d，待腋下出现米粒大小较硬的结节作为建模成功的标准。
615白血病移植模型小鼠(游标卡尺量取皮下肿瘤组织块的大小为90-100mm3)随机分成5组，每组20只，开始注射治疗实验。实验组分别为：
a.对照组，尾部静脉注射同等体积的生理盐水；
b.治疗一组，尾部静脉注射2×106个细胞/只正常T细胞；
c.治疗二组，尾部静脉注射2×106个细胞/只空载感染的T细胞；
d.治疗三组，尾部静脉注射2×106个细胞/只CAR-T细胞。
e.治疗四组，尾部静脉注射2×106个细胞/只CAR-T细胞，24h后注射更昔洛韦(8mg/kg)，每天一次。
每周免疫上述各组小鼠一次，连续免疫两周，每天通过游标卡尺量取各个实验组小鼠皮下肿瘤组织块大，并记录，用肿块均值绘制肿瘤生长曲线图，结果如图5所示。从第一次免疫CAR-T细胞起10天内，65％小鼠几乎触摸不到肿瘤。注射更昔洛韦后CAR-T细胞对肿瘤基本不起作用，说明更昔洛韦可以启动CAR-T细胞的******。结果表明本发明设计的CAR-T细胞对615小鼠肿瘤生长有明显的抑制作用，且活性受***基因***的控制。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 山东兴瑞生物科技有限公司
<120>一种可控型抗CD20嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法及其应用
<130> 2017
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2674
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
ggatccgcga tcgcatggcc ctgcctgtga cagccctgct gctgcctctg gctctgctgc 60
tgcatgccgc tagacccgac atccagctga cccagtctcc agcaatcctg tctgcatctc 120
caggggagaa ggtcacaatg acttgcaggg ccagctcaag tgtaagttac atccactggt 180
tccagcagaa gccaggatcc tcccccaaac cctggattta tgccacatcc aacctggctt 240
ctggagtccc tgttcgcttc agtggcagtg ggtctgggac ttcttactct ctcacaatca 300
gcagagtgga ggctgaagat gctgccactt attactgcca gcagtggact agtaacccac 360
ccacgttcgg aggggggacc aagctggaga tcaaaggagg aggaggaagc ggaggaggag 420
gaagcggagg aggaggaagc caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaagc 480
ctggggcctc agtgaagatg tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc agttacaata 540
tgcactgggt aaaacagaca cctggtcggg gcctggaatg gattggagct atttatcccg 600
gaaatggtga tacttcctac aatcagaagt tcaaaggcaa ggccacattg actgcagaca 660
aatcctccag cacagcctac atgcagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct 720
attactgtgc aagatcgact tactacggcg gtgactggta cttcgatgtc tggggccaag 780
ggaccacggt caccgtctcc tcagctagca ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac 840
cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg 900
cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc 960
ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac 1020
ggggcagaaa gaaactcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta 1080
ctcaagagga agatggctgt agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac 1140
tgagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc 1200
tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg 1260
gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca 1320
atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc 1380
gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca 1440
cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgcgc ggccgcctcg aggaaggccg 1500
agggagcctg ctgacatgtg gcgatgtgga ggaaaaccca ggaccaatgg cttcgtaccc 1560
ctgccatcaa cacgcgtctg cgttcgacca ggctgcgcgt tctcgcggcc ataacaaccg 1620
acgtacggcg ttgcgccctc gccggcagca agaagccacg gaagtccgcc tggagcagaa 1680
aatgcccacg ctactgcggg tttatataga cggtcctcac gggatgggga aaaccaccac 1740
cacgcaactg ctggtggccc tgggttcgcg cgacgatatc gtctacgtac ccgagccgat 1800
gacttactgg caggtgctgg gggcttccga gacaatcgcg aacatctaca ccacacaaca 1860
ccgcctcgac cagggtgaga tatcggccgg ggacgcggcg gtggtaatga caagcgccca 1920
gataacaatg ggcatgcctt atgccgtgac cgacgccgtt ctggctcctc atatcggggg 1980
ggaggctggg agctcacatg ccccgccccc ggccctcacc ctcatcttcg accgccatcc 2040
catcgccgcc ctcctgtgct acccggccgc gcgatacctt atgggcagca tgacccccca 2100
ggccgtgctg gcgttcgtgg ccctcatccc gccgaccttg cccggcacaa acatcgtgtt 2160
gggggccctt ccggaggaca gacacatcga ccgcctggcc aaacgccagc gccccggcga 2220
gcggcttgac ctggctatgc tggccgcgat tcgccgcgtt tacgggctgc ttgccaatac 2280
ggtgcggtat ctgcagggcg gcgggtcgtg gcgggaggat tggggacagc tttcggggac 2340
ggccgtgccg ccccagggtg ccgagcccca gagcaacgcg ggcccacgac cccatatcgg 2400
ggacacgtta tttaccctgt ttcgggcccc cgagttgttg gcccccaacg gcgacctgta 2460
taacgtgttt gcctgggcct tggacgtctt ggccaaacgc ctccgtccca tgcacgtctt 2520
tatcctggat tacgaccaat cgcccgccgg ctgccgggac gccctgctgc aacttacctc 2580
cgggatggtc cagacccacg ttaccacccc aggctccata ccgacgatct gcgacctggc 2640
gcgcacgttt gcccgggaga tgggggaggc taac 2674
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 导引子Leader人工序列
<400> 2
atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60
ccc 63
<210> 3
<211> 726
<212> DNA
<213>人源化抗人B细胞淋巴瘤CD20单链抗体人工序列
<400> 3
gacatccagc tgacccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60
atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatccact ggttccagca gaagccagga 120
tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgttcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacttcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg actagtaacc cacccacgtt cggagggggg 300
accaagctgg agatcaaagg aggaggagga agcggaggag gaggaagcgg aggaggagga 360
agccaggtcc aactgcagca gcctggggct gagctggtga agcctggggc ctcagtgaag 420
atgtcctgca aggcttctgg ctacacattt accagttaca atatgcactg ggtaaaacag 480
acacctggtc ggggcctgga atggattgga gctatttatc ccggaaatgg tgatacttcc 540
tacaatcaga agttcaaagg caaggccaca ttgactgcag acaaatcctc cagcacagcc 600
tacatgcagc tccgcagcct gacatctgag gactctgcgg tctattactg tgcaagatcg 660
acttactacg gcggtgactg gtacttcgat gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 720
tcctca 726
<210> 4
<211>135
<212> DNA
<213> CD8 Hinge区人工序列
<400> 4
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 5
<211> 72
<212> DNA
<213> CD8跨膜区人工序列
<400> 5
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 6
<211> 126
<212> DNA
<213>4-1BB胞内区人工序列
<400> 6
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 7
<211> 336
<212> DNA
<213> CD3ζ胞内区人工序列
<400> 7
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 8
<211> 54
<212> DNA
<213>自切割多肽T2A人工序列
<400> 8
gaaggccgag ggagcctgct gacatgtggc gatgtggagg aaaacccagg acca 54
<210> 9
<211> 1128
<212> DNA
<213> HSV-TK人工序列
<400>9
atggcttcgt acccctgcca tcaacacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc 60
ggccataaca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 120
cgcctggagc agaaaatgcc cacgctactg cgggtttata tagacggtcc tcacgggatg 180
gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt cgcgcgacga tatcgtctac 240
gtacccgagc cgatgactta ctggcaggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc 300
tacaccacac aacaccgcct cgaccagggt gagatatcgg ccggggacgc ggcggtggta 360
atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc cgttctggct 420
cctcatatcg ggggggaggc tgggagctca catgccccgc ccccggccct caccctcatc 480
ttcgaccgcc atcccatcgc cgccctcctg tgctacccgg ccgcgcgata ccttatgggc 540
agcatgaccc cccaggccgt gctggcgttc gtggccctca tcccgccgac cttgcccggc 600
acaaacatcg tgttgggggc ccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc 660
cagcgccccg gcgagcggct tgacctggct atgctggccg cgattcgccg cgtttacggg 720
ctgcttgcca atacggtgcg gtatctgcag ggcggcgggt cgtggcggga ggattgggga 780
cagctttcgg ggacggccgt gccgccccag ggtgccgagc cccagagcaa cgcgggccca 840
cgaccccata tcggggacac gttatttacc ctgtttcggg cccccgagtt gttggccccc 900
aacggcgacc tgtataacgt gtttgcctgg gccttggacg tcttggccaa acgcctccgt 960
cccatgcacg tctttatcct ggattacgac caatcgcccg ccggctgccg ggacgccctg 1020
ctgcaactta cctccgggat ggtccagacc cacgttacca ccccaggctc cataccgacg 1080
atctgcgacc tggcgcgcac gtttgcccgg gagatggggg aggctaac 1128

Claims (7)

1.一种可控型抗CD20嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法，其特征在于：按顺序将导引子、人源化抗人B细胞淋巴瘤CD20单链抗体、CD8Hinge区、CD8跨膜区、4-1BB胞内区、CD3ζ胞内区、自切割多肽T2A与HSV-TK序列合成，构成Leader-CD20-CD8-4-1BB-CD3ζ-T2A-HSV-TK的基因片段，将Leader-CD20-CD8-4-1BB-CD3ζ-T2A-HSV-TK基因片段***到pLent-C-GFP载体，转化后提取质粒，获得慢病毒表达质粒pLent-C-GFP-CD20，转染，包装成携带有重组pLent-C-GFP-CD20的慢病毒，将重组pLent-C-GFP-CD20慢病毒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞，得到可控型抗CD20嵌合抗原受体修饰T细胞。
2.如权利要求1所述的一种可控型抗CD20嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法，其特征在于:所述Leader-CD20-CD8-4-1BB-CD3ζ-T2A-HSV-TK的基因片段为序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的一种可控型抗CD20嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法，其特征在于，还包括所述单核细胞诱导的异质T淋巴细胞制备如下：取患者自体外周血，分离外周血单个核细胞，用重组干扰素α2a的培养基诱导培养24小时后，加入重组白细胞介素、OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养；每隔三天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测T细胞中的CD3+、CD56+的阳性表达率；CD3+阳性率>80％，CD3+CD56+双阳性率>20％，视为T细胞诱导成功，并留取该T细胞待病毒感染。
4.如权利要求1所述的一种可控型抗CD20嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法，其特征在于，还包括包装成重组pLent-C-GFP-CD20慢病毒的方法：复苏293T细胞，培养2天，使其细胞状态达到最佳；取6×105个细胞在六孔板中培养，为第二天的转染做准备；转染前将六孔板换成新鲜DMEM培养基，37℃温箱中培养1h；质粒pLent-C-GFP-CD20与慢病毒包装质粒采用脂质体转染法转染293T细胞；48小时后，显微镜下观察293T细胞转染后的形态变化；72h后将含有病毒的细胞培养上清吸入EP管中，4℃，2000g离心10min，转移至新的EP管中，过滤后，获得慢病毒-80℃保存。
5.如权利要求1所述的一种可控型抗CD20嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法，其特征在于，还包括将重组pLent-C-GFP-CD20慢病毒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞的方法：重组pLent-C-GFP-CD20慢病毒液解冻后加入培养基，将聚凝胺加入上述培养基稀释，使其终浓度为10μg/ml；用该病毒液重悬1×106个上述诱导的T细胞。将细胞悬液加入到6孔板中，使病毒颗粒数与T细胞数比例约为3:1，400g，90min；37℃，5％的CO2培养箱中培养16小时后，用新鲜培养基稀释一倍，继续培养1天后收集细胞去除剩余的病毒颗粒进行正常培养，培养15-17天使细胞扩增至足够的用量。
6.一种治疗恶性肿瘤的药物，其特征在于：含有权利要求1所述的可控型抗CD20嵌合抗原受体修饰T细胞。
7.权利要求1所述的可控型抗CD20嵌合抗原受体修饰T细胞用于制备治疗恶性肿瘤的药物的用途。
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