CN102159243A - 用于改良的治疗特征的抗体的结构变体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了置换的人源化的、嵌合的或人抗-CD20抗体或其抗原结合片段,和包含所述置换的抗体或其抗原结合片段的双特异性抗体或融合蛋白。所述抗体、融合蛋白或片段可用于治疗B-细胞障碍,例如B-细胞恶性肿瘤和自身免疫病、以及GVHD、器官移植排斥和溶血性贫血和冷球蛋白血症。氨基酸置换,尤其是在CDR3VH(CDRH3)的Kabat位置101处的天冬氨酸残基的置换,会导致改良的治疗性质,例如降低的解离速率、提高的CDC活性、提高的细胞凋亡、提高的B-细胞消除和在非常低剂量的提高的治疗效能。Veltuzumab(即掺入这样的序列变化的人源化的抗-CD20抗体)表现出与不同CDRH3序列的类似抗体相比提高的治疗效能,允许在静脉内或皮下施用时,在低至200mg或更小、更优选100mg或更小、更优选80mg或更小、更优选50mg或更小、最优选30mg或更小的裸抗体剂量达到疗效。
Description
相关申请
本申请根据35 U. S. C. 119(e)要求2008年7月21日提交的美国临时专利申请系列号61/082,399的利益。
发明背景
技术领域。
本发明涉及具有改良的治疗特征的抗-CD20抗体的结构变体和/或其抗原结合片段,优选地包含互补性决定区(CDR)的氨基酸序列。在具体实施方案中,所述结构变体可以包含抗体重链第三个CDR序列(CDRH3)的变化,例如用天冬氨酸残基置换在Kabat位置101处的天冬酰胺残基。在其它具体实施方案中,所述结构变体可以包含在Kabat位置94处的精氨酸残基,其可以与在Kabat位置101处的天冬氨酸形成盐桥。在其它具体实施方案中,所述结构变体可以包含在Kabat位置102处的缬氨酸残基。这样的结构变体可以为与B-细胞增殖有关的疾病(诸如B-细胞白血病、淋巴瘤或自身免疫病)以及涉及B-细胞的其它免疫病提供提高的效能。在优选的实施方案中,提高的效能可以允许施用低剂量的抗-CD20抗体或其抗原结合片段,例如80 mg或更小、更优选50 mg或更小、最优选30 mg或更小,它们可以间隔约1-3周施用2次或更多次,或甚至每周施用2次或更多次。
抗-CD20抗体可以是人源化的、嵌合的或人抗-CD20抗体,尤其是单克隆抗体(MAb)。其它实施方案可能涉及人源化的、嵌合的或人抗-CD20抗体的治疗和/或诊断缀合物,和治疗B-细胞淋巴瘤和白血病和不同的自身免疫病的方法,例如使用人源化的、嵌合的或人抗-CD20抗体。其它实施方案可能涉及抗体融合蛋白或其抗原结合片段,其包含至少一种抗-CD20 MAb或其抗原结合片段,在某些情况下,其与第二种不同的抗体、尤其是抗-CD20抗体、优选抗-CD20 MAb或其抗原结合片段相组合。人源化的、嵌合的或人MAb、其抗原结合片段或抗体融合蛋白,可以作为治疗性免疫缀合物单独施用,或与一种或更多种治疗剂、与其它裸抗体或其它免疫缀合物联合施用。其它实施方案涉及编码人源化的、嵌合的或人抗-CD20抗体和抗体融合蛋白的DNA序列,含有所述DNA序列的载体和宿主细胞,和制备人源化的、嵌合的或人抗-CD20抗体的方法。
背景
脊椎动物的免疫***由许多器官和细胞类型组成,它们已经进化成准确地识别外来抗原,特异性地结合和消除/破坏这样的外来抗原。除了其它以外,淋巴细胞对于免疫***而言是至关重要的。淋巴细胞被分成2个主要亚群:T细胞和B细胞。尽管是相互依赖的,T细胞主要负责细胞-介导的免疫,B-细胞主要负责抗体生产(体液免疫)。
在人类中,每个B-细胞可以生产大量抗体分子。当外来抗原已经被中和时,这样的抗体生产通常会停止(或大幅减少)。但是,偶然地,特定B-细胞的增殖会持续不减弱,且可能导致称作B-细胞淋巴瘤或白血病的癌症。B-细胞淋巴瘤(诸如非霍奇金淋巴瘤的B-细胞亚型)是癌症死亡率的重要病因。B-细胞恶性肿瘤对不同治疗形式的反应是混合的。例如,在可能对非霍奇金淋巴瘤进行适当临床分期的情况下,场辐射疗法可以提供令人满意的治疗。仍然有约一半的患者死于该疾病。Devesa等人, J. Nat. Cancer Inst.
79:701 (1987)。
大多数慢性淋巴细胞白血病属于B-细胞谱系。Freedman, Hematol. Oncol.
Clin. North Am. 4:405 (1990)。这类B-细胞恶性肿瘤是在西方世界最常见的白血病。Goodman 等人, Leukemia and Lymphoma
22: 1 (1996)。慢性淋巴细胞白血病的天然历史分成几个阶段。在早期,慢性淋巴细胞白血病是无痛的疾病,其特征在于小的成熟的机能不全的具有延长的寿命的恶性B-细胞的积累。最终,恶性B-细胞的倍增时间缩短,患者逐渐变得有症状。尽管治疗可以提供症状缓解,患者的总存活数仅受到微小影响。晚期慢性淋巴细胞白血病的特征在于显著的贫血和/或血小板减少症。在这时,生存中值小于2年。Foon 等人, Annals Int. Medicine
113:525 (1990)。由于非常低的细胞增殖速率,慢性淋巴细胞白血病可耐受细胞毒性药物治疗。B-细胞起源的慢性和急性淋巴细胞白血病是本文所述疗法的适当靶标。
由于毒性副作用,治疗B-细胞恶性肿瘤的传统方法(包括化疗和放疗)具有有限的实用性。单克隆抗体用于引导放射性核素、毒素或其它治疗剂的应用,提供了将这些药剂选择性地递送到肿瘤部位的可能性,从而限制对正常组织的毒性。另外,B-细胞抗原在这些B-细胞恶性肿瘤上的存在,使它们成为使用未缀合的B-细胞抗体(诸如针对B-细胞上的CD 19、CD20、CD21、CD23和CD22标志物)的疗法的最佳靶标。HLA-DR、CD30、CD37、CD40、CD45、CD70、CD79a和其它抗原可以用作正常和恶性B-细胞的靶标,尽管它们也在其它细胞类型上表达。此外,某些MUC1、MUC2、MUC3和MUC4抗原、优选MUC1、以及胰岛素-样生长因子(ILGF)、胰岛素-样生长因子受体、巨噬细胞迁移-抑制因子(MIF),也在不同的造血恶性肿瘤中表达,包括表达CD20和其它B-细胞标志物的B-细胞肿瘤。其它抗原靶标,例如与肿瘤血管内皮有关的那些,包括生腱蛋白、血管内皮生长因子受体 (VEGFR)和胎盘生长因子(PlGF),以及与B-细胞恶性肿瘤有关的其它抗原类别,例如癌基因产物(cMET、Kras、bcl-2、bcl-6),也是治疗性抗体的适当靶标。
B-细胞包含可以用作分化和鉴定的标志物的细胞表面蛋白。一种这样的人B-细胞标志物是人B淋巴细胞-限制的分化抗原Bp35,称作CD20。CD20在早期前-B-细胞发育期间表达,并保留至浆细胞分化。CD20在正常的B细胞和恶性B细胞上表达,所述恶性B细胞的异常生长可以导致B-细胞淋巴瘤和白血病。已经研究抗CD20抗原的抗体用于治疗B-细胞淋巴瘤和白血病。例如,在以超过500 mg/注射的剂量重复注射中作为未缀合的抗体提供时,指定为“IDEC-c2B8”(利妥昔单抗)的嵌合的抗-CD20抗体具有抗B-细胞淋巴瘤的活性。Maloney 等人, Blood 84:2457 (1994);
Longo, Curr. Opin. Oncol. 8:353 (1996)。用该方案治疗的约50%的非霍奇金患者(具有低级无痛形式)表现出反应。在作为超过600 mg/注射的未标记的抗体预处理的重复剂量提供时,使用131I-标记的Bl (托西莫单抗) 抗-CD20 鼠单克隆抗体也已经得到治疗反应。Kaminski 等人, N. Engl. J. Med. 329:459
(1993); Press 等人, N. Engl. J. Med.
329:1219 (1993); Press 等人, Lancet 346:336 (1995)。但是,这些抗体(无论作为未缀合的形式还是放射性标记的形式提供),尚未在具有更普遍的和致死的B-细胞淋巴瘤形式(中间或侵略类型)的患者中表现出高客观率和持久反应。因此,需要开发B-细胞恶性肿瘤的免疫疗法,其实现显著持续时间的治疗反应。
使用通过连续静脉内输注施用给B-细胞淋巴瘤患者的抗-CD20 鼠单克隆抗体IF5,已经进行了靶向CD20表面抗原的其它研究。据报道,需要非常高水平(>2 g)的1F5来清除循环肿瘤细胞,且结果被描述为“暂时的”。Press 等人, “Monoclonal Antibody 1F5
(Anti-CD20) Serotherapy of Human B-CeIl Lymphomas.” Blood 69/2:584-591 (1987)。但是,该方案的一个潜在问题是,非-人单克隆抗体(例如,鼠单克隆抗体)通常缺乏人效应物功能性,即,它们不能介导补体-依赖性的溶胞作用,或通过抗体-依赖性的细胞毒性或Fc-受体介导的吞噬作用裂解人靶细胞。此外,非-人单克隆抗体可以被人宿主识别为外来蛋白,因此,重复注射这样的外来抗体可以导致免疫反应的诱导,所述免疫反应导致有害的超敏反应。对于基于鼠的单克隆抗体,这经常称作人抗-小鼠抗体(HAMA)反应。
嵌合抗体的使用是优选的,因为它们不会引起象鼠抗体一样强的HAMA反应。嵌合抗体是包含来自2个或更多个不同物种的部分的抗体。例如,Liu, A. Y. 等人, “Production of a
Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-dependent
Biologic Activity” J. Immunol. 139/10:3521-3526 (1987),描述了针对CD20抗原的小鼠/人嵌合抗体。也参见,PCT公开号WO 88/04936。一种示例性的嵌合抗体包含连接到人抗体恒定区序列上的小鼠可变区序列。
人源化的抗体的使用是甚至更优选的,以便进一步降低诱导HAMA反应的可能性。如下面讨论的,通过用对应的人抗体框架和恒定区序列替换鼠框架和恒定区序列来人源化鼠抗体的技术,是本领域众所周知的,且已经应用于多种鼠抗癌抗体。抗体人源化也可以包含,用来自亲本鼠框架区序列的对应残基替换一个或更多个人框架氨基酸残基。
已经提高了抗体的有效治疗B-细胞障碍的能力的另一个方案是,将治疗剂(诸如放射性药剂或化学治疗剂)缀合到抗体上,使得所述药剂定位在肿瘤部位。例如,已经用131I标记了上面提及的1F5抗体和其它B-细胞抗体,并在2位患者中评价了生物分布。参见Eary, J. F. 等人, “Imaging and Treatment of B-CeIl
Lymphoma” J. Nuc. Med.
31/8:1257-1268 (1990); 也参见,Press, O. W. 等人, “Treatment of Refractory Non-Hodgkin's Lymphoma with Radiolabeled MB-1
(Anti-CD37) Antibody” J. Clin. Oncol. 7/8:1027-1038 (1989) (指出用131I-标记的IF-5治疗的一位患者实现部分反应); Goldenberg, D. M. 等人, “Targeting, Dosimetry and
Radioimmunotherapy of B-CeIl Lymphomas with 131I-Labeled LL2
Monoclonal Antibody” J. Clin. Oncol. 9/4:548-564 (1991) (据报道,接受多次注射的8位患者中的3位已经形成对该CD22 鼠抗体的HAMA反应); Appelbaum, F. R. “Radiolabeled Monoclonal
Antibodies in the Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma” Hem./Oncol. Clinics of N.
Am. 5/5:1013-1025 (1991) (综述文章); Press, O. W. 等人“Radiolabeled-Antibody Therapy of
B-CeIl Lymphoma with Autologous Bone Marrow Support.” New England Journal of
Medicine 329/17: 1219-12223 (1993) (131I-标记的抗-CD20抗体IF5和Bl-托西莫单抗);和Kaminski, M. G. 等人“Radioimmunotherapy of
B-Cell Lymphoma with [131I] Anti-Bl (Anti-CD20) Antibody”. NEJM 329/7:459 (1993) (131I-标记的抗-CD20抗体Bl); PCT 公开申请WO 92/07466 (缀合到诸如多柔比星或丝裂霉素等化疗剂上的抗体)。但是,这些方案尚未消除与使用鼠抗体有关的障碍,尽管事实上许多已经接受事先的侵略性细胞毒性化疗的淋巴瘤患者是免疫抑制的,因而具有比没有重度预处理的淋巴瘤患者更低的HAMA比例。
自身免疫病是一类与B-细胞障碍有关的疾病。实例包括:急性特发性血小板减少性紫瘢、慢性特发性血小板减少性紫瘢、皮肌炎、西登哈姆舞蹈病、重症肌无力、***性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺体综合征、大疱性类天疱疮、I型糖尿病、亨-舍二氏紫瘢、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎、阿狄森氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化、肉状瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯彻氏综合征、血栓闭塞性脉管炎、干燥综合征、原发性胆汁性肝硬变、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多发性肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常天疱疮、韦格纳氏肉芽肿、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球性肾炎和纤维化肺泡炎。最常见的治疗是皮质类甾醇类和细胞毒性药物,它们可以是非常毒性的。这些药物也抑制整个免疫***,可以导致严重感染,且对骨髓、肝和肾具有不利影响。需要更有效的治疗自身免疫病、尤其是III类自身免疫病的方法。另外需要开发更有效的用于治疗癌症和/或自身免疫病的抗体。
本文所述的新颖的组合物和方法可适当地治疗具有免疫学调节异常的其它疾病,例如溶血性贫血, 冷球蛋白血症, 肝炎(尤其是丙型肝炎), 移植物抗宿主病(GVHD) (尤其是在异基因干细胞移植后), 同种致敏 (尤其是器官移植)。现在有越来越多的证据表明,B-细胞参与这些病理学状态,所以通过抗-B-细胞治疗消除B-细胞正在获得关注 (Roccatello 等人, Clin Rev Allergy Immunol
2008, 34: 111-117; Cutler 等人, Blood 2006, 108:756-752; Vo 等人, N Engl J Med 2008, 359:242-251;
Vieira 等人, Transplantation
2004;77:542-548; Abdallah和Prak, Clin. Transpl 2006:427-37; Zaja 等人, Bone Marrow Transplant, 2007,
40:273-77; Saadoun 等人, Curr. Opin. Rheumatol. 2008, 20:23-8; Antonelli 等人, Clin. Exp. Rheumatol.
2008, 26:S39-47)。
发明内容
本发明提供了具有改良的治疗特征的抗-CD20抗体的结构变体和/或其抗原结合片段。在具体实施方案中,所述结构变体可以包含在Kabat位置101的天冬氨酸残基,例如作为在CDR3的VH(CDRH3)中的天冬酰胺残基的替代物。在其它具体实施方案中,所述结构变体可以包含在Kabat位置94的精氨酸残基,其可以与在Kabat位置101的天冬氨酸形成盐桥。在其它具体实施方案中,所述结构变体可以包含在Kabat位置102的缬氨酸残基。技术人员会认识到,可以实现的可能的氨基酸置换不限于上述具体实例,且可以包含在其它和/或不同的Kabat位置处的置换。
改良的治疗特征可以是多种形式,例如更慢的离开靶抗原的解离速率、补体-依赖性的细胞毒性(CDC)的增加、和/或补体-依赖性的细胞毒性(CDC)中EC50的降低。在优选的实施方案中,所述特征可以包括在更低剂量的效能,对于人受试者,优选80 mg或更小的剂量、更优选50 mg或更小的剂量、最优选30 mg或更小的剂量。所述剂量可以施用2次或更多次。优选地,当提供多次给药时,它们间隔约1-3周给药。但是在某种疾病场合,更频繁的分次给药是优选的,例如,在慢性淋巴细胞白血病中,每周2次,持续4周或更多周。
在某些实施方案中,抗-CD20抗体或其抗原结合片段可以是结合人B-细胞标志物的人源化的、嵌合的或人抗体,例如抗-CD20抗体,其用于治疗和诊断B-细胞障碍,例如B-细胞恶性肿瘤和自身免疫病,以及涉及B-细胞的其它疾病,例如GVHD、溶血性贫血、冷球蛋白血症、同种致敏和器官移植排斥,以及某些病毒病,例如丙型肝炎。人源化的、嵌合的或人抗-CD20抗体可以用于治疗哺乳动物受试者(例如人或家养动物)的方法中,作为单独的或与一种或更多种治疗剂相组合的裸抗体,作为用一种或更多种治疗剂和/或诊断剂标记的免疫缀合物,作为抗体融合蛋白,用于使用与一种或更多种治疗剂或诊断剂缀合的可靶向构建体的预靶向方法中,或作为与其它抗体、其它治疗剂或免疫调节剂的多模态治疗(multimodal therapy)。人源化的、嵌合的或人抗-CD20抗体也可以用作诊断成像剂,它是单独的、与其它诊断成像剂相组合和/或与治疗用途相联合。
技术人员会认识到,用于具有改良的治疗特征的序列变体的公开的方法和组合物不限于抗-CD20抗体,且可以适用于抗其它肿瘤相关抗原或自身免疫和其它免疫病-相关的抗原的抗体,包括但不限于碳酸酐酶IX、
、生腱蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体 (R1和R2)、VEGFR、EGFR、PlGF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5和癌基因产物,包括bcl-2、bcl-6、Kras和cMET。
其它实施方案可以指向抗-CD20 MAb或其抗原结合片段,其含有来自超过一种鼠或嵌合抗-CD20 MAb的特定鼠CDR或鼠CDR 的组合。这些MAb 可以是人源化的、嵌合的或人抗-CD20 MAb。CDR序列可以包括、但不限于:轻链CDR序列 ,和重链CDR序列 。
不同的实施方案可以涉及双特异性的抗体或抗体融合蛋白,其包含至少2个抗-CD20 MAb或其抗原结合片段,或包含抗-CD20 MAb或其抗原结合片段的第一种MAb和第二种MAb。第二种MAb可以结合肿瘤-相关的抗原,例如上面列出的那些,或半抗原,例如在可靶向的缀合物上。
其它实施方案可以涉及结合到至少一种治疗剂或至少一种诊断剂上的抗-CD20 MAb或其抗原结合片段或抗体融合蛋白的治疗或诊断缀合物。也包括含有相同或不同类型的多种治疗剂的抗体和融合蛋白。在替代性的实施方案中,抗-CD20抗体、抗原结合片段或融合蛋白可以用于治疗或诊断预靶向方法中,例如使用双特异性抗体,其第一个臂特异性地结合细胞、疾病、组织或病原体 (例如,丙型肝炎-相关的靶抗原),第二个臂结合连接到一种或更多种诊断或治疗剂上的可靶向的缀合物。使用双特异性抗体预靶向的方法是本领域众所周知的 (参见,例如,美国专利号7,300,644、7,138,103、7,074,405、7,052,872、6,962,702、6,458,933,它们各自的实施例部分通过引用并入本文)。
替代性的实施方案可以涉及使用抗-CD20 MAb或其抗原结合片段或抗体融合蛋白进行治疗的方法,它们是单独的,或与一种或更多种其它治疗剂相组合,例如作为含有一种或更多种治疗剂的治疗性免疫缀合物的抗体组分,或作为单独地或与一种或更多种治疗剂组合地施用的裸抗体、抗原结合片段或融合蛋白。也预见到与一种或更多种诊断剂相组合地用于诊断方法的用途。在优选的实施方案中,待诊断或治疗的疾病是B-细胞介导的免疫病、自身免疫病、B-细胞淋巴瘤或白血病。B-细胞介导的免疫病是指自身免疫病的亚类,以及上面讨论的其它免疫病(例如,GVHD, 冷球蛋白血症, 溶血性贫血, 同种致敏, 移植器官排斥),其中疾病状态主要通过自身抗体(而不是通过自体反应的T 淋巴细胞)的生成或通过B-和T-细胞免疫的组合来介导。
附图简述
图1. cA20(一种嵌合的抗-CD20抗体)的可变的轻链(cA20Vk)和可变的重链(cA20VH)序列。用粗体和下划线显示CDR区序列。氨基酸残基和核苷酸被连续地编号,并将相同的编号***用于图2所示的人源化的V序列。轻链可变区显示在图1A中(SEQ ID NO 7和8),重链可变区显示在图1B中(SEQ ID NO 9和10)。将Kabat编号方案用于氨基酸残基。通过字母编号的氨基酸残基表示根据Kabat的***残基,且具有与前面的残基相同的数字。
图2. 分别是hA20轻链hA20Vk (图2A) (SEQ ID NO 11和12)和重链hA20VH1 (图2B) (SEQ ID NO 13和14)的核苷酸和氨基酸序列,以及VKpBR2 (图2A)和VHpBS2 (图2B) 分期载体(staging vector)的邻近的侧接序列。不翻译的核苷酸序列显示为小写。用于亚克隆的限制位点带有下划线,并被指出。分泌信号肽序列用双下划线指出。
图3. cA20 (SEQ ID NO 8和10)、利妥昔单抗 (来自鼠C2B8, SEQ ID NO 15和16)和hA20 (SEQ ID NO 12和14)的可变区序列的对比。小点指示与cA20的同源性。CDR序列位于框中。显示了重链(图3A)和轻链(图3B)可变区序列。
图4. Scatchard 分析——通过125I-标记的MAb与Raji细胞的结合,测定veltuzumab和利妥昔单抗的结合特征。直接的细胞表面饱和结合和Scatchard作图分析(插图)——实心三角形表示veltuzumab; 圆圈表示利妥昔单抗。使用Prism 软件的单位点结合模型,通过非线性回归分析,测定Bmax和Kd。这些结果是3个重复实验之一的代表。
图5. 来自活细胞的veltuzumab和利妥昔单抗的解离速率的对比。用PE-标记的利妥昔单抗 (实心三角形)、veltuzumab (实心正方形)、cA20 (反转的实心三角形)、D101N (实心圆圈)、1F5 (空心圆圈)或B1 (托西莫单抗) (空心正方形)对Daudi (A)、Ramos (B)和Raji (C-E)细胞染色。在有(A-D)或没有(E)过量的veltuzumab Fab' –NEM存在下在37℃温育标记的MAb,并通过流式细胞术随时间分析细胞。通过非线性回归(单相指数式衰减)测定离开速率,并使用GraphPad Prism 软件通过F-检验产生P-值。
图6. veltuzumab和利妥昔单抗对非霍奇金淋巴瘤细胞系的增殖的影响。通过MTT 细胞毒性试验,评估抗增殖效应。在有或没有用于交联的第二抗体存在下,与MAb一起培养细胞。白色条,没有第二抗体;灰色条,具有GAH第二抗体;误差棒,SD。
图7. 来自健康供血者的B-细胞的体外清除。使用流式细胞术,评价veltuzumab对来自健康志愿者的外周血淋巴细胞的影响。显示了用veltuzumab温育健康志愿者的肝素化的全血2天后,在淋巴细胞门(gate)中存在的CD 19+细胞的百分比的降低。每条线代表不同的供血者。误差棒,SD。
图8. 对比腹膜内和皮下给药的弥散性伯基特淋巴瘤异种移植模型中的veltuzumab的存活曲线。在第0天,给C.B. 17 SCID小鼠静脉内施用1.5x107 Daudi细胞。在第1天开始Veltuzumab治疗,小鼠接受veltuzumab的单次腹膜内或单次皮下注射。施用的剂量是60、20或5 μg veltuzumab。对照小鼠接受盐水或60 μg hMN-14 IgG (拉贝珠单抗,抗-CEACAM5 同种型匹配的抗体)的腹膜内注射。
图9. 在弥散性伯基特淋巴瘤异种移植模型中测定veltuzumab的最小有效量。在第0天,给C.B. 17 SCID小鼠静脉内施用1.5x107 Daudi细胞。在第1天开始Veltuzumab治疗,小鼠接受veltuzumab的单次腹膜内注射。施用的剂量是0.5、0.25、0.1或0.05 μg veltuzumab。对照小鼠腹膜内地接受200 μL盐水。
图10. 携带弥散性滤泡细胞淋巴瘤并用递减剂量的veltuzumab治疗的小鼠的代表性的存活曲线。在第0天,给C.B. 17 SCID小鼠静脉内施用2.5x106
WSU-FSCCL细胞。在第5天,小鼠接受35、3.5、0.35或0.035 μg剂量的veltuzumab的单次腹膜内注射。对照小鼠只接受盐水。
图11. 在SCID小鼠中评估了清除NK细胞和嗜中性粒细胞对抗-淋巴瘤活性的影响。如方法部分所述,给C.B. 17 SCID小鼠清除NK和嗜中性粒细胞,并静脉内注射1x106 Raji细胞。在第3天开始veltuzumab治疗,小鼠在第3、5、7和11天静脉内接受200 μg veltuzumab。对照小鼠接受100 μL 盐水。
图12. 血清药代动力学——通过腹膜内或皮下途径,将veltuzumab (150 μg)施用给首次用于实验的Swiss-Webster小鼠。在14-天时段内给动物抽血,并如实施例11所述评估血清的veltuzumab浓度 (N=6)。
图13. 在控制SCID小鼠中的体内淋巴瘤生长中,veltuzumab比利妥昔单抗更有效。通过尾静脉注射,给SCID小鼠接种Raji细胞。在第+5、+10、+15和+20天,小鼠接受10 mg/kg/剂量的利妥昔单抗或veltuzumab (hA20)。与相同剂量的利妥昔单抗治疗相比(P =0.005),Veltuzumab治疗导致明显更长的累积存活时间。
图14. 在非霍奇金淋巴瘤的Veltuzumab效应的人研究中,24个滤泡淋巴瘤反应者的反应持续时间(DR)和恶化时间(TTP)的Kaplan-Meier估测。
图15. 在基线,在输注2、3和4之前,在4和12周后,然后以3个月间隔直至最后一次输注后12个月,测量在不同剂量组中用veltuzumab治疗的NHL患者的B-细胞水平。
发明详述
定义
本文使用的抗体是指全长(即天然的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性的抗原结合部分,如抗体片段。
抗体片段是抗体的一部分,诸如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv 等。抗体片段结合完整抗体识别的相同抗原,与结构无关。例如,抗-CD20 单克隆抗体片段结合CD20。术语“抗体片段”还包括由可变区组成的分离的片段,例如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段、其中轻链和重链可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)以及由氨基酸残基组成的、模拟高变区的最小识别单位。本文使用的术语“抗体片段”不包括没有抗原结合活性的抗体部分,例如Fc 片段。
裸抗体是指没有缀合治疗剂的抗体或其抗原结合片段。抗体分子的Fc部分可以提供效应子功能,例如补体结合和ADCC (抗体依赖性的细胞毒性),它们使可能导致细胞裂解的机理起作用。但是,当其它机理(例如细胞凋亡)起作用时,治疗功能可能不需要Fc部分。裸抗体可以包括多克隆和单克隆抗体、以及重组抗体,例如嵌合的、人源化的或人抗体。
治疗剂是这样的分子或原子,其与抗体部分分别地、同时地或依次地施用,或缀合到抗体部分上,即,抗体或抗体片段或子片段,且可用于治疗疾病。治疗剂的非限制性实例包括抗体、抗体片段、药物、毒素、核酸酶、激素、免疫调节剂、螯合剂、硼化合物、光敏剂、寡核苷酸(例如 反义寡核苷酸或RNAi)和放射性同位素。
诊断剂是可检测的分子或原子,其可以缀合到抗体、抗体片段、可靶向的构建体或用于递送到细胞、组织、病原体或与疾病或医学病症有关的其它靶物的其它部分上。有用的诊断剂包括、但不限于:放射性同位素、超声、染料(诸如生物素-抗生蛋白链菌素复合物)、造影剂、荧光化合物或分子和增强剂(例如用于磁共振成像的顺磁离子)。
免疫缀合物是抗体组分与至少一种治疗剂或诊断剂的缀合物。可以用多种治疗剂和/或诊断剂缀合抗体组分,形成免疫缀合物。
术语抗体融合蛋白可以是指重组生产的抗原结合分子,其中一个或更多个具有相同或不同特异性的相同或不同的单链抗体或抗体片段区段相连接。融合蛋白的效价表示融合蛋白对单个抗原或表位具有多少个结合臂或位点;即单价、二价、三价或多价。抗体融合蛋白的多效价表示,其在结合抗原时可利用多种相互作用,因此增加结合抗原的亲合力。特异性表示抗体融合蛋白能够结合多少个抗原或不同的表位;即单特异性、双特异性、三特异性、多特异性。使用这些定义,天然抗体如IgG是二价的,因为其具有两个结合臂,但是其是单特异性的,因为其结合一个表位类型。单特异性多价融合蛋白对一个表位具有一个以上的结合位点,但仅结合一个表位。融合蛋白可以包含单个抗体组分、不同抗体组分的多价或多特异性组合、或相同抗体组分的多个拷贝。融合蛋白可另外包含抗体或抗体片段和治疗剂。适于这类融合蛋白的治疗剂的实例包括免疫调节剂(“抗体-免疫调节剂融合蛋白”)和毒素(“抗体-毒素融合蛋白”)。一种优选的毒素包括核糖核酸酶(RNA酶),优选重组RNA酶。另一种优选的免疫调节剂融合蛋白是免疫细胞因子,例如使干扰素与本文所述的特异性抗体或多价抗体或多特异性抗体融合。
多特异性抗体是这样的抗体,其可以同时结合至少2种具有不同结构的靶物,例如,2种不同的抗原、在相同抗原上的2种不同的表位、或半抗原和/或抗原或表位。一种特异性可以是针对B-细胞、T-细胞、髓样细胞、浆细胞或肥大细胞抗原或表位。另一种特异性可以是针对相同细胞类型上的不同抗原,例如B-细胞上的CD20、CD19、CD21、CD23、CD37、CD45、CD70、CD79a、CD80、HLA-DR、CD74、MUC1或CD22。多特异性的多价抗体是具有超过一个结合位点的构建体,且结合位点具有不同的特异性。
双特异性抗体是这样的抗体,其可以同时结合2种具有不同结构的靶物。在优选的实施方案中,双特异性抗体(bsAb)和双特异性抗体片段(bsFab)具有至少一个特异性地结合例如B-细胞、T-细胞、髓样细胞、浆细胞或肥大细胞抗原或表位的臂和至少一个特异性地结合携带治疗剂或诊断剂的可靶向缀合物的另外的臂。
改良的抗-CD20抗体
最近10年期间医学治疗的进展已经证实了9种抗体在不同癌症的治疗中的引入 (Sharkey和Goldenberg, CA Cancer J
Clin. 2006, 56:226-243)。大部分这样的新的生物治疗剂与常规的细胞毒性药物联合使用,表明抗体需要额外的措施来提高它们的效能(出处同上)。用利妥昔单抗可以最好地例证,利妥昔单抗是最初被批准为治疗非霍奇金淋巴瘤 (NHL)的单一疗法的第一代嵌合的抗-CD20 单克隆抗体(MAb) (Castillo 等人, Exp Hematol. 2008,
36:755-768)。利妥昔单抗是本领域众所周知的,且可从Biogen/IDEC和Genentech商业得到 (参见,例如,美国专利号5,736,137; 5,776,456;
6,399,061; 6,455,043; 6,846,476)。基于该成就,进行了介绍改良的抗-CD20抗体的工作 (Stein 等人, Clin Cancer Res. 2004,
10:2868-78; Teeling 等人, Blood. 2004, 104:1793-1800; Vugmeyster 等人, J Immunother. 2005,
28:212-219, Umana 等人, Ann Oncol. 2008, 19(Suppl 7), abstract 98; Forero 等人, Proc 99th Ann Meeting of
the Am Assoc Cancer Res, 2008, abstract LB-70; Glennie 等人, Mol Immunol. 2007,
44:3823-37)。
大部分这样的新的抗-CD20 MAb意在减少鼠组分,同时增强FcγR或补体-介导的功能 (Glennie 等人, Mol Immunol. 2007,
44:3823-37; Maloney, Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2007:226-232;
Martin 等人, Semin Hematol. 2008, 45:126-132)。开发成减轻利妥昔单抗所经历的输注-有关的反应的首先的第二代MAb之一是hA20 MAb,现在称作veltuzumab (例如,Qu 等人, Blood 2008, 111:2211-19;
Stein 等人, Clin Cancer Res. 2004,
10:2868-78; 美国专利号7,151,164,其实施例部分通过引用并入本文)。Veltuzumab具有比利妥昔单抗更短的输注时间,同时指示比关于利妥昔单抗所报道的更高的完全反应(CR)比率(Morschhauser 等人, Proc Am Soc Clin Oncol,
J Clin Oncol. 2007, 25(18S):449s; Goldenberg 等人, Proc Amer Soc Clin Oncol, J. Clin.
Oncol. 2008, 26(15S): 142s)。如下面的实施例所述,使用人源化的抗-CD22 MAb、依帕珠单抗或hLL2的主链框架区,重组地工程化veltuzumab (参见,例如,Leung 等人, Mol Immunol. 1995,
32:1413-1427; 美国专利号6,306,393; 6,183,774和7,074,403,各自的实施例部分通过引用并入本文),同时具有与利妥昔单抗相同的轻链CDR、相同的重链CDR1和CDR2,但是不同的CDR3-VH (CDRH3)构建体,如下面的表1所示。
如在下面的实施例中所讨论的,作为序列差异的结果,veltuzumab在下述方面具有独特的特征:在Daudi细胞系中显著提高的补体-依赖性的细胞毒性(CDC),在测试的所有3种淋巴瘤细胞系中更慢的离开速率(与利妥昔单抗相比),和在食蟹猴中的有效的抗-B-细胞活性,和在人淋巴瘤-鼠模型中的疗效,以及在小鼠中的Raji 淋巴瘤异种移植物的明显更好的控制(与利妥昔单抗相比),从而确证了在非常低的剂量在患者中观察到的活性。参见,Goldenberg 等人, 2009, “Properties and
structure-function relationships of veltuzumab (hA20), a humanized anti-CD20
monoclonal antibody,” Blood 113:1062-70。令人惊奇地,如下面的实施例所述,veltuzumab和利妥昔单抗之间的这些功能差异与利妥昔单抗的重链第三个互补性决定区(CDRH3)中的非保守的单个氨基酸变化(Kabat残基 101)有关。这个非保守的变化不会被本领域技术人员所考虑,因为缺少合理的机会,或在指定的特性中成功改良抗体的机会降低。
在不同的实施方案中,本发明提供了人源化的、嵌合的或人抗-CD20抗体及其抗体融合蛋白,其可单独地、作为缀合物或与其它治疗剂(包括其它裸抗体和抗体治疗缀合物)联合施用,用于治疗哺乳动物受试者、人和家养动物。
在优选的实施方案中,本发明的抗-CD20 MAb或其抗原结合片段包含在Kabat位置101的天冬氨酸残基、在Kabat位置94的精氨酸残基、和在CDR3的VH 的Kabat位置102的缬氨酸残基。更优选地,抗-CD20抗体和其抗原结合片段包含veltuzumab的CDR序列,其包含轻链CDR序列 和重链CDR序列 。在最优选的实施方案中,抗-CD20抗体是veltuzumab。
人源化的抗-CD20 MAb或其抗原结合片段可以包含鼠抗-CD20 MAb的CDR (或源自鼠抗-CD20抗体的CDR的序列)和一种或更多种人抗体的轻链和重链可变区的框架(FR)和恒定区,同时保留亲本鼠抗-CD20 MAb的B-细胞、B-细胞淋巴瘤和B-细胞白血病靶向特征。人源化的抗-CD20 MAb或其抗原结合片段可以另外包含至少一个来自亲本鼠MAb的对应FR的氨基酸。具体地,人源化的抗-CD20 MAb或其抗原结合片段可以含有至少一个与图2B所示的重链可变区(hA20VH1, SEQ ID NO: 14)的氨基酸1、5、27、30、38、48、67、68、70、95、115或116相对应的氨基酸残基、和/或至少一个与图2A所示的轻链可变区(hA20Vk, SEQ ID NO: 12)的氨基酸残基 4、21、35、38、45、46、59、99、104或106相对应的氨基酸残基。如果必要,可以在轻链和重链的人FR区中置换鼠框架氨基酸残基,以维持适当结合,或增强与CD20抗原的结合。更优选地,人源化的抗-CD20 MAb或其抗原结合片段包含hA20Vk (SEQ ID NO: 12)和hA2VH1 (SEQ ID NO: 14)的氨基酸序列。
嵌合的抗-CD20 MAb或其抗原结合片段可以包含鼠抗-CD20抗体的可变区序列(或源自鼠抗-CD20抗体),其连接到人抗体恒定区序列上。在优选的实施方案中,嵌合的抗-CD20 MAb的轻链和重链可变区包含图1A和1B所示的cA20Vk (SEQ ID NO:8)和cA20VH (SEQ ID NO: 10)的CDR序列。最优选地,嵌合的抗-CD20 MAb或其抗原结合片段包含cA20Vk (SEQ ID NO:8)和cA20VH (SEQ ID NO: 10)的轻链和重链可变区序列。
某些实施方案可以涉及人抗-CD20 MAb或其抗原结合片段,其基本上具有鼠抗-CD20 MAb 的B-细胞和B-细胞淋巴瘤和白血病细胞靶向和细胞结合特征,其中所述CDR如上面关于图1和2所示的嵌合和人源化的抗-CD20 MAb所述相同。
其它实施方案可以包括抗体融合蛋白或其抗原结合片段,其包含如上所述的至少一种抗-CD20 MAb或其抗原结合片段。抗体融合蛋白或其抗原结合片段也意在包括这样的抗体融合蛋白或其抗原结合片段,其包含至少一个第一种如上所述的抗-CD20 MAb或其抗原结合片段和至少一个第二种除了上述抗-CD20 MAb或其抗原结合片段以外的MAb或其抗原结合片段。更优选地,该第二种MAb是可与下述物质反应的MAb:
、ED-B 纤连蛋白、因子H、FHL-1、Flt-1、Flt-3、叶酸盐受体、GROB、HMGB-1、缺氧诱导的因子(HIF)、HM1.24、胰岛素-样生长因子-1 (ILGF-1)、胰岛素-样生长因子-1 受体 (ILGF-1R)、
、生腱蛋白、T101、TAC、TRAIL-Rl、TRAIL-R2、VEGFR、EGFR、PlGF、补体因子C5和癌基因产物(例如,Kras、cMET、bcl-2、bcl-6)或其组合,和甚至不同于本文所述的抗-CD20 MAb的抗-CD20 MAb。
作为CDR 突变和操作CDR和可变区中的其它序列以得到用于治疗B-细胞障碍的优良治疗剂的结果,人源化的、嵌合的或人抗-CD20抗体可以具有增强的与表位的亲和结合,以及抗肿瘤和抗-B-细胞活性,所述B-细胞障碍包括B-细胞淋巴瘤和白血病和自身免疫病以及涉及B-细胞的其它免疫病 (GVHD、溶血性贫血、器官移植排斥) 。
氨基酸置换
也可能希望修饰氨基酸序列来提高效应子功能,例如,增强抗体-依赖性的、细胞-依赖性的细胞毒性(ADCC)和/或补体-依赖性的细胞毒性(CDC)。可以在Fc区中进行一个或更多个氨基酸置换或引入半胱氨酸,由此提高内化能力和/或增加的补体-依赖性的细胞杀死和ADCC。参见Caron 等人, J. Exp. Med.
176:1191-1195 (1991)和Shopes, Br. J. Immunol. 148:2918-2022 (1992),通过引用并入本文。可以制备具有双重Fc区的抗体融合蛋白,其具有增强的补体溶胞作用和ADCC 能力。
已经报道了增强效应子功能或其它抗体功能特征的Fc区变化 (参见,例如,Lazar 等人, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 2006, 103:4005-10; Stavenhagen 等人, Cancer Res. 2007, 67:8882-90;
Hinton 等人, J. Immunol. 2006,
176:346-56; Idusogie 等人, J. Immunol. 2001, 166:2571-75),且任意这样的已知的Fc区氨基酸置换可以用于要求保护的方法和组合物中。例如,据报道,用在Kabat位置239的天冬氨酸残基置换丝氨酸残基会增强ADCC活性 (Lazar 等人, 出处同上, 2006)。用亮氨酸置换苯丙氨酸243、用脯氨酸置换精氨酸292、用亮氨酸置换酪氨酸300、用异亮氨酸置换缬氨酸305、和用亮氨酸置换脯氨酸396,也被证实会优化ADCC活性 (Stagenhagen等人, 20007)。用谷氨酰胺替换苏氨酸250和用亮氨酸替换蛋氨酸428,导致血清半衰期的明显增加 (Hinton 等人, 出处同上, 2006)。用色氨酸置换赖氨酸326和用丝氨酸置换谷氨酸333,被证实会增加CDC活性 (Idusogie 等人, 出处同上, 2001)。这些和其它已知的增强抗体生理功能的修饰可以与本文所述的可变区序列的变化相组合,以生成具有改良的治疗特征的抗-CD20抗体。
在某些实施方案中,公开的方法和组合物可能包含具有一个或更多个置换的氨基酸残基的抗体或其抗原结合片段的生产和使用。如下面讨论的,制备抗基本上任意靶抗原的单克隆抗体的方法是本领域众所周知的。典型地,它们导致抗靶抗原的鼠抗体的生成。如本领域众所周知的,鼠单克隆抗体的抗原结合特异性主要由超变的互补性决定区(CDR)序列决定。鼠抗体通常包含6个CDR序列,3个在抗体轻链上,3个在重链上。如下面详细描述的,通过诸如CDR移植术等技术,可以构建嵌合的、人源化的或人形式的鼠抗体,在所述CDR移植术中,将鼠CDR序列***例如人抗体框架和恒定区序列,或通过将整个鼠可变区序列连接至人抗体恒定区序列上。在替代性的实施方案中,可以构建抗体的可变区序列,例如,通过编码抗体的整个轻链和重链可变区的寡核苷酸的化学合成和装配。
在不同的实施方案中,通过替换一个或更多个氨基酸残基,可以优化嵌合的、人源化的或人抗体的结构、物理和/或治疗特征。
技术人员会认识到,一般而言,氨基酸置换通常包含,将一个氨基酸替换为具有相对类似性质的另一个氨基酸 (即,保守氨基酸置换)。不同的氨基酸的性质和氨基酸置换对蛋白结构和功能的影响,已经成为本领域的广泛研究和知识的主题。
例如,可以考虑氨基酸的亲水指数 (Kyte和Doolittle, 1982, J. Mol.
Biol, 157:105-132)。氨基酸的相对亲水特征促成得到的蛋白的二级结构,后者又决定蛋白与其它分子的相互作用。基于它的疏水性和电荷特征 (Kyte和Doolittle, 1982),已经为每个氨基酸指定一个亲水指数,它们是:异亮氨酸(+4.5);缬氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);蛋氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);苏氨酸(-0.7);丝氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);组氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺 (-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺 (-3.5);赖氨酸(-3.9);和精氨酸(-4.5)。在产生保守置换时,其亲水指数在±2以内的氨基酸的使用是优选的,在±1内是更优选的,且在±0.5内是甚至更优选的。
氨基酸置换也可以考虑氨基酸残基的亲水性 (例如,美国专利号4,554,101)。已经将亲水性值指定给氨基酸残基: 精氨酸(+3.0);赖氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0);谷氨酸 (+3.0);丝氨酸(+0.3);天冬酰胺 (+0.2);谷氨酰胺 (+0.2);甘氨酸(0);苏氨酸(-0.4);脯氨酸(-0.5 .+-.1);丙氨酸(-0.5);组氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);蛋氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。将氨基酸替换为具有类似亲水性的其它氨基酸是优选的,但是非必要。
其它考虑包括氨基酸侧链的大小。例如,用具有庞大侧链的氨基酸(例如,色氨酸、酪氨酸)替换具有紧凑侧链的氨基酸(例如甘氨酸或丝氨酸),通常不是优选的。也考虑不同氨基酸残基对蛋白二级结构的影响。通过实验研究,已经测定了不同氨基酸残基对蛋白结构域采取α-螺旋、β-折叠或回折二级结构的倾向的影响,且是本领域已知的(参见,例如,Chou和Fasman, 1974,
Biochemistry, 13:222-245; 1978, Ann. Rev. Biochem., 47: 251-276; 1979, Biophys.
J., 26:367-384)。
基于这样的考虑和广泛的实验研究,已经构建出保守氨基酸置换表,且是本领域已知的。例如: 精氨酸和赖氨酸;谷氨酸和天冬氨酸;丝氨酸和苏氨酸;谷氨酰胺和天冬酰胺;和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。或者:
。
氨基酸置换的其它考虑包括,残基是否位于蛋白的内部,或是否暴露于溶剂。对于CDR残基,通常假定在游离抗体中的残基暴露于溶剂。对于内部残基,保守置换包括:Asp和Asn;Ser和Thr;Ser和Ala;Thr和Ala;Ala和Gly;Ile和Val;Val和Leu;Leu和Ile;Leu和Met;Phe和Tyr;Tyr和Trp (参见,例如,PROWL网站,在rockefeller.edu)。对于暴露于溶剂的残基,保守置换包括:Asp和Asn;Asp和Glu;Glu和Gln;Glu和Ala;Gly和Asn;Ala和Pro;Ala和Gly;Ala和Ser;Ala和Lys;Ser和Thr;Lys和Arg;Val和Leu;Leu和Ile;Ile和Val;Phe和Tyr (出处同上)。已经构建出不同的矩阵来辅助氨基酸置换的选择,例如PAM250评分矩阵,Dayhoff矩阵、Grantham矩阵、McLachlan矩阵、Doolittle矩阵、Henikoff矩阵、Miyata矩阵、Fltch矩阵、Jones矩阵、Rao矩阵、Levin矩阵和Risler矩阵 (出处同上)。
在决定氨基酸置换时,也可以考虑分子间或分子内键的存在,例如在带正电荷的残基 (例如,His、Arg、Lys)和带负电荷的残基(例如,Asp、GIu)之间形成离子键(盐桥),或在附近的半胱氨酸残基之间形成二硫键。
包括嵌合的、人源化的或人抗体在内的单克隆抗体的制备
制备抗基本上任意靶抗原的单克隆抗体的技术是本领域众所周知的。参见,例如,Kohler和Milstein, Nature 256: 495
(1975),和Coligan 等人(编), CURRENT PROTOCOLS IN
IMMUNOLOGY, 第1卷, 第2.5.1-2.6.7页 (John Wiley和Sons 1991)。简而言之,单克隆抗体可如下获得:用包含抗原的组合物注射小鼠,取出脾脏以获得B-淋巴细胞,使所述B-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤,克隆所述杂交瘤,选择产生针对所述抗原的抗体的阳性克隆,培养产生针对所述抗原的抗体的克隆,并从所述杂交瘤培养物分离所述抗体。
通过许多充分建立的技术,可以从杂交瘤培养物分离和纯化MAb。此类分离技术包括蛋白-A琼脂糖亲和色谱法、尺寸排阻色谱法、和离子交换色谱法。参见,例如,Coligan第2.7.1-2.7.12页及第2.9.1-2.9.3.页。也参见Baines等, “Purification of
Immunoglobulin G (IgG), ”见METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 第10卷, 第79-104页 (The Humana Press, Inc. 1992)。
在初次引起针对免疫原的抗体后,可对抗体测序,并随后通过重组技术制备。鼠抗体和抗体片段的人源化和嵌合,是本领域技术人员众所周知的。例如,如下生产人源化的单克隆抗体:将小鼠互补决定区从小鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变链转移到人可变结构域中,然后置换鼠对应物的框架区中的人残基。从人源化单克隆抗体衍生出的抗体组分的使用,避免了与鼠恒定区的免疫原性相关的潜在问题。
嵌合抗体
嵌合抗体是一种重组蛋白,其中人抗体的可变区已被替换为例如小鼠抗体的可变区,包括小鼠抗体的互补性决定区(CDR)。在施用给受试者时,嵌合抗体表现出降低的免疫原性和增加的稳定性。用于克隆鼠免疫球蛋白可变结构域的一般技术公开在,例如,Orlandi 等人, Proc. Nat. Acad. Sci.
USA 86: 3833 (1989)。构建嵌合抗体的技术是本领域技术人员众所周知的。作为一个实例, Leung 等人, Hybridoma 13:469 (1994),通过组合编码鼠LL2(一种抗-CD22 单克隆抗体)的Vκ和VH结构域的DNA序列和各个人κ和IgG1恒定区结构域,生产了LL2嵌合体。
人源化的抗体
生产人源化的MAb的技术是本领域众所周知的 (参见,例如,Jones 等人, Nature 321: 522 (1986),
Riechmann 等人, Nature 332: 323 (1988),
Verhoeyen 等人, Science 239: 1534
(1988), Carter 等人, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992), Sandhu, Crit.
Rev. Biotech. 12: 437 (1992),和Singer 等人, J. Immun. 150: 2844
(1993))。通过将小鼠 CDR从小鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变链转移到人抗体的对应可变结构域中,可以人源化嵌合的或鼠的单克隆抗体。在嵌合的单克隆抗体中的小鼠框架区(FR)也被人FR序列替换。因为简单地将小鼠 CDR转移到人FR中经常导致抗体亲和力的降低或甚至消失,为了恢复鼠抗体的原始亲和力,可能需要额外的修饰。这可如下实现:用其鼠对应物替换FR区中的一个或更多个某些人残基,以获得对其表位具有良好结合亲和力的抗体。参见,例如,Tempest等, Biotechnology 9: 266
(1991)和Verhoeyen等, Science 239: 1534 (1988)。通过选择的CDR序列的修饰,也可以增加人源化的抗体对靶物的亲和力(WO0029584A1)。
人抗体
使用组合方案或用人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物生产全人抗体的方法是本领域已知的(例如,Mancini 等人, 2004, New Microbiol.
27:315-28; Conrad和Scheller, 2005, Comb. Chem. High Throughput Screen. 8:117-26; Brekke和Loset, 2003, Curr. Opin.
Phamacol. 3:544-50)。通过遗传或染色体转染方法,以及噬菌体展示技术,也可以构建全人抗体,所述方法都是本领域已知的。参见例如,McCafferty 等人, Nature 348:552-553
(1990)。预期这些全人抗体表现出甚至比嵌合的、人源化的或人抗体更少的副作用,并如基本内源的人抗体一样在体内起作用。在某些实施方案中,要求保护的方法和规程可以利用通过这些技术产生的人抗体。
在一个替代方法中,可使用噬菌体展示技术产生人抗体(例如Dantas-Barbosa 等人, 2005, Genet. Mol.
Res. 4:126-40)。人抗体可由正常人或表现出特定疾病状态如癌症的人产生(Dantas-Barbosa等人, 2005)。构建来自患病个体的人抗体的优势在于,循环抗体库可偏向于抗疾病相关抗原的抗体。
在该方法的一个非限制性实例中,Dantas-Barbosa等人(2005)构建了来自骨肉瘤患者的人Fab抗体片段的噬菌体展示文库。一般来说,从循环血淋巴细胞获得总RNA (出处同上)。由μ、γ和κ链抗体库克隆重组Fab,并***到噬菌体展示文库中(出处同上)。将RNA转化为cDNA,并用于制备Fab cDNA文库,其中使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引物 (Marks等人, 1991, J. Mol. Biol. 222:581-97)。按照Andris-Widhopf等人(2000, 载于: Phage Display
Laboratory Manual, Barbas等(编辑), 第1版, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 第9.1至9.22页),进行文库构建。用限制性内切核酸酶消化最终的Fab片段,并***到噬菌体基因组中,以制备噬菌体展示文库。这些文库可通过本领域已知的标准噬菌体展示方法筛选。噬菌体展示可以以多种形式进行,关于它们的综述,参见例如,Johnson和Chiswell, Current Opinion
in Structural Biology 3:5564-571 (1993)。人抗体也可以由体外活化的B-细胞产生。参见美国专利号5,567,610和5,229,275,它们各自的实施例部分通过引用并入本文。技术人员会认识到,这些技术仅是示例性的,用于制备和筛选人抗体或抗体片段的任何已知方法都可使用。
在另一个替代方法中,使用标准免疫方案,可以用已被遗传工程化成生产人抗体的转基因动物产生抗基本上任意免疫原性靶物的抗体。从转基因小鼠得到人抗体的方法公开在,Green 等人, Nature Genet. 7:13
(1994), Lonberg 等人, Nature 368:856 (1994),和Taylor 等人, Int. Immun. 6:579 (1994)。这类***的一个非限制性实例是从Abgenix (Fremont, CA)得到的XenoMouse® (例如Green等, 1999, J. Immunol.
Methods 231:11-23,该文献通过引用并入本文)。在XenoMouse®和类似的动物中,小鼠抗体基因已被灭活,并由功能性人抗体基因替代,而小鼠免疫***的余下部分保持完整。
用含人IgH和Igκ基因座部分的种系配置的(germline- configured) YAC
(酵母人工染色体)转化XenoMouse®,所述基因座部分包括大部分可变区序列以及辅助基因和调节序列。人可变区库可用于获得产抗体的B细胞,所述B细胞可通过已知技术被加工为杂交瘤。用靶抗原免疫的XenoMouse®将通过正常的免疫反应产生人抗体,所述人抗体可通过上面讨论的标准技术来收集和/或生产。可得到多种XenoMouse®品系,其中每种都能够生产不同种类的抗体。已经证实,转基因生产的人抗体具有治疗潜力,同时保留正常人抗体的药代动力学特性(Green等人, 1999)。技术人员会认识到,要求保护的组合物和方法不限于使用XenoMouse®***,而是可利用已被遗传工程化成生产人抗体的任意转基因动物。
抗体片段的生产
识别特定表位的抗体片段可通过已知的技术产生。所述抗体片段是抗体的抗原结合部分,例如F(ab')2、Fab'、F(ab)2、Fab、Fv、scFv 等等。F(ab')2 片段可通过胃蛋白酶消化抗体分子产生,Fab' 片段可通过还原F(ab')2 片段的二硫桥产生。或者,可构建Fab' 表达文库(Huse等人, 1989, Science 246:
1274-1281),以允许快速且容易地鉴定具有期望特异性的单克隆Fab' 片段。
单链Fv分子(scFv)包含VL结构域和VH结构域。VL和VH结构域结合,形成靶物结合位点。这两个结构域进一步通过肽接头(L)共价连接。用于制备scFv分子和设计合适的肽接头的方法,描述在美国专利号4,704,692、美国专利号4,946,778、 R. Raag和M. Whitlow, “Single Chain Fvs. ” FASEB 第9卷: 73-80 (1995)以及R. E. Bird和B. W. Walker, “Single Chain Antibody
Variable Regions”, TIBTECH 第9卷: 132-137 (1991)中,它们通过引用并入本文。
通过全长抗体的蛋白水解,或通过在大肠杆菌或另一种宿主中表达编码片段的DNA,可以制备抗体片段。通过常规方法,通过全长抗体的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化,可以获得抗体片段。例如,使用木瓜蛋白酶的酶切割产生两个单价Fab片段和一个Fc片段。这些方法描述在,例如,Goldenberg美国专利号4,036,945和4,331,647及其中所含的参考文献,所述专利通过引用并入本文。还参见Nisonoff等, Arch Biochem. Biophys.
89: 230(1960); Porter, Biochem. J. 73: 119 (1959), Edelman等, 见METHODS IN ENZYMOLOGY, 第1卷, 第422页(Academic Press1967)以及Coligan第2.8.1-2.8.10页和第2.10. -2.10.4页。
双特异性和多特异性抗体
双特异性抗体可用于许多生物医学用途中。例如,具有对肿瘤细胞表面抗原和T-细胞表面受体的结合位点的双特异性抗体可以指导T细胞对特定肿瘤细胞的溶胞作用。识别神经胶质瘤和在T细胞上的CD3 表位的双特异性抗体已经成功地用于治疗人患者的脑肿瘤 (Nitta, 等人, Lancet 1990;
355:368-371)。使用双特异性抗体的预靶向方法也是本领域众所周知的,所述双特异性抗体包含肿瘤相关抗原(TAA)或其它疾病靶标的至少一个结合位点,以及与治疗剂或诊断剂缀合的用于可靶向的构建体的至少一个结合位点 (参见,例如,美国专利号7,300,644; 7,138,103;
7,074,405; 7,052,872; 6,962,702; 6,458,933,它们各自的实施例部分通过引用并入本文)。
可以使用包含任意已知抗-TAA抗体的抗原结合可变区序列的双特异性抗体,包括但不限于 hPAM4 (美国专利号7,282,567)、hA20 (美国专利号7,251,164)、hA19 (美国专利号7,109,304)、hIMMU31 (美国专利号7,300,655)、hLLl (美国专利号7,312,318)、hLL2 (美国专利号7,074,403)、hMu-9 (美国专利号7,387,773)、hL243 (美国专利申请号11/368,296)、hMN-14 (美国专利号6,676,924)、hRS7 (美国专利号7,238,785)、hMN-3 (美国专利申请系列号10/672,278)和hR1(2009年1月20日提交的美国临时专利申请系列号61/145,896),每篇引用的专利或申请的实施例部分通过引用并入本文。
其它有用的抗体可以从多种已知来源商业上获得。例如,多种分泌抗体的杂交瘤系可从美国典型培养物保藏中心 (ATCC, Manassas, VA)得到。抗不同的疾病靶物(包括但不限于肿瘤-相关抗原)的大量抗体已经保藏在ATCC,和/或具有公开的可变区序列,且可用于要求保护的方法和组合物中。参见,例如,美国专利号
它们各自的实施例部分通过引用并入本文。这些仅是示例性的,多种其它的抗体和它们的杂交瘤是本领域已知的。技术人员会认识到,通过简单地搜索ATCC、NCBI和/或USPTO数据库中针对选择的目标疾病相关靶物的抗体,可以得到针对几乎任意疾病相关抗原的抗体序列或分泌抗体的杂交瘤。使用本领域众所周知的标准技术,可以扩增克隆的抗体的抗原结合域,切割,连接进表达载体中,转染入适应的宿主细胞中,并用于蛋白生产。
生产双特异性或多特异性抗体的许多方法是已知的,公开在例如,2004年2月11日提交的美国专利申请公开号20050002945中,其实施例部分通过引用并入本文。通过细胞杂交瘤方法,可以生产双特异性抗体,所述细胞杂交瘤方法包括融合2种不同的杂交瘤,每种生产识别不同抗原位点的单克隆抗体 (Milstein和Cuello, Nature, 1983;
305:537-540)。
另一种生产双特异性抗体的方法使用异型双功能交联物来化学地连接2种不同的单克隆抗体(Staerz, 等人, Nature 1985;
314:628-631; Perez, 等人, Nature 1985; 316:354-356)。通过将2个亲本单克隆抗体中的每一个还原成各自的半分子,然后将它们混合,并进行重新氧化以得到杂交结构,也可以生产双特异性抗体(Staerz和Bevan, Proc Natl Acad Sci
USA 1986; 83:1453-1457)。另一种替代方法包含,使用适当的接头,化学地交联2个或3个分别纯化的Fab'片段 (参见,例如,欧洲专利申请0453082)。
其它方法包括,如下提高产生杂种杂交瘤的效率:通过逆转录病毒-衍生的穿梭载体,将不同的选择标记基因转移进各个亲本杂交瘤中,随后融合它们(DeMonte, 等人, Proc Natl Acad Sci USA
1990, 87:2941-2945);或用含有不同抗体的重链和轻链基因的表达质粒转染杂交瘤细胞系。
可以用具有适当组成和长度(通常由超过12个氨基酸残基组成)的肽接头连接同源的VH和VL结构域,形成具有结合活性的单链Fv (scFv)。生产scFv的方法公开在美国专利号4,946,778和美国专利号5,132,405中,它们各自的实施例部分通过引用并入本文。使肽接头长度降低至小于12个氨基酸残基,会预防在相同链上的VH和VL结构域配对,并迫使VH和VL结构域与在其它链上的互补结构域配对,导致功能多聚体的形成。用3至12个氨基酸残基的接头连接的VH和VL结构域的多肽链主要形成二聚体(称作双体)。对于0至2氨基酸残基的接头,三聚体(称作三体)和四聚体 (称作四体)是有利的,但是寡聚化的准确模式似乎依赖于组成和V-结构域的朝向 (VH-接头-VL或VL-接头-VH),以及接头长度。
在低产率、纯化的必要性、低稳定性或技术的劳动密集性方面,这些用于生产多特异性或双特异性抗体的技术表现出不同的困难。最近,称作“对接并锁定(dock and lock)”(DNL)的技术已经被用于生产基本上任意希望的抗体、抗体片段和其它效应分子的组合 (参见,例如,美国专利申请公开号20060228357 (现在授权的美国专利7,550,143); 20060228300 (现在授权的美国专利7,521,056); 20070086942 (现在授权的美国专利7,534,866); 20070140966 (现在授权的美国专利7,527,787); 20070264265和20090060862和2009年4月8日提交的USSN 12/418,877,它们各自的实施例部分通过引用并入本文)。该技术利用互补的蛋白结合域,称作锚定结构域和二聚化和对接结构域,它们彼此结合,并允许装配复合结构,范围为二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体。它们以高产率形成稳定的复合物,不需要广泛纯化。该DNL技术允许装配单特异性的、双特异性的或多特异性的抗体,作为裸抗体部分,或与广范围的其它效应分子(诸如免疫调节剂、酶、化疗剂、趋化因子、细胞因子、诊断剂、治疗剂、放射性核素、成像剂、抗血管生成剂、生长因子、寡核苷酸、激素、肽、毒素、促凋亡剂或其组合)相组合。本领域已知的用于生产双特异性或多特异性抗体的任意技术,可以用于实践现在要求保护的方法。
预靶向
双特异性或多特异性抗体可以用于预靶向技术中。预靶向是最初被开发用于分辨直接靶向抗体的缓慢血液清除率的多步骤方法,所述靶向抗体促成对诸如骨髓等正常组织的不希望的毒性。利用预靶向,将放射性核素或其它治疗剂连接到在数分钟内从血液清除的小递送分子(可靶向的构建体或可靶向的缀合物)上。首先施用预靶向双特异性或多特异性抗体,其具有可靶向的构建体以及靶抗原的结合位点,使游离的抗体从循环清除,然后施用可靶向的构建体。
预靶向方法是本领域众所周知的,例如,公开在,Goodwin 等人, 美国专利号4,863,713; Goodwin 等人, J. Nucl. Med. 29:226,
1988; Hnatowich 等人, J. Nucl. Med. 28:1294, 1987; Oehr 等人, J. Nucl. Med. 29:728,
1988; Klibanov 等人, J. Nucl. Med. 29:1951, 1988; Sinitsyn 等人, J. Nucl. Med. 30:66,
1989; Kalofonos 等人, J. Nucl. Med. 31:1791, 1990; Schechter 等人, Int. J. Cancer 48:167 ,
1991; Paganelli 等人, Cancer Res. 51:5960, 1991; Paganelli 等人, Nucl. Med. Commun.
12:211, 1991; 美国专利号5,256,395; Stickney 等人, Cancer Res. 51:6650,
1991; Yuan 等人, Cancer Res. 51:3119,
1991; 美国专利号6,077,499; 美国系列号09/597,580; 美国系列号10/361,026; 美国系列号09/337,756; 美国系列号09/823,746; 美国系列号10/116,116; 美国系列号09/382,186; 美国系列号10/150,654; 美国专利号6,090,381; 美国专利号6,472,511; 美国系列号10/114,315; 美国临时申请号 60/386,411; 美国临时申请号 60/345,641; 美国临时申请号 60/3328,835; 美国临时申请号 60/426,379; 美国系列号09/823,746; 美国系列号09/337,756; 美国临时申请号 60/342,103;和美国专利号6,962,702。
治疗或诊断受试者的疾病或障碍的预靶向方法可以如下提供:(1) 给受试者施用双特异性抗体或结合抗原的抗体片段; (2) 任选地给受试者施用清除组合物,并使所述组合物从循环清除抗体;和(3) 给受试者施用可靶向的构建体,其含有一种或更多种螯合的或化学结合的治疗剂或诊断剂。所述技术也可以用于抗体依赖性的酶前药治疗(ADEPT) ,其通过施用缀合到可靶向的构建体上的酶,随后施用前药,其被所述酶转化成活性形式。
治疗剂和诊断剂
在某些实施方案中,本文所述的抗体、结合抗原的抗体片段或融合蛋白可以单独施用,作为“裸”抗体、其抗原结合片段或融合蛋白。在替代性的实施方案中,在至少一种其它治疗剂之前、同时或之后,可以施用抗体、其抗原结合片段或融合蛋白。在其它替代方案中,可以将抗体、其抗原结合片段或融合蛋白共价地或非共价地连接到至少一种治疗剂和/或诊断剂上,形成免疫缀合物。
诊断剂优选地选自:放射性核素、放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光敏剂。这样的诊断剂是众所周知的,且可以使用任意这样的已知的诊断剂。诊断剂的非限制性实例可以包括放射性核素,诸如
或其它γ-、β-或正电子发射体。使用的顺磁离子可以包括:铬(III)、锰 (II)、铁 (III)、铁 (II)、钴 (II)、镍(II)、铜(II)、钕 (III)、钐 (III)、镱 (III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III)。金属造影剂可以包括镧(III)、金(III)、铅(II)或铋(III)。超声造影剂可以包含脂质体,例如气体填充的脂质体。不透射线的诊断剂可以选自:钡化合物、镓化合物和铊化合物。多种荧光标记是本领域已知的,包括但不限于异硫氰酸荧光素, 罗丹明, 藻红蛋白, 藻蓝蛋白, 别藻蓝蛋白, 邻苯二醛和荧光胺。使用的化学发光的标记可以包括:鲁米诺、异氨基苯二酰肼、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶盐或草酸酯。
治疗剂优选地选自:放射性核素、免疫调节剂、抗血管生成剂、细胞因子、趋化因子、生长因子、激素、药、前药、酶、寡核苷酸、干扰RNA、促凋亡剂、光敏治疗剂、细胞毒性剂(其可以是化疗剂或毒素)、第二抗体或其片段和其组合。使用的药物可以具有选自下述的药学性质:抗有丝***剂、抗激酶、烷基化剂、抗代谢物、抗生素、生物碱、抗血管生成剂、促凋亡剂及其组合。
使用的示例性的药物包括、但不限于:5-氟尿嘧啶、aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环类、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、Cox-2 抑制剂、依立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、camptothecans、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西他赛、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、2-吡咯啉并阿霉素(2P-DOX)、氰基-吗啉并多柔比星、多柔比星葡萄糖醛酸苷、表柔比星葡萄糖醛酸苷、雌氮芥、epidophyllotoxin、***受体结合剂、依托泊苷 (VP16)、依托泊苷葡萄糖醛酸苷、依托泊苷磷酸酯、氟尿苷 (FUdR)、3',5'-O-二油酰基-FudR (FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、lenolidamide、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯嘌呤、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、硝基脲、plicomycin、丙卡巴肼、紫杉酚、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、链佐星、他莫昔芬、紫杉酚、temazolomide (DTIC的水溶液形式)、transplatinum、沙立度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨、长春碱、长春新碱和长春花生物碱。
使用的毒素可以包括蓖麻蛋白、相思豆毒蛋白、α 毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶),例如,onconase、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌属外毒素和假单胞菌属内毒素。
使用的免疫调节剂可以选自:细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素 (IFN)、***、血小板生成素和其组合。特别有用的是淋巴毒素诸如肿瘤坏死因子(TNF)、造血因子诸如白介素 (IL)、集落刺激因子诸如粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素诸如干扰素-α、-β或-γ和干细胞生长因子诸如指定为“S1因子”的生长因子。细胞因子包括生长激素类诸如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素;甲状旁腺激素;甲状腺素;胰岛素;胰岛素原;松弛素;松弛素原;糖蛋白激素诸如滤泡刺激激素(FSH)、促甲状腺激素 (TSH)和促黄体激素 (LH);肝生长因子;***素、成纤维细胞生长因子;催乳素;胎盘催乳激素、OB 蛋白;肿瘤坏死因子-α和-β;副中肾管抑制物质;小鼠促性腺素相关肽;抑制素;激活素;血管内皮生长因子;整联蛋白;血小板生成素 (TPO);神经生长因子诸如NGF-β;血小板-生长因子;转化生长因子(TGF) 诸如TGF-α和TGF-β;胰岛素-样生长因子-I和-II;*** (EPO);骨诱导因子;干扰素诸如干扰素-α、-β和-γ;集落刺激因子(CSF) 诸如巨噬细胞-CSF (M-CSF);白介素 (IL) 诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12;IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、kit-配体或FLT-3、Flt-1、血管他丁、凝血酶敏感蛋白、内皮他丁、肿瘤坏死因子(TNF,例如TNF-α)和LT。本文使用的术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白和天然序列细胞因子的生物活性等效物。
使用的趋化因子包括RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β和IP-10。
可用于治疗患病组织的放射性同位素包括、但不限于:
。治疗性放射性核素优选地具有20至6,000 keV、优选60至200 keV(对于Auger发射体)、100至2,500 keV(对于β发射体)和4,000-6,000 keV(对于α发射体)的衰变能。有用的β-粒子-发射核素的最大衰变能优选是20-5,000 keV、更优选100-4,000 keV、最优选500-2,500 keV。还优选的是基本上伴随Auger –发射粒子衰变的放射性核素。例如,Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、I-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。有用的β-粒子-发射核素的衰变能优选< 1,000 keV、更优选< 100 keV、最优选< 70 keV。还优选的是基本上伴随α-粒子产生而衰变的放射性核素。此类放射性核素包括但不限于:Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。有用的α-粒子-发射放射性核素的衰变能优选2,000-10,000 keV、更优选3,000-8,000 keV、最优选4,000-7,000 keV。使用的其它潜在放射性同位素包括
治疗剂可以包括光敏剂或染料。荧光组合物如荧光染料及其它色原体或染料如对可见光敏感的卟啉,已经用于检测和治疗病变,其中通过将合适的光引导到病变处。在治疗中,这已被称为光辐射、光疗或光动力学疗法,参见Jori等 (编), PHOTODYNAMIC THERAPY OF
TUMORS AND OTHER DISEASES(Libreria Progetto 1985); van den Bergh, Chem. Britain
(1986), 22:430。此外,单克隆抗体已经与光活化染料偶联,用于实现光疗。参见Mew 等人, J. Immunol. (1983),
130:1473; 同作者, Cancer Res. (1985),
45:4380; Oseroff 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986), 83:8744; 同作者, Photochem. Photobiol.
(1987), 46:83; Hasan 等人, Prog. Clin. Biol. Res. (1989), 288:471; Tatsuta 等人, Lasers Surg. Med.
(1989), 9:422; Pelegrin 等人, Cancer (1991), 67:2529。
皮质类固醇激素可以增加其它化疗剂的有效性,因此,它们经常用于联合治疗中。***和***是皮质类固醇激素的实例。
在某些实施方案中,可以使用抗血管生成剂,例如血管他丁、baculostatin、canstatin、乳腺丝抑蛋白、抗-VEGF抗体、抗-PIGF肽和抗体、抗-血管生长因子抗体、抗-Flk-1抗体、抗-Flt-1抗体和肽、抗-Kras抗体、抗-cMET抗体、抗-MIF (巨噬细胞迁移-抑制因子)抗体、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原活化剂抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素-12、IP-10、Gro-β、凝血酶敏感蛋白、2-甲氧基***、增殖蛋白相关蛋白、carboxyamidotriazole、CM101、马立马司他、戊聚糖聚硫酸酯、血管生成素-2、干扰素-α、除草霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利诺胺、沙立度胺、己酮可可碱、染料木黄酮、TNP-470、内皮他丁、紫杉酚、accutin、血管他丁、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子4或米诺环素。
其它有用的治疗剂包括寡核苷酸,尤其是反义寡核苷酸,其优选地针对B-细胞恶性肿瘤的癌基因和癌基因产物,例如bcl-2。优选的反义寡核苷酸包括已知为siRNA或RNAi的那些。
免疫缀合物
本文所述的任意抗体、结合抗原的抗体片段或抗体融合蛋白可以缀合到一种或更多种治疗剂或诊断剂上。治疗剂不需要是相同的、但是可以是不同的例如药物和放射性同位素。例如,可以将131I掺入抗体或融合蛋白的酪氨酸,并将药物连接到赖氨酸残基的ε氨基上。也可以将治疗剂和诊断剂连接到例如还原的SH基团上和/或碳水化合物侧链上。许多制备治疗剂或诊断剂与抗体或融合蛋白的共价或非共价缀合物的方法是本领域已知的,且可以使用任意这样的已知的方法。
治疗剂或诊断剂可以经由二硫键形成连接至还原的抗体组分的铰链区。或者,使用异型双功能交联物,如N-琥珀酰3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP),可以连接此类试剂。Yu等, Int. J. Cancer 56: 244
(1994)。用于此类缀合的一般技术是本领域众所周知的。参见,例如,Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN
CONJUGATION AND CROSS-LINKING (CRC Press 1991); Upeslacis 等人, “Modification of Antibodies
by Chemical Methods,”见MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch 等人(编), 第187-230 页(Wiley-Liss, Inc. 1995);
Price, “Production and
Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies,”见MONOCLONAL ANTIBODIES:
PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter 等人(编), 第60-84页 (Cambridge University
Press 1995)。或者,治疗剂或诊断剂可经由碳水化合物部分缀合到抗体的Fc区上。所述碳水化合物基团可用于增大结合在硫醇基团上的相同药剂的荷载,或者所述碳水化合物部分可用于结合不同的治疗剂或诊断剂。
经由抗体碳水化合物部分将肽缀合到抗体组分上的方法是本领域技术人员众所周知的。参见,例如,Shih等, Int. J Cancer 41: 832
(1988); Shih等, Int. J. Cancer 46: 1101
(1990); 以及Shih等,美国专利号5,057,313,通过引用并入本文。一般方法包括,使具有氧化的碳水化合物部分的抗体组分与具有至少一个游离胺官能团的载体聚合物反应。所述反应产生最初的希夫碱(亚胺)键,其可通过还原为仲胺而稳定化,形成最终的缀合物。
如果用作免疫缀合物的抗体组分的抗体是结合抗原的抗体片段,则Fc区不存在。但是,可能向全长抗体或结合抗原的抗体片段的轻链可变区中引入碳水化合物部分。参见,例如,Leung等, J. Immunol. 154: 5919
(1995); Hansen 等人, 美国专利号5,443,953 (1995), Leung 等人, 美国专利号6,254,868,各自通过引用并入本文。使用所述工程化的碳水化合物部分连接治疗剂或诊断剂。
在有些实施方案中,可以将螯合剂连接至抗体、结合抗原的抗体片段或融合蛋白上或可靶向的构建体上,并用于螯合治疗剂或诊断剂,例如放射性核素。示例性的螯合剂包括、但不限于,DTPA (诸如Mx-DTPA)、DOTA、TETA、NETA或NOTA。缀合和使用螯合剂来连接金属或其它配体到蛋白上的方法,是本领域众所周知的 (参见,例如,美国专利申请系列号12/112,289,其实施例部分通过引用并入本文)。
在某些实施方案中,通过与具有长尾巴的试剂反应,可以将放射性金属或顺磁离子连接到蛋白或肽上,所述长尾巴可以连接多个用于结合离子的螯合基团。这样的尾巴可以是聚合物,诸如聚赖氨酸、多糖或其它衍生的或可衍生的具有侧基的链,所述侧基可以连接螯合基团,例如,乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、卟啉类、聚胺类、冠醚、二-缩氨基硫脲、聚肟、和已知可用于该目的的类似基团。
螯合物可以直接连接到抗体或肽上,例如在美国专利4,824,659中公开的,其通过引用并入本文。特别有用的金属-螯合物组合包括2-苄基-DTPA和它的单甲基和环己基类似物,它们与一般能量范围为60-4,000 keV的诊断同位素一起使用,例如 ,用于放射成像。当与非放射性金属(例如锰、铁和钆)络合时,同一螯合物可以用于MRI。大环螯合物(例如NOTA、DOTA和TETA)可以与多种金属和放射金属一起使用,尤其是分别与镓、钇和铜的放射性核素一起使用。通过修整环大小以适于目的金属,可以使此类金属-螯合物络合物非常稳定。包括其它环型螯合物,例如大环聚醚,其可用于稳定地结合核素,例如用于RAIT的223Ra。
最近,已经公开了在PET扫描技术中使用的18F-标记的方法,例如通过F-18与金属或其它原子(例如铝)的反应。18F-Al缀合物可以与直接连接到抗体上的螯合基团(例如DOTA、NOTA或NETA)络合,或用于在预靶向方法中标记可靶向的构建体。这样的F-18标记技术公开在美国专利申请系列号12/112,289中,其实施例部分通过引用并入本文。
治疗性处理的方法
不同的实施方案涉及治疗受试者(例如哺乳动物,包括人、家养宠物或伴侣宠物,例如狗和猫)的B-细胞淋巴瘤或白血病细胞病或自身免疫病的方法,其包含,给受试者施用治疗有效量的抗体、其抗原结合片段或融合蛋白。在优选的实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段是抗-CD20 MAb。在某些实施方案中,所述治疗可以使用没有与治疗剂结合的“裸抗体”。
通过同时或依次施用治疗有效量的与在靶细胞表面上的另一种抗原结合或反应的另一种“裸抗体”,可以补充“裸”抗-CD20抗体的施用。优选的其它MAb包括至少一种选自可与下述物质反应的MAb的人源化的、嵌合的或人MAb:
生腱蛋白、Flt-1、Flt-3、VEGFR、PlGF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、生腱蛋白、MIF、补体因子C5、癌基因、癌基因产物、bcl-2、bcl-6、Kras、cMET或其组合。
通过同时或依次施用至少一种上面讨论的治疗剂,可以进一步补充单独的或与其它裸MAb组合的裸抗-CD20治疗。多模态治疗可以包括,通过施用裸抗体、融合蛋白形式或作为免疫缀合物的抗-CD22、抗-CD 19、抗-CD21、抗-CD74、抗-CD80、抗-CD23、抗-CD45或HLA-DR (包括不变链)抗体,补充裸抗-CD20抗体的治疗。免疫缀合物可以包括,与一种或更多种任意的上面讨论的治疗剂和/或诊断剂缀合的抗体或其抗原结合片段。也可以用针对在某些B-细胞上表达的MUC1抗原的裸抗体,补充裸抗-CD20抗体或其抗原结合片段。使用的不同抗体,例如抗-CD19和抗-CD22抗体,是本领域技术人员已知的。参见,例如,Ghetie 等人, Cancer Res. 48:2610
(1988); Hekman 等人, Cancer Immunol. Immunother. 32:364 (1991); Longo, Curr.
Opin. Oncol. 8:353 (1996), 美国专利号5,798,554; 6,187,287; 6,306,393; 6,676,924; 7,109,304;
7,151,164; 7,230,084; 7,230,085; 7,238,785; 7,238,786; 7,282,567; 7,300,655;
7,312,318;和美国专利申请公开号20080131363; 20080089838;
20070172920; 20060193865; 20060210475; 20080138333;和20080146784,每篇列出的专利或专利申请的实施例部分通过引用并入本文。
在多模态治疗的另一个形式中,受试者接受裸抗-CD20抗体和/或免疫缀合物,其与标准的癌症化疗相结合。例如,“CVB”(1.5 g/m2环磷酰胺、200-400 mg/m2 依托泊苷和150-200 mg/m2 卡莫司汀)是用于治疗非霍奇金淋巴瘤的一个方案。Patti 等人, Eur. J. Haematol. 51: 18
(1993)。其它合适的联合化疗方案是本领域技术人员众所周知的。参见,例如,Freedman 等人, “Non-Hodgkin's Lymphomas,”见CANCER MEDICINE, 第2卷, 第3版, Holland 等人(编), 第2028-2068页 (Lea和Febiger 1993)。作为例证,用于治疗中间等级的非霍奇金淋巴瘤 (NHL)的第一代化疗方案包括:C-MOPP (环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴肼和***)和CHOP (环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和***)。有用的第二代化疗方案是m-BACOD (甲氨蝶呤、博来霉素、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、***和亚叶酸),而合适的第三代方案是MACOP-B (甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、***、博来霉素和亚叶酸)。其它有用的药物包括丁酸苯酯、苯达莫司汀和苔藓抑素-1。在一个优选的多模态治疗中,共同施用化疗药物和细胞因子与抗体、免疫缀合物或融合蛋白,后者优选地包含抗-CD20抗体或其抗原结合片段。通常,共同施用是指同时施用2种或更多种药剂,例如抗体和治疗剂。细胞因子、化疗药物和抗体或免疫缀合物可以以任意次序或一起施用。
根据已知的制备药学上有用的组合物的方法,可以配制免疫缀合物或裸抗体,其中使免疫缀合物或裸抗体在含有药学上合适的赋形剂的混合物中混合。无菌的磷酸盐缓冲盐水是药学上合适的赋形剂的一个实例。其它合适的赋形剂是本领域技术人员众所周知的。参见,例如,Ansel等, PHARMACEUTICAL DOSAGE
FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 第5版 (Lea和Febiger 1990), 和Gennaro (编), REMINGTON'S
PHARMACEUTICAL SCIENCES, 第18版 (Mack Publishing Company
1990),以及它们的修订版。
免疫缀合物或裸抗体可以配制成用于静脉内给药,例如经由快速浓注和连续输注。优选地,抗体在小于约4小时的时段内、更优选小于约3小时的时段内输入。例如,前25-50 mg可以在30分钟内、优选地甚至15 min内输入,剩余量在接下来的2-3小时内输入。注射用制剂可以作为单位剂型存在,例如,在安瓿中,或在多剂量容器中,其加有防腐剂。所述组合物可采取诸如混悬液、溶液或在油性或水性载体中的乳剂等形式,并且可以含有配制剂,诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者,活性成分可以是粉末剂形式,用于在使用前与合适的载体(如无菌无热原的水)配制。
可采用其它制药方法来控制治疗性或诊断性缀合物或裸抗体的作用持续时间。通过使用聚合物络合或吸收免疫缀合物或裸抗体,可以制备控释制品。例如,生物相容的聚合物包括聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)基质以及硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酸酐共聚物基质。Sherwood等, Bio/Technology 10:
1446(1992)。免疫缀合物或抗体从这样的基质的释放速率,取决于免疫缀合物或抗体的分子量、基质内免疫缀合物、抗体的量、以及分散颗粒的大小。Saltzman等, Biophys. J. 55: 163
(1989); Sherwood等, 同上。其它固体剂型描述在Ansel等, PHARMACEUTICAL DOSAGE
FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 第5版 (Lea和Febiger 1990),和Gennaro (编), REMINGTON'S
PHARMACEUTICAL SCIENCES, 第18版 (Mack Publishing Company
1990)以及它们的修订版中。
所述免疫缀合物、抗体融合蛋白或裸抗体也可以皮下地或甚至通过其它非肠道途径施用给哺乳动物。此外,所述给药可以是通过连续输注或者通过单次或多个快速浓注。优选地,抗体在小于约4小时的时段内、更优选小于约3小时的时段内输注。这优选地通过首先缓慢输注来实现。例如,将25-50 mg剂量在15-30分钟内输注,剩余剂量在多达2-3小时的时段内输注。
一般而言,人用给药的免疫缀合物、融合蛋白或裸抗体的剂量随下述因素而变化,诸如患者的年龄、体重、身高、性别、一般医学状况和以前的医学史。使用效能比veltuzumab更低的治疗抗体,可以期望为受体提供剂量在约1 mg/kg至20 mg/kg范围内的免疫缀合物、抗体融合蛋白或裸抗体,作为单次静脉内输注,尽管也可以施用更低或更高的剂量(视情形而定)。所述剂量可以在1-20、5-10、2-10、10-20、5-15、1-10、1-5、2-5 mg/kg的范围内,或在1至20 mg/kg之间的任意范围。所述剂量可视需要而重复,例如,每周1次持续4-10周,每周1次持续8周,每周1次持续4周,或每周2次或3次持续2-8周。也可以不太频繁地给予,例如每隔1周持续数月,或每月或每季度持续多月,根据维持疗法的需要。
或者,诸如裸抗-CD20 MAb等抗体可以作为每2或3周一次剂量施用,重复共至少3次剂量。或者,所述抗体可以每周施用1次,持续4-8周。如果剂量降低至接近200-300 mg/m2 (对于1.7-m2患者,每剂量340 mg,或对于70 kg患者,4.9 mg/kg)或更低,可以每周施用1次,持续4-8周。或者,剂量计划可以降低,即每2或3周,持续2-3 个月。给药计划可以任选地以其它间隔重复,且剂量可以通过不同的非肠道途径施用,对剂量和计划适当调节。
在一个示例性的实施方案中,可以如下治疗NHL或自身免疫病:以每周100-400 mg/m2的剂量进行4次一周一次的输注人源化的抗-CD20抗体,持续连续4周(静脉内地(i.v.),在2-6小时内),根据需要在以后的数月/数年中重复。或者,可以以100-300 mg/m2的剂量,施用人源化的抗-CD20抗体,每2周或每3周1次,持续4-8次注射。在另一个替代方案中,可以用如上所述的4次一周一次的输注或如上所述的更低频率的注射治疗NHL,但是在相同天与在360 mg/m2剂量的依帕珠单抗 (抗-CD22 人源化的抗体)相组合,后者在抗-CD20 单克隆抗体输注之前、过程中或之后,在1小时内作为静脉内(i.v.)输注施用。或者,在联合治疗中使用的抗体也可以以交替的次序输注,使它们在不同周交替,导致各自每隔周施用,各自4-8或更多剂量的总注射次数。这些剂量计划然后可以以不同的间隔重复,例如每3-6个月,取决于患者的临床状态和对每个治疗方案的反应。在另一个替代方案中,可以用抗-CD20抗体的4次每周一次输注或更低频率的输注,其与用治疗同位素(诸如钇-90)放射性标记的CD22 MAb的一次或更多次注射(以5至35 mCi/平方米的Y-90总剂量,作为在数周或数月的时段内的一次或更多次注射)相组合,治疗NHL。通过引用并入本文的美国系列号 09/590,284公开了使用抗-CD22抗体的自身免疫障碍的免疫疗法。
在优选的实施方案中,已经工程化成特别有效的裸的或缀合的抗-CD20抗体(例如veltuzumab)可以在非常低的剂量施用,用于治疗疾病,诸如B-细胞疾病,例如B-细胞淋巴瘤或白血病、***性红斑狼疮、滤泡淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、或免疫性血小板减少性紫癜、或寻常天疱疮,以及诸如GVHD、溶血性贫血、冷球蛋白血症、同种致敏和器官移植排斥等免疫性疾病。如下面的实施例所述,当施用给人受试者时,低至80 mg或更小、更优选50 mg或更小、最优选30 mg或更小的veltuzumab剂量可能是有效的。这样的剂量可以优选地以约1-3周的间隔,给受试者施用2次或更多次,且甚至可以每周施用超过1次,例如,每周2次或3次,例如在分次给药中,其可以持续几周 (这可能在某些疾病中是优选的,例如,慢性淋巴细胞白血病)。令人惊奇地,已经发现这样的低剂量的非常有效的抗-CD20抗体诸如veltuzumab可有效地清除循环B-细胞和/或抑制B-细胞相关肿瘤的生长。优选地,通过静脉内的或皮下的递送,施用低剂量的抗-CD20抗体。
如下面的实施例所述,已经发现低剂量施用veltuzumab的优选方案会在要求保护的方法的实践中很好地起作用,且可以使用。例如,在伯基特淋巴瘤的小鼠模型***中,单次腹膜内(i.p.)或皮下(s.c.) 注射低至5 μg veltuzumab/ 20 g小鼠,会产生与对照相比明显降低的死亡率(实施例13)。推至70 kg人,5 μg剂量等同于单次注射17.5 mg veltuzumab。作为单次腹膜内或皮下注射施用的20 μg veltuzumab的更高的小鼠剂量(对于70 kg 个体,等同于70 mg),导致平均存活期4倍增加(实施例13)。低至0.05 μg 单次剂量的小鼠剂量(对于70 kg 个体,等同于0.175 mg),仍然导致与对照相比存活的显著提高,平均存活期2倍增加。尽管如此低的剂量可以产生与对照相比显著的改善,B-细胞相关疾病的有效治疗可以利用稍微更高的剂量,得到更好的疗效。非限制性实例包括:以2周间隔在2剂量中静脉内施用80 mg veltuzumab (实施例15)、4剂量每周1次的138 mg (80 mg/m2)静脉内 veltuzumab (实施例15)、以2周间隔皮下施用的4剂量的80 mg veltuzumab (实施例15)、4次每周一次剂量的80 mg/m2静脉内 veltuzumab (实施例15)、以2周间隔皮下的2剂量的10 mg veltuzumab (实施例17)、每周2次皮下40 mg veltuzumab剂量持续6周 (实施例18)、间隔2周皮下2剂量的40 mg veltuzumab (实施例19)、每周皮下3剂量的120 mg veltuzumab (实施例20)、起始静脉内注射15 mg veltuzumab继之以每周皮下40 mg持续3周 (实施例21)、在第0、8、12和21 天4次皮下注射40 mg veltuzumab (实施例22)、和间隔2周4次皮下注射80 mg veltuzumab (实施例16)。值得注意的是,在后一种情况下(实施例16),单次皮下注射80 mg veltuzumab产生肿瘤颈质量的显著退行和循环B-细胞的快速清除。实施例24表明,4剂量每周一次的低至80 mg/m2的veltuzumab在至少一些具有NHL的人患者中导致完全反应。
技术人员会认识到,公开的veltuzumab的剂量仅仅是示例性的,在要求保护的方法的实践中可以使用其它非限制性剂量,例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100 mg veltuzumab (总剂量),或5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70,75、80、85、90、95或100 mg/m2
veltuzumab,其在静脉内或更优选皮下施用。在某些实施方案中可能有用的范围,veltuzumab可以以预载药注射器或自注射笔的形式提供,配制成用于皮下、静脉内或其它肠胃外注射,剂量为10-180、10-100 mg、20-80 mg、30-60 mg、40-50 mg或任意其它剂量范围。
用于皮下、静脉内或腹膜内给药的低剂量 veltuzumab的示例性范围可以是小于
。或者,按照mg/m2计算的相同范围可以施用给人受试者。如在下面的实施例中所讨论的,已经证实这样的低剂量的veltuzumab至少在动物模型***和一些具有B-细胞相关的白血病或淋巴瘤或自身免疫病或其它免疫性疾病的示例性人受试者中是有效的。
对于不同的自身免疫病以及无痛形式的B-细胞淋巴瘤、侵袭形式的B-细胞淋巴瘤、慢性淋巴性白血病、急性淋巴性白血病和沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、以及 GVHD、冷球蛋白血症、溶血性贫血、同种致敏和器官移植排斥的治疗,本文所述的组合物是特别有用的。例如,人源化的抗-CD20抗体组分和免疫缀合物可以用于治疗无痛的和侵袭形式的非霍奇金淋巴瘤、不同的自身免疫病 (例如,类风湿性关节炎、SLE、干燥综合征、寻常天疱疮、免疫性血小板减少性紫癜)和不同的其它免疫病 (器官移植排斥,例如肾和心脏排斥、同种异体干细胞移植后的GVHD和免疫性溶血性贫血)。
如上面所讨论的,所述抗体可以用于治疗B-细胞淋巴瘤和白血病和其它B-细胞疾病或障碍。可以靶向的示例性的癌症类型包括急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
抗-CD20抗体可以用于治疗B-细胞相关的自身免疫病,包括III类自身免疫病诸如免疫-介导的血小板减少症(急性特发性血小板减少性紫瘢和慢性特发性血小板减少性紫瘢、皮肌炎、干燥综合征、多发性硬化、西登哈姆舞蹈病、重症肌无力、***性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、类风湿性关节炎、多腺体综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨-舍二氏紫瘢、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎、阿狄森氏病、结节病、溃疡性结肠炎、多形红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯彻氏综合征、闭塞性血栓性脉管炎、原发性胆汁性肝硬变、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常天疱疮、韦格纳氏肉芽肿、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎和纤维化肺泡炎。
抗-CD20抗体也可以在表达CD20抗原的细胞中诱导细胞凋亡。例如,已经证实,使用具有可与交联的CD20 MAb的IgG1-Fc反应的Fc-受体的淋巴样细胞,可以诱导细胞凋亡。参见Shan 等人, Cancer Immunol.
Immunother. 48(12):673-683 (2000)。另外,已经报道,嵌合的CD20 MAb的聚集体(即,同聚物)会诱导细胞凋亡。参见Ghetie 等人, Blood 97(5): 1392-1398
(2000)和Ghetie 等人, Proc. Natl. Acad. Sci
USA 94(14): 7509-7514 (1997)。
试剂盒
不同的实施方案可以涉及试剂盒,其含有适用于治疗或诊断患者的患病组织的组分。示例性的试剂盒可以含有至少一种本文所述的抗体、结合抗原的片段或融合蛋白。如果含有用于给药的组分的组合物不是配制成用于通过消化道递送例如通过口服递送,可以包括能通过一些其它途径递送试剂盒组分的装置。一类用于诸如肠胃外递送等用途的装置是注射器,其用于将组合物注射进受试者体内。也可以使用吸入装置。在某些实施方案中,抗-CD20抗体或其抗原结合片段,例如veltuzumab,可以以预载药注射器或自注射笔的形式提供,它们含有无菌液体制剂或冻干的抗体制品 (例如,Kivitz 等人, Clin. Ther. 2006,
28:1619-29)。
试剂盒组分可以一起包装,或分离成2个或更多个容器。在有些实施方案中,所述容器可以是装有适合重配的组合物的无菌冻干制剂的小瓶。试剂盒也可以装有一种或更多种缓冲剂,其适合重配和/或稀释其它试剂。可以使用的其它容器包括、但不限于:小袋、托盘、盒子、试管等。可以在容器内无菌地包装并维持试剂盒组分。可以包括的另一种组分是用户将试剂盒用于它的用途的说明书。
表达载体
其它实施方案可能涉及DNA序列,其包含编码抗体、其抗原结合片段、融合蛋白或双特异性抗体的核酸。可以编码和表达的示例性序列包括抗-CD20 MAb或其抗原结合片段、包含至少一种抗-CD20抗体或其抗原结合片段的融合蛋白、包含至少一种第一抗体或其抗原结合片段和至少一种第二抗体或其抗原结合片段的融合蛋白。所述第一和第二抗体可以包含抗-CD20抗体、抗肿瘤或B-细胞相关抗原和/或在可靶向的构建体上的半抗原的抗体,所述B-细胞相关抗原诸如
不同的实施方案涉及包含编码DNA序列的表达载体。所述载体可以含有这样的序列,其编码人免疫球蛋白的轻链和重链恒定区和铰链区,与它们可以连接嵌合的、人源化的或人可变区序列。 所述载体可以另外含有在选择的宿主细胞中表达MAb的启动子、免疫球蛋白增强子和信号或先导序列。特别有用的载体是pdHL2或GS。更优选地,所述轻链和重链恒定区和铰链区可以来自人EU骨髓瘤免疫球蛋白,其中任选地同种异型位置中的至少一个氨基酸变为在不同的IgG1同种异型中发现的氨基酸,且其中任选地基于EU编号***的EU重链的氨基酸253可以被替换为丙氨酸。参见Edelman 等人, Proc. Natl. Acad. Sci
USA 63: 78-85 (1969)。
也包括表达抗体或其抗原结合片段或融合蛋白的方法。技术人员会认识到,遗传工程化表达构建体和***宿主细胞来表达工程化的蛋白的方法是本领域众所周知的,且属于常规试验。已经描述了表达克隆的抗体或抗原结合片段的宿主细胞和方法,例如,在2005年7月25日提交的美国专利申请系列号11/187,863、2005年10月20日提交的11/253,666和2006年7月14日提交的11/487,215中,它们各自的实施例部分通过引用并入本文。
构建抗-CD20抗体的一般技术
通过多种分子克隆操作,例如RT-PCR、5'-RACE和cDNA文库筛选,可以得到抗-CD20抗体的VK (可变的轻链)和VH (可变的重链)序列。具体地,通过PCR扩增,可以克隆来自表达鼠抗-CD20 MAb的细胞的抗-CD20 MAb的V基因,并测序。为了证实它们的可靠性,可以如Orlandi 等人(Proc. Natl. Acad. Sci,
USA, 86: 3833 (1989))所述,在细胞培养物中表达克隆的VL和VH基因,为嵌合的Ab。基于V基因序列,然后可以如Leung 等人(Mol. Immunol., 32: 1413
(1995))所述,设计和构建人源化的抗-CD20 MAb。
通过一般的分子克隆技术 (Sambrook 等人, Molecular Cloning, A
laboratory manual, 2nd Ed (1989)),可以从生产鼠抗-CD20 MAb的任意已知的杂交瘤系或转染的细胞系制备cDNA。使用引物VK1BACK和VK1FOR (Orlandi 等人, 1989)或Leung 等人所述的延伸的引物集合(BioTechniques, 15: 286
(1993)),可以扩增MAb的VK序列。使用引物对VH1BACK/VH1FOR (Orlandi 等人, 1989)或Leung 等人(Hybridoma, 13:469 (1994))所述的与鼠IgG的恒定区退火的引物,可以扩增VH序列。
可以对含有10 μl 第一链cDNA产物、10 μl 10X PCR缓冲液[500 mM KCl, 100 mM
Tris-HCl (pH 8.3)、15 mM MgCl2、和0.01% (w/v) 明胶] (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT)、250 μM每种dNTP、200 nM引物和5单位Taq DNA聚合酶 (Perkin Elmer Cetus)的PCR 反应混合物进行30个PCR循环。每个PCR循环优选地由下述操作组成:在94℃变性1 min,在50℃退火1.5 min,并在72℃聚合1.5 min。扩增的VK和VH 片段可以在2%琼脂糖 (BioRad, Richmond, CA)上纯化。通过Leung 等人(Mol. Immunol, 32: 1413
(1995))所述的长寡核苷酸模板合成和PCR扩增的组合,可以构建人源化的V基因。
可以将VK的PCR产物亚克隆进分期载体(例如基于pBR327的分期载体, VKpBR)中,后者含有Ig启动子、信号肽序列和方便的限制位点,以促进VK PCR产物的框架内连接。可以将VH的PCR产物亚克隆进类似的分期载体中,例如基于pBluescript的VHpBS。通过例如Sanger 等人的方法(Proc. Natl. Acad. Sci,
USA, 74: 5463 (1977)),可以对含有各个PCR产物的单个克隆测序。
通过双限制消化,可以分别从VKpBR和VHpBS切离含有VK和VH序列以及启动子和信号肽序列的表达盒,作为HindIII-BamHI 片段。可以将VK和VH 表达盒分别连接进适当的表达载体,例如pKh和pGlg (Leung 等人, Hybridoma, 13:469
(1994))。可以将所述表达载体共转染进适当细胞,例如,骨髓瘤Sp2/0-Agl4 (ATCC, VA),针对潮霉素抗性选择菌落,并通过例如ELISA试验监测上清液中嵌合的、人源化的或人抗-CD20 MAb的生成。或者,可以将VK和VH 表达盒装配进修饰的分期载体VKpBR2和VHpBS2中,分别作为XbaI/BamHI和XhoI/BamHI 片段切离,并亚克隆进单个表达载体,例如pdHL2,如Gilles 等人所述(J. Immunol. Methods
125:191 (1989),且也被Losman 等人证实(Cancer, 80:2660 (1997))。有用的另一种载体是GS载体,如Barnes 等人, Cytotechnology
32:109-123 (2000)所述。其它适宜的哺乳动物表达***描述在Werner 等人, Arzneim.-Forsch./Drug Res. 48(11),
Nr. 8, 870-880 (1998)。
可以如下进行共转染和通过ELISA 测试抗体分泌克隆。根据Co 等人, J. Immunol, 148: 1149
(1992),可以将约10 μg VKpKh (轻链表达载体)和20 μg VHpGlg (重链表达载体) 用于通过电穿孔进行的5 X 106 SP2/0 骨髓瘤细胞的转染(BioRad, Richmond, CA)。在转染后,在96-孔微孔滴定板中,在完全HSFM培养基 (Life Technologies, Inc.,
Grand Island, NY) 中、在37℃、5% CO2培养细胞。在2天后,通过加入终浓度为500单位/ml 潮霉素的潮霉素选择培养基(Calbiochem, San Diego, CA),开始选择过程。通常在电穿孔后2-3周,出现菌落。然后可以扩增培养物,用于进一步分析。通过ELISA试验,可以鉴别出嵌合的、人源化的或人重链分泌阳性的转染瘤克隆。
可以如下从细胞培养基分离抗体。使转染瘤培养物适应无血清的培养基。为了生产嵌合抗体,使用HSFM,在滚动瓶中培养细胞,为500 ml培养物。将培养物离心,并通过0.2 μ膜过滤上清液。使过滤的培养基穿过蛋白A柱 (1 x 3 cm),流速为1 ml/min。然后用约10柱体积的PBS洗涤树脂,并用含有10 mM EDTA 的0.1 M 甘氨酸缓冲液 (pH 3.5)从柱洗脱蛋白A-结合的抗体。在含有10 μl 3 M Tris (pH 8.6)的试管中,收集1.0 ml级分,并从280/260 nm的吸光度测定蛋白浓度。合并峰级分,在PBS中透析,并浓缩抗体,例如,使用Centricon 30 (Amicon,
Beverly, MA)。通过ELISA测定抗体浓度,并使用PBS将它的浓度调至约1 mg/ml。将0.01% (w/v)的叠氮化钠方便地加入样品中作为防腐剂。
实施例
实施例1. 嵌合的和人源化的抗-CD20抗体的构建
如美国专利号7,151,164所述,构建嵌合的(cA20)和人源化的(hA20, veltuzumab) 抗-CD20抗体,其实施例部分通过引用并入本文 (也参见,Stein 等人, Clin Cancer Res 2004;
10: 2868-2878)。cA20和hA20的可变区 DNA和氨基酸序列分布公开在图1和图2中。
除了重链的第三个CDR (CDRH3)以外,cA20和hA20的CDR序列与利妥昔单抗 (亲本鼠MAb C2B8)的CDR序列相同。为了方便,将重链CDR序列称作CDRH1-H3,将轻链CDR称作CDRL1-L3。在报道的抗-CD20抗体的CDRH3序列中,仅C2B8和对应的利妥昔单抗具有在Kabat位置101处的天冬酰胺残基。
使用与人源化的抗-CD22抗体依帕珠单抗相同的人IgG 供体框架区(FR),构建了veltuzumab(hA20)的框架区序列(Leung 等人, Mol Immunol 1995; 32:
1413-1427)。具体地,为人源化的hA20抗体的重链选择人EU抗体的FR1、FR2和FR3和人NEWM抗体的FR4,为人源化的hA20抗体的轻链选择人REI抗体的FR。如在美国专利号7,151,164中所公开的,在FR中保留关键的鼠残基,以维持veltuzumab对CD20的结合特异性和亲和力,类似于亲本鼠抗体的那些。hA20 的重链(hA20VH1)含有9个来自人EU框架的变化,而hA20的轻链 (hA20Vκ) 含有7个来自REI 框架的氨基酸变化(美国专利号7,151,164)。
在图3中显示了cA20、hA20和利妥昔单抗 (来自c2B8)的可变区序列的对比。如图3A和3B所示,在可变的框架区中,cA20不同于veltuzumab (hA20),但是具有与veltuzumab相同的CDR。除了在轻链的N-末端处的3个氨基酸残基以外,cA20的框架区序列与利妥昔单抗 (c2B8)的那些相同,而利妥昔单抗和veltuzumab的框架区序列相差在轻链中的18个残基和在重链中的14个残基。利妥昔单抗的CDR序列与veltuzumab (hA20)和cA20的那些不同之处仅在于CDR3的VH的Kabat位置101。
如下面的实施例所述,在从CD20阳性淋巴瘤细胞的解离速率以及某些体内和体外治疗特征方面,veltuzumab和利妥昔单抗明显不同。为了确定这些特征的变化是否可归因于框架序列的差异或CDR3的VH的Kabat位置101处的Asp对Asn的置换,使用在CDRH3的位置101处的天冬氨酸向天冬酰胺的非保守的单个氨基酸变化,工程化了veltuzumab的突变体,指定为D101N。因而,D101N具有与利妥昔单抗相同的CDR,但是与veltuzumab相同的FR。下面提供了构建D101N的其它细节。表1对比了veltuzumab、cA20、D101N、利妥昔单抗和1F5的CDRH3序列,它们都具有相同的CDRH1和CDRH2序列。
表1. CDRH3的对比1
1用•标记的残基与在相同位置处的veltuzumab的那些相同。
实施例2. 构建veltuzumab的D101N序列变体
所有限制性内切核酸酶和其它酶都购自New England Biolabs
(Beverly, MA)。寡核苷酸由Sigma Genosys (Haverhill,
UK)合成。使用Amplitaq 聚合酶 (Applied Biosystems,
Foster City, CA)和Perkin Elmer (Wellesley, MA) GeneAmp PCR system 9600,进行PCR反应。使用hA20-pdHL2 (参见美国专利号7,151,164)载体作为模板以及寡核苷酸引物对5' D101N
(cggtgactggtacttcaatgtctggggccaaggcaccacg SEQ ID NO: 17)和3' Hind3
(aaagcttgcggccgcgatcc SEQ ID NO: 18)或3' D101N
(cgtggtgccttggccccagacattgaag taccagtcaccg SEQ ID NO: 19)和5' XhoI
(cctcgagcacacaggacctc SEQ ID NO:20)的2个PCR反应分别生成210碱基对或510碱基对扩增引物。使用210碱基对和510碱基对产物的混合物作为模板和5' XhoI和3' Hind3 引物的第三个PCR反应生成680碱基对扩增引物,将其凝胶分离,并克隆进pGemT PCR 克隆载体(Promega, Madison, WI)。通过自动化的DNA测序,证实扩增引物的序列。使用XhoI和Hind III 限制酶,从pGemT载体切下680碱基对片段,并连接进hA20-pdHL2载体,后者通过使用相同的酶消化来制备。通过自动化的DNA测序,证实最终载体D101N-hA20-pdHL2的序列。
实施例3. 抗-CD20抗体的结合的Scatchard 分析
细胞系
在下面的实施例中,鼠杂交瘤1F5和人伯基特淋巴瘤系Daudi、Raji和Ramos都购自美国典型培养物保藏中心 (Manassas, VA)。使用的非伯基特淋巴瘤细胞系是: 来自Alan Epstein博士 (University of Southern
California, Los Angeles, CA)的SU-DHL-6和来自Mitchell Smith博士 (Fox Chase Cancer Center,
Philadelphia, PA)的WSU-FSCCL。在添加了10%胎牛血清、青霉素 (100单位/ml)、链霉素 (100 μg/ml)和L-谷氨酰胺 (2 mM)的DMEM (Life Technologies,
Inc. Gaithersburg, MD)中培养细胞,作为悬浮培养物。
Scatchard 分析
使用Prism 软件 (GraphPad Software Inc.,
San Diego, CA),通过用放射性碘化的样品和Raji细胞得到的饱和结合数据的非线性回归分析,测定每个Raji细胞的结合位点的最大数目以及veltuzumab和利妥昔单抗的表观解离常数。使用组织培养基作为稀释剂,在225 μl的测定体积,在37℃或室温,与放射性碘化的MAb一起温育Raji细胞 (5x105) 1 h。然后用含有1%马血清的PBS洗涤细胞2次,在γ计数器中计数细胞沉淀物。从接近2x106 cpm/2 μg MAb/试管开始,以2:3系列稀释,滴定MAb,一式三份地运行。通过包括重复的未标记的MAb,测量非特异性结合。通过结合抗-独特型抗体测得的放射性标记的MAb的免疫反应性是90%或更大。
在图4中显示的结果证实,veltuzumab和利妥昔单抗的每个细胞的结合位点的数目和平衡解离常数(功能Kd) 是类似的。计算出的每个Raji细胞的结合位点的数目是在2.0x105 -4.2x105(对于veltuzumab) 和1.8x105-3.6 x 105(对于利妥昔单抗)的范围内。在重复测定中,表观解离常数值的范围是6.23 -12.02 nM(对于veltuzumab) 和6.70 -8.63 nM(对于利妥昔单抗)。这些值与我们自己和其它人以前报道的那些,以及用于描述关于利妥昔单抗的信息 (Melhus 等人, Cancer Biother.
Radiopharm., 22: 469-479, 2007; Stein 等人, Clin. Cancer Res., 10: 2868-2878,
2004)类似。
实施例4. 细胞表面竞争结合测定。
通过与鼠2B8和利妥昔单抗 (IDEC Pharmaceuticals
Corp., San Diego, CA)的细胞表面竞争结合测定,评价了通过蛋白A柱上的亲和色谱法纯化的抗-CD20 Ab cA20、hA20和c1F5的Ag (抗原)-结合特异性和亲和力研究。在有不同浓度 (0.2-700 nM)的竞争Ab (cA20、hA20、m2B8、c1F5或利妥昔单抗)存在下,在4℃,与Raji细胞一起温育恒定量 (100,000 cpm, ~10 μCi/μg)的125I-标记的m2B8或利妥昔单抗1-2 h。通过用PBS洗涤细胞,去除未结合的Ab。在洗涤后,测定与细胞相关的放射性。结果(未显示)证实,cA20、hA20和cIF5都与利妥昔单抗 (c2B8)和鼠2B8竞争结合CD20。
实施例5. 解离或离开速率的对比
使用Daudi、Raji和Ramos细胞,通过流式细胞术,对比了veltuzumab、利妥昔单抗、cA20、D101N、15F和托西莫单抗 (抗-CD20, BEXXAR®,
GlaxoSmithKline)的解离速率 (图5)。按照生产商的建议的方法(Invitrogen, Molecular
Probes, Z-25455),使用Zenon R-藻红蛋白人IgG标记试剂盒,用藻红蛋白(PE)标记每种MAb。与5 μg每种PE-标记的MAb一起在室温温育1 x 106细胞/mL的在0.5 ml CM (不含酚红的RPMI 1640培养基,添加了10% FBS) 中的细胞 (Daudi、Raji或Ramos) 30 min,在400 x g沉淀,用CM洗涤2次,重新悬浮于1.5 ml CM中,并分成2份0.75-mL 等分试样。为了防止重新结合,将N-乙基-马来酰亚胺 (NEM)-封闭的veltuzumab-Fab'加入每个重复试样 (1 mg/mL 终浓度),然后立即测定平均荧光强度(MFI),以确定最大结合 (T=0),其中使用Guava PCA和Guava Express 软件 (Guava Technologies,
Inc., Hayward, CA)。以30-min间隔,进行随后的测量。相对于时间绘制最大结合百分比,它是在T=X的MFI除以在T=0的MFI的商,并通过Prism 软件 (GraphPad Software Inc., San Diego,
CA)分析结果,产生半衰期或离开速率。
在有过量的veltuzumab-Fab' -NEM 存在下,在37℃,对比了veltuzumab、利妥昔单抗和cA20离开Daudi (图5A)、Ramos (图5B)和Raji (图5C)细胞的解离速率。进行了其它测量,以对比在类似条件下veltuzumab、利妥昔单抗和D101N与Raji细胞的解离(图5D)。对于测试的每个细胞系,veltuzumab的平均半衰期是利妥昔单抗的2.7-倍 (±0.3)长 (P<0.0001),但是与cA20的半衰期不可区别 (P>0.2)。相反, D101N突变体以分别为利妥昔单抗和veltuzumab 2和6倍快的离开速率从Raji细胞解离。这些结果表明,Asn101向Asp101的变化引起了veltuzumab的更慢解离。我们也对比了在没有竞争veltuzumab-Fab' -NEM 存在下veltuzumab、利妥昔单抗、D101N、1F5和托西莫单抗从Raji细胞的解离 (图5E),并发现veltuzumab具有最长的半衰期 (281 min),之后是1F5 (195 min)、利妥昔单抗 (94 min)、托西莫单抗 (50 min)和D101N (42 min)。
实施例6. 通过MTT试验测定体外细胞增殖抑制
体外细胞毒性试验是基于Mosmann的方法 ( J Immunol Methods, 65:
55-63, 1983)。简而言之,以1-2 x 104细胞/孔 (100 μl),将细胞系涂布在96-孔平板上,加入抗体 (100 μl)。在37℃在控湿CO2 (5%) 培养箱中培养4天后,加入25 μl 5.0 mg/ml MTT [3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物],然后在37℃培养细胞另外4 h。然后离心平板,并去除上清液。使用100 μl DMSO/孔,溶解沉淀物,并在微量培养板读数器(Molecular Devices,
Sunnyvale, CA)上在570 nm测量光密度。因为以前报道未标记的利妥昔单抗和veltuzumab的细胞毒性活性需要交联(Stein 等人, Blood, 104: 3705-3711,
2004),将山羊-抗-人IgG (GAH)加入一些孔中。以5 μg/ml的终浓度,使用veltuzumab和利妥昔单抗,并使用20 μg/ml的GAH。所有实验一式四份进行。
使用对4种淋巴瘤细胞系(SU-DHL-6、Daudi、Raji和WSU-FSCCL)的MTT 细胞毒性试验,检查了veltuzumab和利妥昔单抗的抑制增殖的能力,所述4种淋巴瘤细胞系的差别在于它们的CD20的表达水平 ( Stein 等人, Clin Cancer Res, 10:
2868-2878, 2004)。尽管对两种MAb的敏感性与CD20 表达有关(SU-DHL-6 > Raji > Daudi > WSU-FSCCL),在细胞系内没有观察到veltuzumab和利妥昔单抗之间效价的显著差异(图6)。与第二抗体(GAH, 山羊抗-人IgG) 交联会增加veltuzumab和利妥昔单抗对Raji和Daudi细胞(具有中间CD20表达水平和对抗-CD20 MAb杀死的敏感性的2个细胞系)的效能(图6)。细胞系增殖对抗-CD20敏感性的任一极端(例如,SU-DHL-6,它是非常敏感的,和WSU-FSCCL,它是非常不敏感的)的抑制没有从第二抗体的加入获益 (图6)。
实施例7. B-和T-细胞体外消除
使用流式细胞术,体外评估了veltuzumab对健康志愿者的人外周血淋巴细胞的影响。将全血等分试样与veltuzumab一起温育2天,随后通过FACS分析B-细胞 (CD 19+)和T-细胞 (CD3+)。对照不包含抗体,阴性对照是人源化的MAb (抗-CEACAM5 单克隆抗体, hMN-14)。用veltuzumab温育全血,导致B-细胞数目显著降低,但是T-细胞不然 (图7)。B-细胞降低的范围是26 -80%(使用5 μg/ml)和11 -61%(使用1 μg/ml)(相对于未处理的细胞的P值 < 0.05,对于3/3供血者的1 μg/ml [6.7 nM],对于5/5供血者的5 μg/ml [33.3 nM])。因为在温育混合物中使用全血,在细胞计数中观察到的降低可能是由于CDC或ADCC以及直接的信号传递。
实施例8. 补体-依赖性的细胞毒性(CDC)试验
使用荧光方法来评价和对比veltuzumab相对于利妥昔单抗的CDC活性。将Daudi、Raji或Ramos细胞 (1 x 106/mL)接种(50 μL/孔)进黑96-孔平板 (Nunc),并在有1/20最终稀释度的人补体存在下 (Quidel Corp., San Diego,
CA),与每种实验MAb (0.001-10 μg/mL)一起在37 ℃和5% CO2培养3 h。加入指示染料AlamarBlue (BioSource,
Camarillo, CA),并继续培养过夜。然后通过测量荧光强度,定量活细胞,其中在530 nM激发,在590 nM发射,使用BioTek Synergy™ HT 多检测微量培养板读数器和KC4 Signature 软件 (BioTek
Instruments, Inc., Winooski, VT)。
使用Prism 软件,分析从6个重复测定的平均值产生的剂量-反应曲线,以得到EC50值。在Daudi细胞的情况下,为了说明在测定中不同天之间的变化,以及增加EC50估测的精确度,实验使用多重析因设计,其中每天一式三份地进行每种抗体的试验,并在3个不同天重复,每种抗体共9个试验。样品包括3个不同批次的veltuzumab和一种利妥昔单抗。EC50数据的统计分析是基于2-路方差分析(ANOVA)模型,用天和抗体类型作为因子。使用Dunnett氏多重比较方法,进行所有4个构建体的3次对比,总实验差错率为0.05。
使用Daudi作为CDC的靶细胞,我们连贯地观察到veltuzumab与利妥昔单抗相比更低的EC50值(表2)。解决不同天之间的变化的任何影响以及不同天之间抗体的EC50模式的任意差异的其它测量,指示在利妥昔单抗和3批veltuzumab 中的每一种之间观察到的EC50的平均差异连贯地是统计上显著的 (P< 0.0001)。但是,使用其它2种细胞系Raji和Ramos的CDC结果,没有观察到veltuzumab和利妥昔单抗之间的差异。
表2. veltuzumab和利妥昔单抗的对比:在Daudi细胞系中CDC结果(EC50)的总结。
[1]基于使用Dunnett氏方法为多重比较调节的2-路ANOVA模型
实施例9. 抗体-依赖性的细胞毒性(ADCC)试验
分别使用外周血单核细胞 (PBMC)和Daudi作为效应细胞和靶细胞,测量了ADCC的诱导。一式三份地与5 μg/mL的每种实验抗体一起在37℃和5% CO2温育Daudi细胞30 min。然后以预定的最佳效应物与靶物比50:1,加入从健康志愿者得到的新鲜分离的外周血单核细胞 (PBMC)。在温育4小时后,通过CytoTox-One (Promega,
Madison, WI),评估细胞溶胞作用。针对MAb + 效应细胞、MAb + 靶细胞和MAb + 靶细胞 + 效应细胞,测定ADCC。也处理了含有单独的MAb和单独的靶细胞的对照孔。
为了评价结果,从所有其它孔减去从含有单独的培养基的孔得到的平均背景值,并使用下述方程计算%溶胞作用,在所述方程中,MET表示含有MAb、效应细胞和靶细胞的孔;ET是含有效应细胞和靶细胞的孔;T是只含有靶细胞的孔;且Max是含有靶细胞和裂解缓冲液的孔;
通过测量表达CD20的Daudi细胞系的细胞溶解,将5批veltuzumab的ADCC活性的水平与利妥昔单抗和阴性对照 MAb (hMN-14)的水平相对比。效应细胞功能由从2位志愿供血者新鲜分离的PBMC提供。结果指示,利妥昔单抗和5批veltuzumab中的每一种产生统计上类似的(P=0.12) ADCC水平(40-45%溶胞作用) (数据未显示)。利妥昔单抗和veltuzumab都表现出与对照MAb (9.9%溶胞作用, 人源化的抗-CEA 拉贝珠单抗)相比明显更高的ADCC水平 (P<0.0001)。
实施例10. 天然杀伤(NK)细胞和嗜中性粒细胞清除对治疗的影响
如以前所述(Hernandez-Ilizaliturri等人, Clin Cancer Res
9:5810-12, 2003),清除NK细胞和嗜中性粒细胞。简而言之,每个小鼠接受100 μL抗-小鼠Gr-1腹水(腹膜内) (提供者为FJ. Hernandez-Ilizaliturri博士, Roswell Park Cancer
Institute, Buffalo, NY)和100 μg 抗-小鼠 IL-2 受体抗体(TMβ-1, BD PharMingen, Inc.,
San Jose, CA),1天后接种1x 106 Raji细胞,然后在第6和13天腹膜内注射抗-小鼠 Gr-1腹水另外2次。通过FACS 分析在第3和13天从1个清除的和1个未清除的小鼠采取的血样,证实清除。在第3、5、7和11天,静脉内施用veltuzumab (200 μg)或盐水。
检查效应细胞对veltuzumab的体内Raji肿瘤生长抑制的作用 (图11)。在清除NK和嗜中性粒细胞的那些动物中,在盐水对照和治疗的小鼠之间没有差异,二者都具有相同的MST (16.4 ± 1.3天)。相反,在未清除的小鼠中,veltuzumab-治疗的小鼠具有比盐水对照明显提高的MST (38.6 ± 7.3相对于18.4 ± 0.9天; P<0.0035)。
实施例11. 腹膜内或皮下给药后小鼠的血清药代动力学分析
将12只9-周龄首次用于实验的雌性Swiss-Webster小鼠(Taconic Farms; Germantown,
NY)称重,然后注射,并分成6只一组到笼子中,使得2个小鼠组之间的平均值和标准差没有显著差异。将1 nmol (150 μg) veltuzumab作为200 μL 腹膜内或皮下注射来施用。通过在0.5、1、4、6、24、48、120、168和336 h眶后抽血,采取血清样品,并冷冻储存,直到分析veltuzumab。
使用捕获ELISA来定量血清样品中veltuzumab的量。用大鼠抗-veltuzumab 独特型单克隆抗体WR2 (Immunomedics, Inc.,
Morris Plains, NJ)包被96-孔试验平板 (Nunc Maxisorp Certified Flat-Bottom Immuno Modular w/frame;
NalgeNunc International Corp., Rochester, NY)。通过制备8个veltuzumab连续稀释 (100至1.56 ng/mL),构建标准曲线。适当稀释鼠血清样品,并与标准品一起,吸量进一式三份孔中。使用过氧化物酶-缀合的山羊抗-人多克隆抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories,
Inc., West Grove, PA),检测结合的veltuzumab,并使用OPD 溶液 (邻苯二胺二盐酸化物, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO),使平板显影。在暗处温育平板,直到在标准曲线孔中显色(~20 min)。在此时,将4N硫酸加入孔中,以停止反应,并在OD490 nm在平板读数器上读出平板。
使用Prism 软件 (GraphPad Software, Inc.),基于标准曲线,计算小鼠血清样品中的veltuzumab浓度。为了保证准确度,每个样品运行多次,将来自所有这些运行的平均值用于PK-分析。使用WinNonLin PK 软件包(v5.1, Pharsight Corp.,
Mountain View, CA),将从上述试验测定的血浆浓度转化成nmol/mL,并进行分析。在腹膜内和皮下数据上进行未分割的分析(代表最佳拟合模型)。
尽管腹膜内和皮下注射的那些动物之间的veltuzumab的血清浓度和清除率非常类似(图12),它们各自的PK-参数中有几个是明显不同的(表3和4)。在最大血清浓度 (Cmax)和达到Cmax的时间(Tmax)方面,注射途径之间没有显著差异。清除率(Cl)和曲线下面积(AUC)值之间的对比也是如此。但是,观察到终末半衰期(T1/2)和平均停留时间 (MRT)的突出差异,腹膜内途径产生明显更高的每个值(分别P=0.0316和P=0.0357)。
表3. 腹膜内注射的hA20的药代动力学
在我们的PK研究中使用的无肿瘤的Swiss-Webster小鼠的平均重量是30 g。基于它们的重量,估测小鼠的全血体积,并使用体重的5.5-7%作为全血的mL。如果我们使用6.25%的均值,我们的小鼠具有接近1.9 mL全血,其中接近50%是血清或0.95 mL。我们将150 μg腹膜内地注射进这些小鼠,所以如果它全部在血液中停留,我们将具有接近158 μg/mL的血清浓度。我们发现,将150 μg veltuzumab注射进这些30 g小鼠后,达到30 μg/mL血清的Cmax,或为预期最大值的1/5.3。
表4. 皮下注射的hA20的药代动力学
使用上面的观察结果,我们将50 ng (0.05 μg)注射进~20-g SCID小鼠,作为我们的最低治疗剂量。基于它们的重量,它们应当具有接近1.14 mL 全血体积,其中0.57 mL是血清。如果所有50 ng停留在血液中,将存在87.7 ng/mL的血清浓度。鉴于在正常小鼠 PK研究中观察到相同的动力学,我们估测血清中接近16.5 ng/mL veltuzumab的Cmax 浓度 (87.7 ng/mL除以5.3)。这没有考虑Daudi细胞的存在,所述Daudi细胞可以是这些小鼠中的抗原汇点(sink),并从而降低血清浓度。
实施例12. 在食蟹猴中的耐受性和毒物动力学
在SNBL USA, Ltd. (Everett,
WA),在食蟹猴(Macaca fascicularis)中进行了静脉内和皮下注射veltuzumab的探测的单-和重复-剂量研究。给重量为2.5至6.6 kg (3-7岁)的16只雄性和16只雌性猴静脉内或皮下施用0、6.7、33.5和67 mg/kg的剂量 (它们分别对应在人中的80、375和800 mg/m2剂量)一次或3次(间隔2周)。
定期检查猴子,采取血样进行MAb滴度和PK、血液化学、凝固、和血液学测试以及尿分析,然后对脾、下颌骨和肠系膜***中的淋巴组织状态进行死后评价。
作为单次或多次剂量静脉内或皮下施用的veltuzumab被很好地耐受,除了在循环和淋巴器官中的B-细胞清除以外,没有观察到临床或持续的实验室试验异常。接受所有剂量的动物的死后变化包括在所有剂量时脾、下颌骨和肠系膜***中的滤泡淋巴清除(数据未显示)。观察到白细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞和嗜碱细胞的暂时降低,但是仅观察到外周血B-细胞的数目的快速且持续的降低 (未显示)。这些效应发生在通过任一种途径给药的2天内,且存在于6.7 mg/kg或更高的剂量。动物在28天时(当治疗1次时)或在56天时(当给予3次剂量时)恢复。药代动力学分析(数据未显示)指示,在静脉内注射后5-8天或皮下给药后6-13天估测半衰期,两种途径的Tmax范围是2-5天。在静脉内注射后的Cmax 是线性的,且没有表现出积累,静脉内给药的AUC0-27 天大于皮下途径 (未显示)。这可能与MAb通过皮下途径进入血流需要的更长时段有关(具有类似的清除率)。剂量标准化的AUC值表明在所有剂量水平在静脉内-输注或皮下施用后veltuzumab的积累,但是在所有剂量水平,皮下给药后的平均分布体积大于静脉内输注后(未显示)。这些结果指示,在6.7 mg/kg的最低单次剂量 (相当于在人中的80 mg/m2),在该低剂量,通过静脉内和皮下途径施用的veltuzumab发生外周和脾B-细胞清除的快速清除。
实施例13. 小鼠模型中veltuzumab的体内效能
在接近20 g (当从Taconic, Germantown, NY接收时,7-周龄)的C.B.17纯合的严重联合免疫缺陷的(SCID)小鼠中进行这些研究。对于Daudi (伯基特淋巴瘤)模型,在第0天给小鼠静脉内接种1.5x107细胞,称重,并随机分成6个治疗和2个对照组(每组8只)。在第1天,在治疗组中的小鼠皮下或腹膜内接受单次剂量的veltuzumab (5、20或60 μg),对照组中的那些接受盐水(200 μL)或60 μg 非-Daudi靶向的同种型-匹配的抗-CEACAM5 单克隆抗体、hMN-14 IgG (拉贝珠单抗, Immunomedics, Inc.,
Morris Plains, NJ)。
除了该研究以外,在相同的Daudi模型中进行最小有效量实验。14只小鼠组腹膜内接受单次剂量的veltuzumab (0.5、0.25、0.1或0.05 μg),给对照组施用盐水。在WSU-FSCCL 滤泡细胞淋巴瘤模型中,15只小鼠组中的每只小鼠静脉内接种2.5 x 106细胞,并在5天后腹膜内接受单次剂量的veltuzumab (0.035、0.35、3.5或35 μg)。每天监测动物,当发展成后肢瘫痪时,当它们变成垂死时,或如果它们丧失超过20%的起始体重,人道地处死。使用Prism (v4.03) 软件包(GraphPad Software, Inc.),使用Kaplan-Meier图(log-排序分析),分析存活曲线。
伯基特淋巴瘤异种移植物的腹膜内和皮下治疗
使用单次腹膜内或皮下注射veltuzumab,治疗具有弥散性疾病的小鼠。与盐水和拉贝珠单抗对照组相比,无论腹膜内还是皮下施用,所有3个剂量的veltuzumab显著增加了小鼠的存活 (图8, P=0.0001)。腹膜内和皮下施用的相等剂量之间的对比没有产生任何显著的差异(图8)。尽管对照小鼠在第28天死于疾病(后肢瘫痪),腹膜内和皮下的2个60-μg组的平均存活期(MST)分别是101.9 ± 26.8和114.6 ± 21.8天,当研究在第126天结束时,4/8和6/8小鼠仍然存活。对于施用20 μg的动物,得到类似的结果,MST为116.4 ± 14.0 (腹膜内)和108.4 ± 26.2 (皮下)天,且在2个组的研究结束时,5/8小鼠存活。仅在最低剂量(5 μg),观察到>50% 死亡率(在研究结束时,在每个腹膜内/皮下组中,3/8和1/8小鼠仍然存活),但是与对照相比,这些小鼠的MST仍然具有>3.2-倍增加 (对于腹膜内和皮下,分别是91.1 ± 30.9和91.6 ± 22.5天)。
Veltuzumab
在
Daudi
伯基特淋巴瘤异种移植物中的最小有效剂量
由于单次5 μg剂量的veltuzumab被证实在Daudi 弥散性伯基特淋巴瘤模型中是有效的,然后在该相同的疾病模型中检查了甚至更低的剂量 (0.5、0.25、0.1和0.05 μg)。值得注意的是,与盐水对照小鼠相比,所有4个剂量都显著提高了存活(P<0.0001) (图9)。例如,接受0.5 μg单次剂量的小鼠的MST与对照相比具有3-倍提高 (69.5 ±23.9 相对于21.4 ± 1.1天)。甚至0.05 μg (50 ng)的最低测试剂量使MST(50 ± 8天)与对照相比增加至超过2-倍。
veltuzumab
在滤泡细胞淋巴瘤异种移植物中的最小有效剂量
在弥散性滤泡细胞淋巴瘤模型WSU-FSCCL异种移植物中,给小鼠组施用veltuzumab的单次腹膜内注射 (图10)。每组接受从最高35 μg至最低0.035 μg (35、3.5、0.35和0.035 μg)的10-倍稀释。在施用WSU-FSCCL细胞后5天,开始治疗。与盐水对照相比,所有4个剂量显著增加小鼠的存活(图10, 对照MST=28天; P<0.0001)。施用35-μg剂量的小鼠的MST(44.3 ± 4.9天)没有显著不同于3.5-μg组 (39.5 ± 4.6天),但是比0.35-和0.035-μg (35 ng)组 (分别是40.5 ± 1.6天和33.3 ± 2.1天)明显更长(P<0.021)。但是,除了3.5-μg组中一个以外,所有小鼠在不迟于第61天死于疾病恶化。
实施例14. 在小鼠模型***中veltuzumab 显示出比利妥昔单抗提高的体内效能
通过尾静脉注射,给SCID小鼠接种人伯基特淋巴瘤(Raji)细胞。在接种后第5、10、15和20天,小鼠接受10 mg/kg/剂量的利妥昔单抗或veltuzumab (hA20)。累积存活结果如图13所示。
从图13可以看出,与用相等剂量的利妥昔单抗治疗的小鼠相比,注射Raji 淋巴瘤细胞并用veltuzumab (hA20)治疗的SCID小鼠表现出累积存活的显著提高(P = 0.005)。在该研究中,使用肢体***时间作为存活的替代终点。图13表明,在接种后超过90天内,已经用veltuzumab治疗的具有Raji 淋巴瘤的SCID小鼠表现出约80%存活率,而用利妥昔单抗治疗的相同小鼠表现出接近0的存活率。图13的下部分表明,估测的中间累积存活是22.1天(对照小鼠)、47.9天(用利妥昔单抗治疗的小鼠)和尚未达到(用veltuzumab治疗的小鼠)。
这些结果证实,在CDRH3序列中用天冬氨酸替换Kabat 101 天冬酰胺,会在使用人伯基特淋巴瘤细胞的小鼠模型***中产生体内效能的显著提高。
实施例15. 用低剂量 veltuzumab治疗
特发性血小板减少性紫癜
具有6个月ITP病史的39岁女性接受甾类作为护理标准,没有令人满意的血小板水平提高。她接受2剂量的80 mg/m2 veltuzumab,间隔2周静脉内给药。尽管低剂量,她的B-细胞水平在第一剂量后被清除,且她的血清抗体水平在第一剂量后增加至10 μg/mL,在第二剂量后达到19 μg/mL,然后缓慢清除,但是在8周后仍然可检出 (1 μg/mL) 。最重要的是,她的血小板水平在第一剂量后4天内从研究开始时的24,000/mm3快速升高至正常范围(>150,000/mm3)。该完全反应目前持续,且她的血小板在治疗后18周的最后评价时仍然>150,000/mm3。令人感兴趣地,该患者也遭受溃疡性结肠炎,在用veltuzumab试验期间脱离(go off)该病症的治疗。在veltuzumab治疗期间,在目前的18-周随访内,溃疡性结肠炎的所有体征和症状都减弱,这似乎是该B-细胞治疗的副效应。
边缘区淋巴瘤
具有边缘区淋巴瘤的79岁女性在12年前初次确诊,以前用CHOP、然后用CVP治疗,但是没有使用利妥昔单抗。她表现出IV期疾病,包括2个肿大的回肠***和骨髓累及。她接受4剂量的138 mg (80 mg/m2)
veltuzumab,每周静脉内施用一次。在第一次剂量后,B-细胞水平被清除,血清抗体水平随着后续剂量而增加,在最后一次剂量后达到120 μg/ml,然后缓慢清除,在12周后的最后一次评价时仍然可检出值 (5 μg/mL)。最重要的是,该患者对治疗具有优良反应,在CT扫描和负骨髓活组织检查中,回肠***恢复至正常大小。在治疗后15个月的最后评价中,该完全反应目前持续。
滤泡淋巴瘤
具有15年滤泡淋巴瘤病史的42岁女性已经接受多个先前的治疗方案,包括静脉内的veltuzumab,她已经对它达到9个月反应。她每2周接受皮下注射的80 mg veltuzumab,持续共4剂量。尽管通过该途径施用低剂量,在第一次剂量后清除了B-细胞水平。在初次剂量后几天内测量的血清抗体水平证实了缓慢增加至10 μg/ml的水平,这与静脉内给药所得到的水平相当。在最后一次治疗后的4-周随访中,患者的检查揭示大多数肿大的患病***复原的证据,且在4周后,重复检查(包括计算机体层摄影扫描)表明,与这些***在基线时的累积尺寸相比,涉及的***的所有尺寸的总和减少了超过50%,表明患者在该点具有部分反应。对于该最近的患者,其它评价待定,但是良好生物利用度的证实、和B-细胞清除的活性的证据、以及>50%的疾病减少,证实皮下途径是有效的。
滤泡淋巴瘤
具有IV期、3级滤泡淋巴瘤的41岁男性在8年前初次确诊,以前已经用CHOP 化疗治疗,但是没有使用利妥昔单抗。他接受4剂量的80 mg/m2
veltuzumab,每周静脉内施用一次。在第一次剂量后,B-细胞水平被清除,血清抗体水平随着后续剂量而增加,在最后一次剂量后达到86 μg/mL,然后缓慢清除,在12周后的最后一次评价时仍然可检出值 (4μg/mg)。最重要的是,所有疾病完全消失,包括在研究开始时已经存在的3.6 cm头皮(scalp)病变。该完全反应持续至治疗后9个月,在此时,通过FDG-PET成像,看到新病变。该患者也证实,低剂量的veltuzumab是有效的,在该患者中诱导完全反应,包括在仅单次施用80 mg/ m2的veltuzumab后清除循环B-细胞。
实施例16. 滤泡大细胞淋巴瘤的治疗
AF是具有3级滤泡大细胞非霍奇金淋巴瘤的63岁白种男性,在2004年1月通过***活组织检查证实是CD20+。他在诊断时的阶段是3期,但是现在呈现为2期。他在1992的先前治疗包括多柔比星、长春新碱、高剂量环磷酰胺,它们导致24个月的减轻。在1996年,他接受ICE (异环磷酰胺、卡铂和依托泊苷)方案以及干细胞治疗,随后对腹膜后团块进行巩固辐射。他响应88个月。他最近没有呈现B-症状,没有显著的CBC、血清化学或血清免疫球蛋白异常、687 CD3-T细胞/μL、32 CD19-B-细胞/μL和10 x 8 cm的肿大的锁骨上结、2.0和2.8 cm直径的左和右腋窝团块、和2-3 cm 的颈侧团块。给患者施用4次80 mg veltuzumab皮下注射,间隔2周。没有显著的不良反应或安全性问题,在注射部位只有微小的暂时的红斑反应和触痛。在第一次注射后4天,测得血液中的CD19+ B-细胞为0,所以被完全除去。通过触诊测得,在第一次注射后4天,患者的大颈团块收缩了50%,且他表明感觉更好。在另一个4周期间进行CT扫描。在单次皮下注射80 mg veltuzumab后,患者显然具有循环B-细胞的快速清除和他的颈团块的显著消退。
该令人惊奇的结果表明,CDRH3 (Kabat 101)置换的抗-CD20人源化的抗体veltuzumab的单次80 mg皮下注射,能除去外周B-细胞,并显著收缩明显的B-细胞肿瘤块。这是如此低剂量的veltuzumab皮下注射对循环和固着的B-细胞以及NHL团块产生如此深远的影响的首次报道。
实施例17. 伊文思综合征
MT是3岁亚洲女性,从11个月龄后跟踪多种血液自身抗体和全血细胞减少症。在她11个月龄时出现腹泻,腿上出现红斑,便血,在头、颈、躯干和四肢上出现弥散性瘀点和紫癜,颈腺病,包括几个1-cm 腋窝***、轻微肿大的脾、增加的疲劳、降低的食欲、碰伤、和外周血涂片上的爆发(blasts)、增加的沉降率(116 mm/h)、升高的D-二聚体,且骨髓抽吸物表现出细胞过多的骨髓(>90%细胞构成),富含红色的、骨髓样和巨核细胞前体(看到成熟停止中幼粒细胞/晚幼粒细胞水平,但是成熟的嗜中性粒细胞)。红细胞前体也表现出一些成熟停止,但是没有细胞遗传异常。实验室研究也指示免疫球蛋白IgA、IgG和IgM的升高和循环CD19+ B-细胞的增加 (48%)。也证实了强阳性的嗜中性粒细胞抗体和强阳性的血小板抗体,具有Ilb/IIIa 特异性。首先给患者施用甾类,但是具有差的或没有起始反应。因此,给她施用2个利妥昔单抗疗程。在第一个疗程中,她接受4个每周剂量,血小板计数被稳定,但是她持续贫血和中性白细胞减少症。她的CD20和CD 19 淋巴细胞降低,但是仅5-6周后,这些急剧增加。第二个利妥昔单抗疗程包括3个每周剂量,在几周内,她的血小板计数、血红蛋白和绝对嗜中性粒细胞恢复正常,在2-3个月后,红细胞和血小板抗体消退。该利妥昔单抗减轻持续了9个月,但是随后在常规CBC中注意到血小板减少症,并再次检测出红细胞、嗜中性粒细胞和血小板抗体。然后给患者施用***和静脉内免疫球蛋白,表现出部分反应。
然后施用第三个利妥昔单抗疗程,2个每周剂量,产生2次过敏反应发作,需要攻击性医学管理。2-3个月后患者表现出暂时的反应,但是复发全血细胞减少症和血液抗体。患者自患病以来为贫血而输血,红细胞抗体和贫血是她的最突出的问题,间歇发作血小板减少症;她对甾类或静脉内免疫球蛋白无响应。
由于下一个选择是脾切除术或细胞毒性的化疗疗程,给她施用veltuzumab实验方案,其由以下组成:皮下10 mg,在2周后,皮下地重复施用10 mg剂量的veltuzumab。在第二剂量之前,发现循环CD19-阳性的B-细胞的清除,并观察到她的红细胞和血小板计数的改善。在第二次皮下注射veltuzumab后2周,患者的一般状况显示出改善,她的红细胞、嗜中性粒细胞和血小板抗体几乎不能检测出,所有血液异常表现出显著改善,血小板、嗜中性粒细胞和RBC数在正常范围的下档。在治疗后2个月,患者继续减轻。在veltuzumab治疗期间的任意时间,没有观察到任何过敏反应的证据,表明对利妥昔单抗没有免疫交叉反应性,且非常低的veltuzumab皮下剂量在该伊文思综合征患者中是治疗性的。
实施例18. 慢性淋巴细胞白血病
RT是具有3年慢性淋巴细胞白血病病史的47岁女性,在阿仑珠单抗 (CAMPATH®)疗程后现在复发,但是以前的病史表明,她具有对苯丁酸氮芥和其它细胞毒性药物的不同持续时间的反应。她现在在她的骨髓中呈现CLL证据,以及58,000/cmm的突出爆发的升高的外周淋巴细胞数。给她皮下注射40 mg veltuzumab,每周2次,持续6周,在第二次注射后,外周淋巴细胞数降低了55%。在第四次皮下注射后2周,它的外周血计数轻微超过正常范围,但是更重要的是,骨髓抽吸显示出明确良好的部分反应,疲劳、瘀点和弥散性肿大的颈和其它***的临床照片急剧改善。
实施例19. 免疫性血小板减少性紫癜 (ITP)
RH是具有1.5年ITP病史的66岁男性,4种先前治疗,没有脾切除术,并呈现在基线的26,000血小板/cmm。给他皮下地施用2剂量的40 mg veltuzumab,间隔2周。在第二次注射之前,他的血液CD 19+ 淋巴细胞测量显示出>90%降低。在第二次注射veltuzumab后2周,他的血小板计数显示出倍增,在治疗后第5周增加至70,000,维持至第11周,这时血小板计数再次下降到<5,000/cmm的计数。然后给患者重新治疗2次皮下30 mg veltuzumab,间隔2周。在第二次注射后4天,血小板计数升高至28,000/cmm,然后在治疗后第3周升高至42,000/cmm。在治疗后第6周,血小板计数显著提高至67,000/cmm,认为患者具有良好的部分反应,在veltuzumab治疗期间没有出血或瘀点的证据,并恢复全时活性和工作。
实施例20. 类风湿性关节炎
FH是37岁女性,她在3个月内逐渐发展成疼痛的关节,尤其是她的腕,具有约40 min的疼痛和清晨僵直。在检查时,她的腕和她的双手的掌指关节都肿胀和触痛,但是没有变形;没有结节或脉管炎病变。她具有30 mg/l的升高的C-反应性蛋白(CRP)水平,但是另外的化验检查所见正常,但是具有阳性类风湿因子和抗细胞核抗体。她显然是在RA初期,并首先用布洛芬治疗。但是,尽管有一些初期症状改善,手的疼痛、僵硬和肿胀持续,2个月后,她的膝受到类似影响。在初次呈现后6个月,她发展成在左肘上的3个皮下结节,小的、无痛且不动,但是不会触痛。手的X-射线表明掌骨头中的骨侵蚀,再次出现升高的CRP (53 mg/l)。现在给她皮下地施用120 mg veltuzumab,进行3次每周一次的注射。在第二次注射后,出现她的第一个改善证据,这时她注意到,她的早晨关节疼痛和僵硬降低至约15分钟,且在第三次注射后2周内,她经历改善的活动性,她的关节看起来具有减少的肿胀,且她的CRP水平降低至15 mg/l,轻微高于正常范围。在接下来的8周随访中,她的症状和RA迹象显著改善。在veltuzumab治疗期间或此后的2个月内,不需要甲氨蝶呤或甾类治疗。
实施例21. 干燥综合征并发关节炎
K.S. 是41岁的女性,她是评价口干燥的口腔外科医师。除了升高的沉降率(ESR, 60 mm/h)以外,她没有显著的实验室异常。2个月后,她发展轻度结膜炎和眼痛。她的类风湿因子变成阳性的,她的总血清蛋白升高(100g/l),她的IgG水平也升高(30 g/l)。希尔默试验是显著异常的(右眼仅3 mm的滤土带和左眼仅1 mm的滤土带变湿)。用甲基纤维素滴眼剂治疗她,以防止角膜溃疡,经过下一年后,显示出类风湿因子滴度和抗-细胞核抗体的稳定升高,也产生她的手和腕中的多关节炎变化的证据。认为她具有轻度干燥综合征,并接受非类固醇类抗炎药(NSAID)来治疗关节炎,但是这些对干燥复征没有作用。然后给她施用veltuzumab疗程,从静脉内输注15 mg开始,1周后每周进行皮下注射40 mg veltuzumab另外3次。结束该疗程后2周,她的多关节炎症状和迹象表现出显著改善,但是最突出的效应是她的流涎症的改善,这通过改良的希尔默试验证实。该患者现在仅具有微小的口干燥,没有结膜炎或眼痛,该减轻维持了4个月。
实施例22. 肾移植期间的脱敏作用
SW是56岁、55 kg的妇女,以前有5次活产,患有末期肾病,正在等待移植来替换她的左肾。她是高度HLA敏化的,显示出抗-HLA抗体的高滴度。她正在接受常规血液透析。为了经受肾移植,她需要对抗-HLA抗体的脱敏作用,因此施用一次静脉内120 g剂量的人多克隆免疫球蛋白(10%制剂),4天后皮下注射40 mg veltuzumab。在第8天、第12天和第21天,重复veltuzumab 皮下注射。第一次注射后,血液CD 19+ B-细胞完全消失,在第四次皮下注射veltuzumab后8周,它们保持清除。
在接受静脉内免疫球蛋白之前,给她施用40 mg静脉内甲泼尼龙、650 mg口服醋氨酚和50 mg苯海拉明。在随后的veltuzumab注射之前,不施用术前用药。在该移植前治疗疗程后,在移植之前,小组-反应性的抗体水平显著降低,T-细胞流式细胞计数交叉匹配显示出50%降低。3个月后,该患者接受来自已故供体的肾移植,此后立即进行典型的诱导治疗(30 mg阿仑珠单抗,皮下),然后进行由***、吗替麦考酚酯和他克莫司组成的免疫抑制治疗,在下一年逐渐减少,并施用预防性抗生素。在移植后一年的监测中,她没有排斥发作,她的肾功能正常化。这看起来是非常有效地脱敏需要肾移植的患者的成功案例,导致成功的移植。
实施例23. 抗-CD20抗体的结构-功能关系和治疗特征
利妥昔单抗(引入淋巴瘤和自身免疫病治疗中的第一种嵌合的抗-CD20 MAb)的改良方案包括,通过CDR-移植(人源化)减少鼠组分,从转基因小鼠制备全人MAb,靶向不同的CD20 表位,和通过改变Fc结构增强CDC或ADCC活性 (Forero 等人, Proc 99th Ann Meeting of
the Am Assoc Cancer Res, 2008, abstract LB-70; Glennie 等人, Mol Immunol. 2007,
44:3823-37)。但是,尚不知道哪些这样的修饰会产生更有效的抗-CD20 MAb,如通过患者中的B-细胞消除、自身免疫的控制或淋巴瘤反应所测得的,特别是当它们抗拒或耐受利妥昔单抗时。
目前,利妥昔单抗会在约半数的滤泡淋巴瘤患者中诱导客观反应(objective response),主要是部分反应(Castillo 等人, Exp Hematol. 2008,
36:755-768),然而最佳治疗量和计划仍然是不确定的。尽管在过去十年中利妥昔单抗被用于基本上所有的NHL患者,它的作用机理以及其它抗-CD20 MAb的作用机理(在模型***或患者中)仍待讨论,其中许多研究证实了CDC、ADCC介导的细胞杀伤和具有细胞凋亡效应的直接信号传递 (Glennie 等人, Mol Immunol. 2007,
44:3823-37; Maloney, Hematology Am Soc Hematol Educ Program.2007 ':226-232;
Martin 等人, Semin Hematol.
2008;45:126-132.)
因为我们观察到,与依帕珠单抗相组合的利妥昔单抗在NHL患者中表现出提高的反应的证据,没有超过利妥昔单抗单一疗法引起的那些的增加的副作用 (Goldenberg, Expert Rev
Anticancer Ther. 2006, 6:1341-1353; Leonard 等人, J Clin Oncol. 2005, 23:5044-5051;
Strauss 等人, J Clin Oncol. 2006,
24:3880-3886),我们最初的目的是,构建人源化的抗-CD20 MAb,其可以与依帕珠单抗相组合,但是更能耐受快速输注,因为具有依帕珠单抗的FR。veltuzumab的第一个表征研究报道了在表位结合、亲和力、ADCC、CDC和体外细胞生长抑制方面与利妥昔单抗的相似性(Stein 等人, Clin Cancer Res. 2004,
10:2868-78)。在治疗具有无痛NHL的患者后,证实了预期的提高的耐受性和输注特性,但是也发现了高完全反应比例(CR/CRu)。在82位无痛NHL患者中的I/II期试验证实了测试的所有剂量的完全反应比例(对于80至750 mg/m2 的剂量、每周1次x 4周,所有滤泡淋巴瘤患者的27%) (Morschhauser 等人, Proc Am Soc Clin Oncol,
J Clin Oncol. 2007, 25(18S):449s, Abstract 8032; Goldenberg 等人, Proc Amer Soc Clin
Oncol, J. Clin. Oncol. 2008, 26(15S): 142s, Abstract. 3043; Morschhauser 等人, J Clin Oncol 2009 JuI
10;27(20):3346-53. Epub 2009 May 18)超过了在可比较患者中重复使用常规剂量的利妥昔单抗所报道的那些(Davis 等人, J Clin Oncol. 2000,
18:3135-3143)。这些发现提示我们重新评价veltuzumab相对于利妥昔单抗的功能性质。
在食蟹猴中的研究(实施例12)已经证实了不同的静脉内和皮下剂量的效应,我们发现,通过任一种途径施用的低至相当于在人中80 mg/m2的单次剂量足以有效地诱导外周血和淋巴器官B-细胞清除。另外,在单次腹膜内或皮下施用低至0.05 μg剂量后,在携带CD20+ 淋巴瘤异种移植物的小鼠中,证实了增强的存活和甚至治愈。在这些小鼠研究中,观察了剂量-响应,但是没有发现静脉内或皮下途径之间的显著差异。
尽管不同的抗-CD20 MAb已经表现出功能性质和表位特异性的一些变化,介导不同的CDC和细胞-杀伤效应 (Nishida 等人, Int J Oncol. 2007,
31:29-40),基本上都识别大的胞外环,且部分地或完全地彼此交叉阻断(crossblock)(Polyak 等人, J Immunol .1998,
161:3242-3248; Polyak和Deans, 2002, 99:3256-3262; Perosa 等人, Blood 2006, 107:1070-1077),例外是ofatumumab,据报道它会结合新颖的CD20表位 (Teeling 等人, J Immunol. 2006,
177:362-371)。Veltuzumab交叉阻断利妥昔单抗的结合 (Stein 等人, Clin Cancer Res. 2004,
10:2868-78),暗示两种MAb识别相同的表位,或结合邻近的表位会导致位阻。
在上面的实施例中,通过Scatchard分析(实施例3)和离开速率测量(实施例5),对比了veltuzumab和利妥昔单抗的结合和解离参数。Scatchard分析证实,veltuzumab和利妥昔单抗具有类似的对细胞-表面 CD20的亲和力和每个细胞的结合位点数目(实施例3)。令人惊奇地,在测试的所有3个人淋巴瘤细胞系中,以更慢的离开速率 (即,更长的细胞-表面停留),发现了veltuzumab或cA20相对于利妥昔单抗或D101N的统计上显著的差异(实施例5),和与利妥昔单抗或D101N相比,更高的CDC-介导的veltuzumab对Daudi 淋巴瘤细胞的细胞杀伤 (实施例8)。不论在有或没有竞争结合剂veltuzumab和cA20(二者含有Asp101来替代在CDR3-VH中的Asn101)存在下测量,产生了比利妥昔单抗或D101N显著(P<0.0001)更慢的离开速率(~2.5-倍) (实施例5)。
veltuzumab在Daudi中的CDC活性显著超过利妥昔单抗或D101N的证实也是吸引人的,因为veltuzumab的Fc部分源自依帕珠单抗的Fc部分,后者没有表现出CDC功能(Carnahan 等人, Mol Immunol. 2007,
44:1331-41)。这表明,依帕珠单抗的快速内化可能阻止它停留在细胞表面足够长,所以不会形成膜攻击复合物。上述结果也表明, veltuzumab和利妥昔单抗之间的离开速率差异与在Daudi细胞中观察到的增强的CDC(关于ofatumumab首次提出)无关 (Teeling 等人, Blood 2004,
104:1793-1800),因为在也表现出与利妥昔单抗相比veltuzumab显著更慢的离开速率的2个其它细胞系中没有观察到CDC的该差异(实施例5和8)。因为这些veltuzumab结果明显涉及不同于ofatumumab的CD20的靶向表位,这种离开速率变化似乎不是由于表位的位置,正如Teeling 等人(2004)所假设的。尽管如此,正如Teeling 等人(2004)关于ofatumumab所提出的,并在本文中关于veltuzumab所报道的,这种离开速率变化可能解释为什么给定的抗-CD20抗体在比其它MAb (例如,利妥昔单抗)更低的浓度起作用,例如我们已经使用veltuzumab发现 (实施例12和13)。尚不知道CDC是否起作用。
这些差异不可能与具有依帕珠单抗的FR的veltuzumab有关。cA20的VH和VK链在6个位置不同于利妥昔单抗,但是除了在CDRH3中的101-残基以外,剩余的5个残基 (2个在FR4-VH中,3个在FR1-VK)不可能引起有差别的离开速率。Du 等人(Mol Immunol. 2008,
45:2861-2868)报道了与利妥昔单抗相比,另一种抗-CD20 MAb(c2H7)的CDR的更弱的相互作用,表明2H7在CDRH3的等效位置处的氨基酸残基具有更庞大的侧链,产生更宽的口袋来容纳CD20肽。cA20和veltuzumab具有基本上相同的亲和力和离开速率,然而与veltuzumab 相比,cA20具有更类似于利妥昔单抗的FR的事实突出了在与CD20的相互作用中,CDR比FR更关键的作用。因而,在veltuzumab/cA20和利妥昔单抗/D101N之间的离开速率中观察到的显著差异明显是由于CDRH3中的单个氨基酸差异,不是由于veltuzumab和利妥昔单抗之间的FR的更广泛的差异。因此,我们认为,这是证实的造成功能效应的CDR中的首个单个氨基酸变化,产生更有效的抗体。
本文所述的体外离开速率和CDC差异与用另一种抗-CD20 MAb(ofatumumab)的发现相当,据报道,后者会结合不同于利妥昔单抗的表位(Teeling 等人, J Immunol. 2006,
177:362-371),并声称具有比利妥昔单抗更高的体外治疗活性(Teeling 等人, Blood 2004,
104:1793-1800)。但是,这与选择相当高剂量的ofatumumab用于临床研究相矛盾,也象利妥昔单抗一样需要长输注时间 (Coiffier 等人, Blood 2008,
111:1094-1100; Hagenbeek 等人, Blood 2008, 111:548609),或经证实,0.5 mg/kg (10 μg/小鼠)的最低剂量会引起淋巴瘤异种移植物的生长抑制(Bleeker 等人, Brit. J. Haematol. 2007,
140:303-312)。
已经证实,当给小鼠施用重复的10-30 mg/kg剂量时,另一种最近开发的人抗-CD20 MAb(G101,其具有II型抗-CD20 MAb的性质)(Umana 等人, Ann Oncol. 2008, 19
(Suppl 7), abstract 98)在体外和在动物模型中比利妥昔单抗更有效(出处同上) 。这相当于在20-g小鼠中重复施用200-600 μg的每个剂量,这是在测试的淋巴瘤异种移植物中表现出高抗-生长活性的0.05- 0.35 μg veltuzumab的单次剂量的至少4,000至12,000倍高(实施例11和13)。鼠NK细胞和嗜中性粒细胞的清除会预防veltuzumab的这些效应 (实施例10),突出ADCC体内作用,正如以前关于利妥昔单抗所证实的 (Hernandez -Ilizaliturri 等人, Clin Cancer Res.
2003;9:5866-73)。
这些体外的小鼠、猴和其它人研究表明:(i) 在临床前模型中,在利妥昔单抗的常规临床剂量的分数,或在2种其它的第二代抗-CD20 MAb的最小治疗量的分数,veltuzumab是有活性的,(ii) 与利妥昔单抗相比活性的2个可区别的差异涉及CDC和离开速率功能,和(iii)更低的离开速率似乎与CDRH3的Kabat-101残基处的单个氨基酸突变有关。
实施例24. 在复发的非霍奇金淋巴瘤 (NHL)中的低剂量veltuzumab
概要
共82位患者(34位男性,48位女性;33-85岁)接受4个每周1次剂量的80-750 mg/m2
veltuzumab,研究评价持续12周,直到疾病恶化。他们具有滤泡(FL, N=55)或其它(N=27) B-细胞NHL,在研究开始时主要是III/IV期(79%),并接受了1-7个先前治疗方案(中间值, 1.5),大多数(89%)包括至少一个含有利妥昔单抗的方案。
Veltuzumab通常被良好耐受,药物相关的不利事件是暂时的(1-2级),在更低的剂量具有更短的输注时间(通常开始2 h,然后1 h)。在滤泡淋巴瘤中,24/55位患者具有客观反应(OR, 44%),15位(27%)完全反应(CR/CRu)甚至在2-5个先前利妥昔单抗-方案之后发生,具有更不利的预后(升高的LDH、肿瘤 >5 cm、FLIPI ≥2),且在所有剂量水平。在其它B-细胞NHL中,5/6的边缘区淋巴瘤患者具有OR (83%),包括2个CR/CRu的(33%),1个在80 mg/m2,而3/7的弥散性大B-细胞淋巴瘤患者具有部分反应(43%),包括1个在80 mg/m2。甚至在80 mg/m2,B-细胞在第一次输注后被清除,且平均抗体血清水平超过了被认为对于抗-CD20治疗而言重要的值(25 μg/mL) (在该剂量在反应者中显现更高的水平),治疗后血清清除类似于利妥昔单抗或比其更慢。
背景
嵌合的抗-CD20 单克隆抗体(MAb)利妥昔单抗 (Rituxan®; Genentech,
South San Francisco, CA; Biogen Idee Pharmaceuticals, San Diego, CA)在十多年前被批准用于治疗复发的或难治的低级或滤泡CD20阳性的B-细胞淋巴瘤。在该群体的关键试验中,将375-mg/m2剂量每周施用1次,进行4个连续周,产生48%总反应率(6%完全反应) (McLaughlin 等人, J Clin Oncol
16:2825-2833, 1998.) 。从该初步成功扩展开,利妥昔单抗已经被广泛地用于B-细胞恶性肿瘤 (Traullé和Coiffier, Future Oncol
1:297-306, 2005; Marcus和Hagenbeek, Eur J Haematol Suppl 67:5-14, 2007; Cheung 等人, Cancer Treat Rev 33:
161-176, 2007),主要与化疗相组合(例如,Czuczman 等人, J Clin Oncol
22:4711-4716, 2004; Coiffier 等人, N Engl J Med 346:235-242, 2002),以及用于自身免疫障碍 (Chambers和Isenberg, Lupus
14:210-214, 2005; Silverman, Front Biosci 12:2194-2206, 2007; Cohen 等人, Arthritis Rheum
54:2793-2806, 2006; Hauser 等人, N Engl J Med 358:676-688, 2008)。为了增加效能、降低毒性(主要是输注反应)或免疫原性、并允许更快速的给药,已经构建了第二代抗-CD20抗体 (Dörner和Burmester, Curr Opin
Rheumatol 20:263-268, 2008; Martin 等人, Semin Hematol 45:126-132, 2008;
Genovese 等人, Arthritis和Rheumatism 54:S66, 2006;
Morschhauser 等人, Blood 110:199a, 2007;
Hagenbeek 等人, Blood 111:5486-5495,
2008; Coiffier 等人, Blood 111:1094-1100, 2008)。
veltuzumab (hA20)是CDR (互补性决定区)-移植的、人源化的、抗-CD20 IgG-κ MAb,其用与利妥昔单抗相同的轻链CDR和重链CDR1和CDR2构建,但是具有不同的CDR3-可变区-重链构建体,且剩余的框架区取自依帕珠单抗,即一种人源化的抗-CD22 MAb (Goldenberg 等人, Proc Am Soc Clin Oncol
22:595, 2003; Goldenberg 等人, Proc Am Soc Clin Oncol 26:142s, 2008; 实施例1)。这些变化导致与利妥昔单抗相比重要的差异,例如在测试的所有3种人淋巴瘤细胞系中明显更低的离开速率(实施例5)和在这些细胞系之一中明显增加的补体-依赖性的细胞毒性(实施例8),同时在体外没有观察到直接增殖抑制、细胞凋亡或抗体-介导的细胞毒性方面的显著差异 (实施例6和9; Goldenberg 等人, Proc Am Soc Clin Oncol
22:595, 2003; Stein 等人, Clin Cancer Res 10:2868-2878, 2004; Goldenberg 等人,Proc Am Soc Clin Oncol
26:142s, 2008)。另外,在正常食蟹猴中(实施例12)和在携带人淋巴瘤异种移植物的小鼠中(实施例13)的研究发现,不仅静脉内、而且皮下施用的非常低剂量的veltuzumab可以非常有效地分别清除B-细胞和控制肿瘤生长,甚至治愈大量小鼠(实施例13和14; Goldenberg 等人, Proc Am Soc Clin Oncol
26:142s, 2008)。
Veltuzumab的第一个临床试验是在具有威胁生命的细胞减少症的年轻***性红斑狼疮(SLE)患者中,其已经变得耐受标准的抢救药物,且不再对利妥昔单抗产生反应 (Tahir 等人, Rheumatology 44:561-562,
2005)。Veltuzumab能够清除外周B-细胞水平,甚至在面临非常高血清水平的抗-利妥昔单抗抗体时(HACA 43,000 ng/mL; 正常<5 ng/mL),且患者快速反应。
因为使用利妥昔单抗的大多数经历是在非霍奇金淋巴瘤 (NHL)中,进行本实施例来表征veltuzumab在该群体、特别是滤泡或低级淋巴瘤中的基本安全性、耐受性、药代动力学、药效动力学、免疫原性和初步效能 (Morschhauser 等人, Blood 106:683a, 2005;
Morschhauser 等人, Blood 108:769a, 2006;
Morschhauser 等人, Proc Am Soc Clin Oncol
25, 449, 2007)。下面提供了完全试验结果,包括现在治疗至少6个月的最后进入的患者和现在持续减轻超过3年的几位最早患者的随访。
方法
进行了veltuzumab的标签公开的、单臂、多中心I/II期研究,通过静脉内输注施用给具有难治的或复发的NHL的患者,以评价veltuzumab在具有难治或复发的NHL的患者中的安全性和有效性。研究终点是安全性、效能 (客观和完全反应比例、反应持续时间、恶化时间)、药代动力学、药效动力学和免疫原性。
所有患者接受每周1次的剂量,持续4个连续周。研究的最初部分登记了用从120 mg/m2至750 mg/m2的递增剂量水平治疗的队列,即高达利妥昔单抗的常用剂量的2倍。在研究的第二部分中,其它患者接受375 mg/m2和以下的veltuzumab (Morschhauser 等人,Blood 106:683a, 2005)。显而易见,在所有剂量水平发生客观反应(增加的完全反应),没有明显的剂量反应(Morschhauser 等人, Blood 108:769a, 2006),这与在动物研究中的观察结果一致,即低剂量的该抗体可能是有效的(实施例13)。因为甚至更低剂量的veltuzumab (包括60 mg/m2)已经在几位其它的具有中等SLE活性的患者中表现出前景(实施例15),修改了该方法,用80 mg/m2的更低剂量水平治疗在该研究中登记的最终患者(Morschhauser 等人, Proc Am Soc Clin Oncol
25, 449, 2007)。
患者群体——为了合格,按照WHO标准已经记录CD20+ B-细胞NHL的成年人必须已经失败至少一种NHL的先前的标准化疗方案或利妥昔单抗治疗,且具有可测量的疾病,至少一个病变 ≥1.5 cm(通过CT),但是没有团块>10 cm。患者必须在任何利妥昔单抗之后至少12个月,在利妥昔单抗治疗的6个月期间或之内没有恶化,对利妥昔单抗是NCI CTC等级3或4毒性,或已知的HACA阳性。合格条件还要求血红蛋白≥ 10 g/dL,ANC ≥ 1.5 x 109/L,血小板 ≥ 100 x 109/L (都没有输血支持),肌酸酐和胆红素≤ 1.5 x 正常惯例上限(IULN), AST和ALT ≤2.5 x IULN,0-1 ECOG或KPS ≥ 70体力状态,生命期望 ≥ 6个月,在任何自体干细胞移植后12周,和在任何化疗、其它实验治疗或对指标病变的任何辐照治疗后4周。具有初期中枢神经***淋巴瘤、HIV 淋巴瘤、转化的淋巴瘤、有症状的中枢神经***转移或癌性脑膜炎、淋巴瘤阳性细胞学的胸腔积液、先前放射免疫疗法、或先前用其它人或人源化的单克隆抗体治疗(除非HAHA测试是阴性的)的患者是不合格的。其它排除标准是已知的HIV、乙型肝炎或丙型肝炎阳性、已知的自身免疫病或存在自身免疫现象、在5天内有感染或抗生素使用、在2周内使用过皮质类甾醇类、在5年的其它癌症(除了非黑色素瘤皮肤癌或原位***以外)、和可能干扰研究判读或操作的其它病症。具有怀孕可能的妇女必须具有阴性的妊娠试验,且具有怀孕可能的患者必须在治疗后至少12周进行生育控制。
治疗——veltuzumab每周施用,持续4个连续周。所有患者每周预先用药抗组胺和解热药,但是没有常规地施用甾类。在剂量增加期间,3-6位患者的队列接受120、200、375和750 mg/m2递增剂量水平的veltuzumab,随后患者接受80、120、200或375 mg/m2的veltuzumab。对于在没有输注反应存在下保持稳定的患者,veltuzumab 输注指南允许每15-30分钟增加输注速率,增量为50 mg/h(对于第一次输注)和100-200 mg/h(对于后续输注)。在其它情况下,推荐的动作包括:减慢输注速率(对于轻度毒性);中断输注(对于中等毒性)至少15分钟或直到症状消退,然后继续减慢的输注速率,如果患者是稳定的;和永久停止输注(对于更严重的毒性)。
数据收集——在基线和最后一次输注后4周,得到CT扫描(颈、胸、腹、骨盆、其它已知疾病部位)和体格检查。没有疾病恶化的患者在第12周和以后每3个月继续CT扫描和体格检查,直到发生疾病恶化。在基线和在具有骨髓浸润的那些患者中(仅在需要证实完全反应时),要求骨髓活组织检查。在输注过程中,监测患者的不良反应,在结束前每15 min得到生命体征,然后在30和60 min后。在最后一次输注后4和12周,继续监测它们的不利事件进行评价,然后每3个月,直到任何治疗有关的异常或其它变化消退,以保证另外的随访。在每次输注之前、最后一次输注后4和12周、然后每3个月,得到用于常规安全性试验(血清化学,血液学)的血样和体格检查,用于追踪评价,直到疾病恶化。
在每次输注之前、在最后一次输注后1、4、8和12周、和在每3个月的随访期间,得到用于B-细胞计数 (CD 19+)的血样,直到降低的水平返回基线。在基线、在最后一次输注之前、在最后一次输注后4和12周、然后在每3个月的随访期间,测定尿分析、用于T-细胞水平(CD3+)和血清免疫球蛋白的血样,直到任何治疗有关的异常消退。在每次输注之前和每次输注后30分钟,在第一次和最后一次输注后24、48、72和96小时,然后在最后一次输注后1、2、3、4、8和12周,得到用于测定veltuzumab 血清水平的血样。在基线,在最后一次输注后4和12周,然后在随访期间(如果阳性,在12周),得到用于测定免疫原性 (HAHA; 人抗-veltuzumab抗体)的血样。
研究评价——使用国际工场标准 (Cheson 等人, J Clin Oncol. 1999,
17:1244-1253),测定治疗反应,将每位患者的最好反应分类为完全反应(CR)、未经证实的完全反应 (CRu)、部分反应 (PR)、稳定的疾病或渐进性疾病。根据MedDRA ***器官分类和优选的术语,分类不利事件(AE)。AE和试验的毒性分级使用国家癌症研究所(National Cancer Institute,NCI) 通用毒性标准(CTC) 3.0版。将剂量限制毒性 (DLT) 定义为任何治疗有关的3或4级毒性或下述2级事件:自身免疫反应、无症状的支气管痉挛或泛发的荨麻疹。局部地测定所有试验值,除了veltuzumab 血清水平和HAHA测定以外,它们使用ELISA试验由资助人进行。使用WinNonLin 2.1 (Pharsight
Corporation, Mountain View, CA),利用一室模型,评价在最后一次输注后的药代动力学。
统计分析——使用描述统计学总结人口统计数据、安全性和实验室数据、和治疗反应率,包括精确的95%置信区间(在指出时)。使用描述统计学以及基于Kaplan-Meier结果限制方法的统计学,总结疾病无恶化的生存(PFS),将其定义为研究第一天给药至疾病恶化 (基于身体或放射学(CT)证据)、死亡或最后接触(最早发生者)那天的持续时间。如果他们没有经历疾病恶化或死亡,认为患者是被检查过的。使用类似的方法,总结反应持续时间,将其定义为从发生客观反应(OR)(即CR、CRu或PR)第一天至疾病恶化、死亡或最后接触(最早发生者)那天的持续时间。
结果
患者特征——登记了共82位患者(34位男性,48位女性,年龄中位数64岁)。他们离初次诊断的中值为5年,离最后一次治疗的中值为1.8年。研究开始时,大多数患者处于良好体力状态 (83% ECOG 0),但是具有泛发的疾病(79% III/IV期),且17位患者(21%)具有升高的LDH,30位(40%)具有至少一个肿瘤块 > 5 cm。所有患者接受至少一种先前治疗方案(范围为1-7),大多数患者(89%)已经接受至少一种先前的含有利妥昔单抗的方案。基于WHO 分类 (Harris和Ferry, 2001),55位患者具有滤泡淋巴瘤 (FCL),同时27位患者具有非-滤泡淋巴瘤: 弥散性大B-细胞淋巴瘤 (DLBCL,N=7),外套细胞淋巴瘤 (MCL,N=7),小淋巴细胞淋巴瘤 (SLL,N=5),边缘区淋巴瘤 (MZL,N=6) [包括结节的MZL (N=2)和粘膜相关淋巴样组织的结节外的MZL (MALT, N=4)],和淋巴浆细胞样淋巴瘤 (N=2)。使用公开的标准来分配FLIPI和IPI评分,以分别评价滤泡和非滤泡淋巴瘤患者的差结果的风险 (Solal-Celigny 等人, Blood 104:1258-1265,
2004)。人口统计数据和患者特征总结在表5中。
表5. 人口统计数据和基线信息
给药——在82位患者中,78位接受4次输注,3位具有疾病早期恶化的患者在完成2-3次veltuzumab 输注后退出,1位具有荨麻疹和受寒的SLL患者在第一次veltuzumab 输注时,在类似的1-2级反应后,在利妥昔单抗之前退出。基于患者的体表面积和剂量水平,按照处方施用剂量,例外是,3位患者以降低的剂量施用4次输注中的1或2次(由于过敏反应),1位患者非故意地在另一个更高的剂量水平施用1次输注。在表6中总结了施用的所有剂量的输注时间。
表6. 中值输注时间(小时)*
* 从输注开始到输注结束按小时计算的中值(范围)时间
治疗反应——在第一次输注后退出的单个患者不能评估效能。在评价的81位患者中,23位在治疗后4周第一个计划的评价时或之前具有疾病恶化,且没有经历进一步的反应评价。在其它情况下,在疾病恶化之前每位患者的最佳反应包括:10个CR、7个CRu、16个PR和25 个稳定的疾病。
计算客观反应(OR = CR + CRu + PR),总OR和CR/CRu之比分别是40.7% (33/81)和21.0% (17/81)。在滤泡淋巴瘤中,OR和CR/CRu之比分别是44% (24/55)和27% (15/55),甚至在2-5个先前利妥昔单抗-方案后发生OR和CR/CRu,在具有更不利预后的滤泡患者中(FLIPI ≥2, 升高的LDH, 团块疾病 >5 cm),且在包括80 mg/m2的所有剂量水平。在其它非滤泡淋巴瘤中,总OR和CR/CRu之比分别是35% (9/26)和27% (7/26)。这包括5/6 位具有OR的MZL患者 (83%),包括2位CR/CRu’s(33%),1位在80 mg/m2,和在3/7 DLBCL患者(43%)和1/7 MCL患者(14%)中的部分反应。表7总结了这些结果。
表7. 客观治疗反应*
对于所有55位滤泡患者,基于Kaplan-Meier估测,中值TTP是6.7个月 (95% CI: 3.7 -9.3个月),从第一次输注到OR(TTR)发作的中值时间是3.3个月 (95% CI: 1.7 -3.7个月)。24位具有OR患者的具有中值DR 10.2个月 (95% CI: 6.0 -22.6个月)和中值TTP 15.2个月(95% CI: 9.5 -28.2个月)。在图15中显示了24位反应者的Kaplan-Meier DR和TTP曲线。对于15位达到CR/CRu的滤泡患者,Kaplan-Meier估测中值DR和TTP分别是19.7个月 (95% CI: 8.7 -32.5个月)和24.2个月 (95% CI: 13.8 -34.4个月),包括5位患者从第一次输注之日仍然继续长期反应15.9- 37.6个月。尽管样品尺寸较小,完全反应的持续时间在更低的剂量没有减少,在80 mg/m2具有完全反应的单个滤泡患者在第一次输注后仍然减轻15.9个月。在非滤泡组织学中,发生的2个完全反应 (1个在80 mg/m2)以及1个长期稳定反应(都在边缘区淋巴瘤中)在治疗后仍然继续15-24个月。
不利事件——78位患者在研究过程中具有一个或更多个不利事件。在48位具有被认为至少可能与治疗有关的事件的患者中,仅1位患者具有3级事件,即在治疗后超过1年的长期减轻期间发展的低球蛋白血症。在其它方面,被认为至少可能与治疗有关的所有事件是轻度-中等(1-2级),其中大多数是主要在第一次输注时发生的输注反应,≤ 11位患者在每次随后的输注中具有这样的事件。表8总结了最常见的事件。
10位患者具有严重的不利事件,它们都没有被认为甚至可能与治疗有关,包括先前存在的心房颤动和在治疗时段内发生的事件(创伤、蜂窝织炎、脓毒病),这是在12-周治疗后评价时段(降低的体力状态、背痛、A-V畸形的偶然发现)内或长期随访期间(***、肺栓塞、泌尿道真菌感染)。
表8. 在≥5%的患者中发生的不利事件
18位患者(22%)具有一种或更多种感染。4种3-4级感染都被认为不是治疗相关的,包括3种需要IV 抗生素的感染(脓毒病、蜂窝织炎、真菌尿道感染)和1种用多次口服抗生素治疗的感染(未有特殊说明) 。在其它情况下,所有感染都是用口服药物治疗的1-2级事件,主要包括呼吸道、泌尿道或窦。
安全性试验——在每次输注之前、最后一次输注后4和12周、然后每3个月根据追踪评价的需要,得到用于血液学和血清化学测定的血样。在标准的安全性试验中没有发生异常的变化模式,几乎没有患者在治疗后具有毒性等级的增加(表9)。
表9. 安全性试验的变化: 患者具有从基线的CTC v 3.0毒性等级的增加 (N=82)
* 3级事件: 在研究开始时,3位患者具有异常试验(2级肌酸酐、2级ANC、1级血红蛋白) ,他们在第12周变成3级,而其它患者在第12周之前维持正常的WBC和ANC水平。
药代动力学 ——在药代动力学分析中,包括共72位患者,他们完成了所有4次输注,接受在预期剂量的所有veltuzumab剂量,具有在第一次和最后一次输注后收集的血清样品,且在接受veltuzumab之前具有阴性ELISA试验结果 (排除了1位患者,因为不明原因的明显妨碍血清因子)。表10总结了在每次输注之前和之后30 min的平均血清水平。在所有剂量,第一次输注时的平均峰水平超过25-μg/mL,即被认为对于维持利妥昔单抗的效能而言重要的值 (Berinstein 等人, Ann Oncol 9: 995-1001,
1998; Gordon 等人, J Clin Oncol
23:1096-1102, 2005; Cartron 等人, Crit Rev in Oncol Hematol 62:43-52, 2007)。抗体随着在所有剂量的输注次数而累积,甚至在80 mg/m2,平均波谷血清水平超过25-μg/mL,即最后一次输注的值。在最后一次输注后30 min,1、2、3和4天后,和在第1、2、3、4、8和12周,按计划收集治疗后血清样品。
表10. veltuzumab 血清水平 (平均值± 标准差): 输注之前和之后的结果(μg/mL)
用单室(单指数)模型拟合在72位患者各自中的所有可利用的治疗后血清-水平数据。表11总结了得到的拟合测定的药代动力学参数,其证实,平均Cmax和AUC随着剂量水平而增加,而清除(CL)值没有表现出剂量依赖性的一致模式。最重要的是,平均T1/2值在所有剂量表现得相当,且甚至在80 mg/m2,抗体保留在循环中,具有20天的平均半衰期。尽管没有进行正式对比,与22位其它非滤泡患者相比,50位滤泡患者的平均波峰和波谷或治疗后药代动力学没有重大差异(数据未显示)。
表11. veltuzumab 血清水平 (平均值 ± 标准差): 第四次输注后的药代动力学
类似于已经报道的利妥昔单抗的结果(Berinstein 等人, Ann Oncol 9: 995-1001,
1998; Gordon 等人, J Clin Oncol
23:1096-1102, 2005; Cartron 等人, Crit Rev in Oncol Hematol 62:43-52, 2007),在具有客观反应的患者中在每次输注时的平均和中值波峰和波谷血清水平通常高于无反应者,尽管患者数目较少,甚至对于用80 mg/m2的最低剂量治疗的那些患者。在表12中总结了具有可利用数据的所有滤泡患者在输注之前和之后的中值结果。
表12. 在滤泡淋巴瘤反应者和无反应者的治疗期间的veltuzumab 血清水平
B- 细胞和其它免疫学变化——在基线、在每次输注之前、在最后一次输注后4周、然后以3个月间隔直到恢复基线,测定外周血B-细胞水平(CD 19+)。在研究开始时,68位患者具有低或低-正常的外周血B-细胞水平 (1-256细胞/μl, 中值60),9位患者(包括所有5位SLL患者)具有升高的水平 (572-14,712细胞/μl, 中值1,782),5位患者没有测得基线水平。
图15描绘了具有在基线的未升高的B-细胞水平且在治疗期间得到至少一个样品的所有患者的B-细胞水平时程。在将B-细胞水平报道为总淋巴细胞的百分比的试验中,低于定量下限 (通常1%)的降低不可测出,且对于分析,在将结果转化成绝对细胞数之前,保守地设定在该限度。这样,实际的B-细胞清除范围可能更完全,但是尽管如此,对于所有剂量水平(包括80 mg/m2的最低剂量水平)而言,结果显得相当。
B-细胞通常保持清除,直到最后一次输注后6个月发生恢复,然后降低的值经过9-12个月恢复到基线,没有证据表明,B-细胞清除在更低的剂量水平的持久性更低,尽管对于在最近的80 mg/m2的剂量水平治疗的患者而言,长期数据仍然有限。
为了清楚,在图14中没有包括在研究开始时具有升高的B-细胞水平的很少患者。尽管极大增加了基线值,特别对于SLL患者,他们的B-细胞水平也基本上随着治疗而降低(中值96%降低),包括以80 mg/m2治疗的1位患者中的94%降低。但是,这些主要是短暂反应,大部分在不迟于最后一次输注后12周开始恢复升高的基线值。
对于保持随访的患者,在基线、在最后一次输注之前、4和12周后、然后每3个月,从评价的血样得到定量血清免疫球蛋白和T-细胞水平。在12-周研究时段期间,或在更小的随访患者子集中至最后一次输注后1年,临床上显著的降低没有一致的模式,从基线的中值变化在大多数时间点较小(通常<5%(对于IgA和IgG),<15%(对于T细胞),<20%(对于IgM))。
免疫原性 (HAHA)——70位患者具有至少一个治疗后血清样品,它是在最后一次输注后4周 (N=58)、12周 (N=53)、6个月 (N=8)或1年 (N=2),用于通过ELISA试验分析HAHA。1位具有先前利妥昔单抗暴露的SLL患者在研究开始是阴性的,但是在治疗后4周发展成升高的滴度(3,380 ng/mL),没有任何表观的临床后果。所有其它样品都是阴性的 (< 50 ng/mL)。
讨论
尽管有抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性的细胞毒性(CDC)、和具有细胞凋亡效应的直接信号传递介导的细胞杀伤的证据,抗-CD20 免疫疗法在B-细胞恶性肿瘤或不同的自身免疫障碍中的临床上有关的作用机理仍然不确定(Glennie 等人, Mol Immunol
44:3823-3837, 2007)。这样,第二代抗-CD20抗体的临床试验仍然是必要的,且它们大多数已经聚焦在接近或高于利妥昔单抗常用剂量的抗体剂量 (Morschhauser 等人, Blood 110: 199a, 2007;
Hagenbeek 等人, Blood 111:5486-5495,
2008; Coiffier 等人, Blood 111:1094-1100, 2008)。但是,包括动物研究(实施例15)以及在CLL中的削弱效应(shaving effect)的独立研究(Kennedy 等人, J Immunol 172:3280-3288,
2004; Williams 等人, J Immunol 177:7435-7443, 2006)在内的几个研究已经暗示,应当探查比利妥昔单抗所用的典型的375 mg/m2剂量更低的剂量。本结果证实,至少对于veltuzumab,在临床反应和清除外周血B-细胞的能力方面,比375 mg/m2低许多的剂量是有效的。
在该研究中的大多数患者具有滤泡淋巴瘤,veltuzumab对其具有44%的总客观反应,其在在首次利用利妥昔单抗的患者的最初关键试验中用利妥昔单抗报道的48%比例(McLaughlin 等人, J Clin Oncol
16:2825-2833, 1998),或以前对利妥昔单抗有反应的患者的40% (因为这里的许多患者先前暴露于一种或更多种含有利妥昔单抗-的方案) (Davis 等人, J Clin Oncol
18:3135-3143, 2000)之间。类似地,完全反应的比例,27% CR/CRu或16%(对于单独的CR),超过了在那些组中报道的6%和11%的完全反应比例,尽管在以前的研究中使用不同的标准。
重要的是,veltuzumab反应(包括完全反应)发生在已经接受多次先前利妥昔单抗-方案的患者中,以及在通常视作处于有利性更低的结果危险(更高的FLIPI评分,升高的LDH,肿瘤块>5 cm)的患者中。最高反应率发生在小量首次利用利妥昔单抗的患者中,达到57% OR和43% CR/CRu’s。
在该研究中在所有FL反应者中发现的10.2个月中值DR与首次应用利妥昔单抗后在复发的/难治的、无痛NHL患者中报道的11.2个月 DR相当 (McLaughlin 等人, J Clin Oncol
16:2825-2833, 1998)。尽管在用利妥昔单抗重复治疗的患者中报道了更长的15.0个月中值DR,他们都已经达到对先前利妥昔单抗的客观反应,持续至少6个月 (Davis 等人, J Clin Oncol
18:3135-3143, 2000)。相反,在该研究中的患者没有在利妥昔单抗的6个月内恶化,但是不需要客观反应。这样,它们可能是更难治的,并需要更多的时间来使veltuzumab有效,这与在该研究中3.3个月的发生反应的中值时间一致,相对于在其它利妥昔单抗研究中的1.6个月 (McLaughlin 等人, 1998; Davis 等人, 2000),而且也与在该研究中看到的15.2个月的反应者的相对更长的中值TTP相一致。
如上面所讨论的,与这些其它研究相比,使用veltuzumab似乎存在更大数目的完全反应。这是特别重要的,因为在该研究中具有CR/CRu’s的患者通常具有持久反应,中值DR和PFS目前分别是19.7和24.2个月,它们二者可以进一步增加,因为5位患者仍然持续长期反应 (15.9 -37.6个月)。因而,尽管这里研究了更低的剂量水平,当每周施用1次持续4周时,veltuzumab的效能结果表现得优于利妥昔单抗。
在非滤泡组织学中,veltuzumab达到35%的总客观反应率,具有27% CR/CRu’s。Veltuzumab在边缘区淋巴瘤中的作用特别好,在5/6位具有结节外的MALT或结节型疾病的患者(83%)中具有OR,包括3个长期反应(15-24个月),1个在仅80 mg/m2的剂量水平。因而,与以前用利妥昔单抗报道的有利反应一致 (Tsimberidou 等人, Cancer 107:125-135,
2006; Conconi 等人, Blood 102:2741-2745,
2003),veltuzumab 显示出用于边缘区淋巴瘤中的有希望的活性。
在DLBCL中,没有发生完全反应,但是3/7位患者达到部分反应,包括1位用80 mg/m2治疗的患者。这里用4个每周剂量的veltuzumab得到的43%的OR率与用8个每周剂量的利妥昔单抗在DLBCL中报道的37%率相当(Coiffier 等人, Blood 92:1927-1932,
1998)。这些有希望的活性的发现表明,veltuzumab可以与化疗联合用于该群体中,类似于使用利妥昔单抗已经发现的结论 (Czuczman 等人, J Clin Oncol
22:4711-4716, 2004; Coiffier 等人, N Engl J Med 346:235-242, 2002; Habermann 等人, J Clin Oncol
24:3121-3127, 2006),后者已经被批准与CHOP联合用于DLBCL。
7位具有外套细胞淋巴瘤的患者中仅有1位具有客观反应,即在用120 mg/m2
veltuzumab 治疗的患者中的短暂的部分反应。这与在该疾病中使用单药剂利妥昔单抗所报道的适度的反应率和主要的部分反应相一致 (Igarashi 等人, Ann Oncol 13:928-943,
2002; Foran 等人, J Clin Oncol 18:317-324,
2000)。已知具有复发的小淋巴细胞淋巴瘤的患者相对耐受单药剂利妥昔单抗 (McLaughlin 等人, 1998; Foran 等人, J Clin Oncol 18:317-324,
2000),该研究中的少数患者都没有客观反应。
但是,veltuzumab确实具有在SLL中的活性的其它证据,因为所有患者在研究开始时具有升高的B-细胞水平(3位超过10,000/mm3) ,其在第一次veltuzumab 输注后降低,且在最后一次输注后保持降低至少4周,这包括1位在80 mg/m2治疗的患者,初始水平>10,000/mm3 ,随后降低了94%。在具有沃尔登斯特伦巨球蛋白血症和免疫细胞瘤的患者中的2个利妥昔单抗研究仅报道了适度反应率,没有完全反应(Foran 等人, J Clin Oncol 18:317-324,
2000; Gertz 等人, Leuk Lymphoma
45:2047-2055, 2004),因而在该研究中具有淋巴浆细胞淋巴瘤的2位患者都不具有客观反应并不令人惊奇。
关于veltuzumab 药代动力学,在375 mg/m2用veltuzumab达到的平均波峰和波谷血清抗体水平与关于利妥昔单抗所报道的值相当(Berinstein 等人, Ann Oncol 9: 995-1001,
1998)。甚至在80 mg/m2,在第一次输注后发生B-细胞清除,在第一次输注后的抗体血清水平超过25-μg/mL,即与维持的效能有关的值 (Berinstein 等人, 1998;Gordon 等人, 2005; Cartron 等人2007),并随着每次连续输注继续增加,veltuzumab在最后一次输注后保留在循环中,具有与在利妥昔单抗研究中所报道的相当或至少同样长的半衰期 (Berinstein 等人, 1998; Cartron 等人2007)。
我们发现了在用利妥昔单抗报道的反应者中更高的血清水平的相同关系 (Berinstein 等人, 1998; Gordon 等人, 2005; Cartron 等人, 2007),且尽管数目较小,仍然可以看出该趋势,甚至对于仅用80 mg/m2的最低剂量治疗的患者。这些药物代谢动力学和药效学发现表明,更低的veltuzumab剂量足以克服抗原汇点(sink),因而支持了在该研究中在所有剂量水平(包括80 mg/m2)发生的临床活性的证实。
使用更低剂量的一个额外益处是减少的输注时间。使用veltuzumab,第一次输注中值时间是4.7小时(在750 mg/m2)、3.1小时(在375 mg/m2)和1.8-2.4小时(在更低的剂量),而后续输注的中值时间是2.1-2.6小时(在375或750 mg/m2)和1.2-1.5小时(在更低的剂量)。在这些更短的输注时间,没有严重的输注反应或更常见的输注反应的频率的增加。这是重要的,因为在该第一个研究中所述方案限制了输注速率,所以使用该药剂可能实现甚至更快速的给药。veltuzumab也对标准的安全性试验、T-细胞水平或血清免疫球蛋白没有显著的临床影响。仅发生一例HAHA反应,具有不确定的临床显著性;在其它情况下,没有veltuzumab 免疫原性的证据。
利妥昔单抗的第一个临床研究评价了10 -500 mg/m2的单次剂量,在100 mg/m2和以上的剂量实现了几个部分反应 (Maloney 等人, Blood 84: 2457-2466,
1994)。在接下来的利妥昔单抗研究中,仅125 mg/ m2和更高的剂量每周施用1次持续4周,现在在进一步开发时选择标准的375-mg/ m2剂量,显然是基于逻辑而不是科学考虑,因为在测试的每个剂量水平的实际反应率(所有部分反应)是相同的 (Maloney 等人, J Clin Oncol
15:3266-3274, 1997)。为了优化配量,显然需要更好地理解药代动力学和影响患者反应的因素 (Cartron 等人, Crit Rev in Oncol
Hematol 62:43-52, 2007),但是在利妥昔单抗的最初批准后,375-mg/m2和甚至更高的剂量被接受与抗-CD20抗体一起临床使用,没有临界评价或考虑更低的水平。但是,最近的在慢性淋巴细胞白血病中“削弱(shaving)”的证据已经引导其它人提出,低剂量在该疾病中可能是有效的 (Kennedy 等人, J Immunol 172:3280-3288,
2004; Williams 等人, J Immunol 177:7435-7443, 2006)。也预见到低剂量可以有效地抗更低的CD20肿瘤负担,例如具有小体积疾病或经历维持疗法的淋巴瘤患者,或在B-细胞介导的自身免疫病中,其中存在比恶性疾病少许多的CD20汇点,和既不需要也不希望过度侵袭性的B-细胞抑制。
总之,该实施例证实,veltuzumab不仅被很好地耐受,而且低剂量是有活性的,在评价的所有剂量(包括80 mg/m2)发生B-细胞消除和完全反应。更低的剂量也是重要的,因为存在使用更浓缩的抗体制剂通过皮下注射来递送veltuzumab的机会,正如在动物模型中已经证实的(实施例15)。
实施例25. hA20 变体
用•指示在对应的位置与v-mab相同的氨基酸残基
材料和方法
根据标准的PCR方法,进行PCR。通过Seq Wright (Houston, TX),进行DNA测序。限制酶购自New England Biolabs。引物由Fisher Scientific制备。
A. 变体V102Y
V102Y是hA20的变体,具有在VH的CDR3的102位置(Kabat氏编号)处的Val向Tyr的1个氨基酸变化。
因而,在V102Y中的CDRH3是STYYGGDWYFDY (SEQ ID
NO:21)。
载体构建和克隆方案
使用4种引物:
5' V 102 Y 引物 (40聚体)
3' V102Y 引物 (40聚体)
5' Xho I 引物 (20聚体)
3 ' Hind III 引物 (20聚体)
克隆方案如下:
DNA模板: hA20-IgG-pdHL2
5' Xho I 引物和3' V102Y 引物
PCR产物 #1: 510碱基对
DNA模板: hA20-IgG-pdHL2
5' V102Y 引物和3' Hind III 引物
PCR产物 #2: 210碱基对
从凝胶纯化PCR产物 #1和#2,以等摩尔量混合作为模板,并用5' Xho I和3' Hind III 引物进行PCR,产生PCR产物 #3 (680碱基对),将其克隆进pGEMT,并用XhoI和HindIII消化进行证实,随后测序。用hA20-IgG-pdHL2的Xho I/Hind III限制的片段连接PCR产物 #3,完成V102Y的表达载体,指定为V102Y-hA20-IgG-pdHL2)。
转染和蛋白纯化
通过用Sal I消化,线性化V102Y-hA20-pdHL2 (30 μg),继之以、苯酚、氯仿萃取,并用100%乙醇和醋酸铵沉淀。将DNA沉淀重新悬浮于电穿孔缓冲液(20 mM HEPES、pH 7.0; 137 mM NaCl、5mM KCl、0.7 mM Na2HPO4、和6 mM 右旋糖),然后与2.8x 106 SpESF细胞混合,并用电穿孔器GenePulser Xcell BioRad(电容25 μF、450 V、电阻无限欧姆、4 mm比色皿)电穿孔。加入培养基,并涂布在96-孔平板上。
48小时后,加入等体积的含有0.2 μM MTX的选择培养基。约10天后,使用包被在平板上的小鼠抗-hA20抗体和抗-人Fc-HRP缀合物,通过ELISA筛选克隆。用OPD和H2O2显色。
选择具有最高生产率(42 mg/L)的克隆,并指定为3D10。在滚动瓶中制备V102Y,用蛋白A纯化,并通过SDS-PAGE和尺寸排阻HPLC证实它的纯度。其它表征包括离开速率测定和ADCC试验。
B. 变体YDE
YDE是V102Y的突变体,具有在Fc的CH2结构域上的2个氨基酸突变: S 239 D (TCA -> GAT)和I 332 E (ATC -> GAA)
象V102Y一样,在YDE中的CDRH3是STYYGGDWYFDY (SEQ ID
NO:21)。
载体构建和克隆方案
为2个氨基酸突变设计了6个引物:
5' PstI-Fc
(20聚体)
3' S239D (23聚体)
5' S239D (23聚体)
3' I332E (23聚体)
5' I332E (23聚体)
3' PstI-Fc
(20聚体)
克隆方案如下:
DNA模板: 1826-SV3 (内部分期载体)
PCR#1: 5'
PstI-Fc和3' S239D引物-> 207碱基对
PCR#2: 5'
S239D和3' I332E引物-> 303碱基对
PCR#3: 5'
I332E和3' PstI-Fc引物-> 477碱基对
凝胶纯化每个PCR产物,以等摩尔浓度混合,得到PCR#4 (941碱基对),使用5' PstI-Fc和3' PstI-Fc作为引物。将PCR#4克隆进pGEMT,并通过测序证实。然后用PstI消化来自pGEMT的片段,并克隆进中间体载体1826-SV3,其也用PstI消化。将EagI-限制的 V102Y-hA20-IgG-pdHL2连接到用EagI从分期载体切下来的PCR#4,完成最终的YDE-hA20-pdHL2的构建。
转染和蛋白纯化
使用上面关于V102Y所述的相同操作,得到YDE的生产克隆,通过蛋白A从细胞培养物纯化,并通过SDS-PAGE和SE-HPLC证实它的纯度。经证实,与v-mab或V102Y相比,YDE具有增强的ADCC。
C. 变体v-mab-DE
v-mab-DE是v-mab的Fc变体,在Fc的CH2结构域上具有与YDE相同的氨基酸突变。使用在实施例2中关于YDE所述的相同引物和克隆方案,构建表达载体v-mab-DE-hA20-pdHL2,其尚未转染。
hA20变体的ADCC试验
如下进行ADCC试验。简而言之,以104细胞/孔,在50 μL试验培养基(RPMI 1640,无酚红, 1% Glutamax, 1%
PenStrep)中,将Daudi细胞涂布平板。一组孔仅接受培养基作为背景对照,另一组孔仅接受细胞,并用作最大细胞溶胞作用的对照。
对于每个试验,使用从一个供体收集的PBMC。将血液抽入肝素化的试管中(接近50ml血液/供体), 在此时,使用UNI-SEP maxi试管(NOVAmed, LTD.)进行淋巴细胞的密度梯度分离。在1.6x107细胞/mL,从每位供体得到接近3 ml PBMC。
每个试验使用40-1,5 μg/ml抗体的效应物/靶物比。在控湿培养箱中在37℃、5% CO2培养4-h后,从培养箱取出平板,使其达到室温,并根据生产商的手册,用CytoTox-One Homogenous
Membrane Integrity试验试剂盒进行分析。使用下式,测定在6次重复中每个样品的溶胞作用的百分比:
下表总结了用Daudi作为来自3个供体的靶细胞得到的ADCC结果(%溶胞作用)。对于每个供体,YDE和v-mab或V102Y之间的差异是统计上显著的 (p<0.0001(对于供体009); p<0.0002 (对于供体006); p< 0.02(对于供体001)。v-mab和V102Y之间的差异不是统计上显著的。同种型对照(h734 IgG) 显示出微小的ADCC。
参考本公开内容,无需过多实验,可以制备和使用本文公开和要求保护的所有组合物和方法。尽管已经以优选实施方案的方式描述了所述组合物和方法,本领域技术人员显而易见,可以将变化应用于所述组合物和方法以及步骤或本文所述方法的步骤的顺序,而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地,化学上和生理学上有关的某些药剂可以替换本文所述的药剂,同时达到相同或类似的结果。本领域技术人员显而易见的所有这样的类似的替换和修改,视作在所附权利要求书确定的本发明的精神、范围和概念内。
本申请是基于2008年7月21日提交的美国临时专利申请系列号61/082,399,并要求其优先权。该在先申请的公开内容(包括其附图、权利要求书及说明书)通过引用并入整体本文。另外,本文提及的所有文章、专利和专利申请的内容整体并入。
Claims (59)
1.改良嵌合的、人源化的或人抗-CD20抗体或其抗原结合片段的方法,所述方法包括:在嵌合的、人源化的或人抗-CD20抗体或其抗原结合片段的重链的第三个互补性决定区(CDR)序列中,产生至少一个氨基酸置换,以制备置换的抗体或其抗原结合片段,其中所述置换的抗体或其抗原结合片段具有至少一种选自下述的改良特性:更慢的离开速率、更慢的抗原解离速率、更高的CDC活性、更高的ADCC活性、更高的细胞凋亡活性、在没有交联存在下更大的在体外诱导细胞死亡的能力、和当给受试者施用CD20-阳性的细胞时更大的在体内杀死或抑制CD20-阳性细胞的生长的能力。
2.权利要求1的方法,其中所述CD20-阳性的细胞是B-细胞。
3.权利要求1的方法,其中所述置换是在抗体的重链CDR3 (CDRH3)的Kabat位置101。
4.权利要求3的方法,其中所述置换包括:用天冬氨酸残基替换在Kabat位置101处的天冬酰胺残基。
5.权利要求4的方法,其中所述置换的抗体包含在Kabat位置94处的精氨酸残基,且在Kabat位置101处的天冬氨酸残基与在Kabat位置94处的精氨酸残基形成离子键。
6.权利要求1的方法,其中所述置换的抗体或其片段抑制利妥昔单抗的结合CD20。
7.权利要求1的方法,其中所述置换的抗体是veltuzumab。
8.权利要求4的方法,其中天冬氨酸置换在Kabat位置101处的天冬酰胺导致抗-CD20抗体离开CD20的解离速率减慢至至多1/2。
9.权利要求1的方法,其中未置换的抗体的CDR序列与鼠抗-CD20抗体的CDR序列相同。
12.权利要求1的方法,其中所述人源化的抗-CD20抗体包含人源化的抗-CD22抗体依帕珠单抗的框架区序列、或人源化的抗-CD20抗体veltuzumab的框架区序列。
13.权利要求4的方法,其中天冬氨酸置换在Kabat位置101处的天冬酰胺残基导致暴露于所述抗体的Daudi细胞的补体-依赖性的细胞毒性增加。
14.权利要求4的方法,其中天冬氨酸置换在Kabat位置101处的天冬酰胺残基导致暴露于所述抗体的Daudi细胞的补体-依赖性的细胞毒性的EC50降低了30-40%。
15.治疗受试者的疾病的方法,所述方法包括:
a) 得到通过权利要求2的方法制备的置换的嵌合的、人源化的或人抗-CD20抗体或其抗原结合片段;
b) 将所述置换的抗-CD20抗体或其片段施用给受试者;和
c) 治疗受试者的疾病,其中所述疾病选自:B-细胞介导的免疫病、自身免疫病、B-细胞淋巴瘤和白血病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、免疫性溶血性贫血、同种致敏和冷球蛋白血症。
16.权利要求15的方法,其中所述疾病是免疫性血小板减少性紫癜、***性红斑狼疮、干燥综合征、伊文思综合征、关节炎、动脉炎、寻常天疱疮、肾移植排斥、心脏移植排斥、类风湿性关节炎、伯基特淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、弥散性B-细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤。
17.权利要求15的方法,其中所述置换的抗体或其片段是裸抗体或其片段。
18.权利要求15的方法,另外包括:在施用所述置换的抗体或其片段之前、同时或之后,给所述受试者施用至少一种治疗剂。
19.权利要求15的方法,其中所述抗体或其片段缀合在至少一种治疗剂上。
20.权利要求15的方法,其中所述置换的抗体或其片段被肠胃外地施用给所述受试者,其剂量为200 mg或更小、更优选100 mg或更小、更优选80 mg或更小、更优选50 mg或更小、最优选30 mg或更小,其中所述施用可以有效地治疗B-细胞介导的免疫病、自身免疫病、其它B-细胞相关的免疫性疾病、B-细胞淋巴瘤或白血病。
21.权利要求20的方法,其中以1-3周间隔,将所述置换的抗体或其片段施用给受试者2次或更多次。
22.权利要求20的方法,其中所述施用是静脉内的或皮下的。
23.权利要求20的方法,其中所述施用是皮下的,且其中当给所述受试者施用CD20-阳性的细胞时,皮下施用可以比静脉内施用更有效地在体内杀死或抑制CD20-阳性的细胞的生长。
24.权利要求20的方法,其中所述置换的抗体或其片段的施用可有效地清除受试者中的外周B-细胞水平。
25.权利要求24的方法,其中在80 mg/m2静脉内或80 mg皮下的单次剂量,所述施用可有效地清除受试者中的外周B-细胞。
26.权利要求24的方法,其中在小于80 mg/m2静脉内或小于80 mg 皮下的剂量,当施用至少1次时,优选地当给受试者施用2-4次时,所述施用可有效地清除受试者中的外周B-细胞。
27.权利要求26的方法,另外包括:根据需要重复施用,以预防或治疗受试者的复发。
28.权利要求17的方法,其中所述置换的抗体是veltuzumab,且给耐受利妥昔单抗的受试者施用veltuzumab可有效地治疗所述疾病。
29.权利要求18的方法,其中所述治疗剂选自:放射性核素、硼、免疫调节剂、细胞因子、激素、激素拮抗剂、酶、酶抑制剂、光敏治疗剂、细胞毒性药物、毒素、血管发生抑制剂、寡核苷酸、干扰RNA、第二抗体或其片段及它们的组合。
30.权利要求19的方法,其中所述治疗剂选自:放射性核素、硼、免疫调节剂、细胞因子、激素、激素拮抗剂、酶、酶抑制剂、光敏治疗剂、细胞毒性药物、毒素、血管发生抑制剂、寡核苷酸、干扰RNA、第二抗体或其片段及它们的组合。
31.权利要求19的方法,其中所述治疗剂选自:IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、TNF-α和命名为“S1因子”的干细胞生长因子。
32.通过权利要求1的方法生产的置换的嵌合的、人源化的或人抗-CD20抗体或其抗原结合片段。
33.权利要求32的置换的嵌合的、人源化的或人抗-CD20抗体或其片段,其中未置换的抗体的轻链和重链CDR序列来自利妥昔单抗,且所述置换包括:用CDR3的VH的天冬氨酸残基替换在Kabat位置101处的天冬酰胺残基。
34.权利要求33的置换的嵌合的、人源化的或人抗-CD20抗体或其片段,其中用天冬氨酸残基替换在Kabat位置101处的天冬酰胺残基导致所述抗体离开CD20的解离速率减慢至至多1/2。
35.权利要求33的置换的嵌合的、人源化的或人抗-CD20抗体,其中用天冬氨酸残基替换在Kabat位置101处的天冬酰胺残基导致暴露于所述置换的嵌合的、人源化的或人抗-CD20抗体的Daudi细胞的补体-依赖性的细胞毒性增加。
36.权利要求33的置换的嵌合的、人源化的或人抗-CD20抗体,其中用天冬氨酸残基替换在Kabat位置101处的天冬酰胺残基导致Daudi细胞的补体-依赖性的细胞毒性的EC50降低了30-40%。
37.权利要求33的置换的嵌合的、人源化的或人抗-CD20抗体或其片段,其中所述置换的抗体或其片段另外包含在Kabat位置94处的精氨酸残基,其与在CDR3的VH的Kabat位置101处的天冬氨酸残基形成离子键。
38.权利要求37的置换的嵌合的、人源化的或人抗-CD20抗体或其片段,其中所述抗体或其片段另外包含在CDR3的VH的Kabat位置102处的缬氨酸残基。
39.权利要求38的置换的嵌合的、人源化的或人抗-CD20抗体或其片段,其中所述未置换的抗体包含在Kabat位置102处的酪氨酸残基,且在置换的抗体的Kabat位置102处的缬氨酸残基替换酪氨酸残基。
41.权利要求40的置换的人源化的抗-CD20抗体或其片段,其中所述抗体是veltuzumab。
42.融合蛋白或双特异性抗体或其抗原结合片段,其包含权利要求32的置换的嵌合的、人源化的或人抗体或其片段。
43.权利要求42的融合蛋白或双特异性抗体,另外包含第二抗体或其抗原结合片段。
44.权利要求43的融合蛋白或双特异性抗体,其中所述第二抗体或其片段结合在可靶向的构建体上的肿瘤相关抗原或半抗原。
46.诊断或检测受试者的疾病的方法,所述方法包括:
a) 得到通过权利要求2的方法制备的置换的嵌合的、人源化的或人抗-CD20抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或片段用诊断剂标记;
b) 将所述置换的抗-CD20抗体或其片段施用给受试者;和
c) 治疗受试者的疾病,其中所述疾病选自:B-细胞介导的免疫病、自身免疫病、B-细胞淋巴瘤和白血病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、免疫性溶血性贫血、同种致敏和冷球蛋白血症。
47.权利要求46的方法,其中所述诊断剂选自:放射性核素、放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光敏剂。
48.权利要求18的方法,其中所述治疗剂包含第二抗体或其抗原结合片段。
51.试剂盒,其包含:
a) 根据权利要求32的置换的嵌合的、人源化的或人抗-CD20抗体或其抗原结合片段;
b) 注射器或自注射笔,其装有置换的嵌合的、人源化的或人抗-CD20抗体或其片段。
52.根据权利要求51的试剂盒,其中所述嵌合的、人源化的或人抗-CD20抗体或其片段的剂量是10至180 mg、更优选10至100 mg、更优选20至80 mg、更优选30至80、更优选30至60 mg、更优选40至50 mg。
53.根据权利要求51的试剂盒,其中所述嵌合的、人源化的或人抗-CD20抗体或其片段被冻干或在无菌溶液中,配制用于皮下或静脉内注射。
54.根据权利要求51的试剂盒,另外包括试剂盒的使用说明书。
57.权利要求55的方法,其中所述人源化的抗-CD20抗体包含人源化的抗-CD22抗体依帕珠单抗的框架区序列、或人源化的抗-CD20抗体veltuzumab的框架区序列。
58.根据权利要求56的置换的嵌合的、人源化的或人抗-CD20抗体或其抗原结合片段,其中所述人源化的抗-CD20抗体包含人源化的抗-CD22抗体依帕珠单抗的框架区序列、或人源化的抗-CD20抗体veltuzumab的框架区序列。
59.权利要求20的方法,其中每周给受试者施用所述置换的抗体或其片段至少2次。
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