CN106701827A - 表达cd19和cd20抗体基因嵌合抗原受体t细胞的转化及扩增培养与保存方法 - Google Patents
表达cd19和cd20抗体基因嵌合抗原受体t细胞的转化及扩增培养与保存方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种表达CD19和CD20抗体基因崁合抗原受体T细胞的转化及扩增培养与保存方法,该方法首先利用重组慢病毒将人T细胞转化;然后将转化后的人T细胞进行扩增培养;将所获得的表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的人T细胞进行冰冻保存。本发明通过构建靶向CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体慢病毒,并将其高效率的转染至T淋巴细胞,对转染后的淋巴T细胞进行了扩增培养并保存,使CD19和CD20作为恶性淋巴细胞白血病免疫治疗的一种有效的靶抗原,对于恶性B淋巴细胞白血病细胞免疫治疗具有重要临床意义。
Description
技术领域:
本发明属于细胞工程技术领域,涉及一种用嵌合抗原受体修饰后T细胞的扩增培养与保存方法,具体涉及一种表达CD19和CD20抗体基因崁合抗原受体T细胞的转化及扩增培养与保存方法。
背景技术:
淋巴T细胞是构成细胞免疫的主要成分,而利用基因工程使T细胞表达嵌合抗原受体能使T细胞转化成为具有特异性杀伤肿瘤细胞的效应细胞,是一种有前景的肿瘤免疫治疗策略。嵌合性抗原受体应用的关键是确定一种肿瘤相关抗原,这种抗原具有在肿瘤细胞表面过表达或高表达,而在正常组织无表达或低表达,CD19在早期B细胞的发育中扮演重要的角色,所有的急性白血病都表达CD19。CD20表达于90%以上的B淋巴瘤细胞和正常B淋巴细胞,而在造血干细胞、原始B淋巴细胞、正常血细胞以及其他组织上不表达。因此,CD19和CD20可作为恶性淋巴细胞白血病免疫治疗的一种有效的靶抗原。构建靶向CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体慢病毒,并将其高效率的转染至T淋巴细胞,对转染后的淋巴T细胞扩增培养并保存是对恶性B淋巴细胞白血病细胞免疫治疗的前提关键。因此,本发明提供一种用于人T细胞的慢病毒转化及扩增培养与保存的方法,对于恶性B淋巴细胞白血病细胞免疫治疗具有重要临床意义。
发明内容:
针对现有技术存在的问题,本发明的目的旨在提供一种表达CD19和CD20抗体基因崁合抗原受体T细胞的转化及扩增培养与保存方法。
为达到上述目的,本发明采取以下技术方案:
表达CD19和CD20抗体基因崁合抗原受体T细胞的转化及扩增培养与保存方法,包括如下步骤:
S1:将分离获得的CD4和CD8阳性T细胞悬浮于含人血清AB和细胞介素-2(IL-2)的培养基中,经T细胞激活试剂在37℃,5%CO2孵育箱中进行培养激活;
所述含有人血清AB和细胞介素-2的培养基为含2%的人血清AB和200单位/mL的细胞介素-2的T细胞培养基,其是一种无异源成分的无血清培养基,专门用于人T细胞的生长和扩增。
所述T细胞激活试剂采用TransAct CD3/28。
S2:经T细胞激活试剂激活后,将T细胞转移至离心管中,离心后取上清;
S3:将上述上清倾倒至另一离心管中备用,轻弹有细胞沉淀的离心管底部使细胞分散,将细胞重新悬浮于收集备用的上清中,移出少量细胞悬液计数;
S4:用备用的离心上清调整细胞浓度,然后接种于培养板中;
所述备用的离心上清调整细胞浓度为0.5X106/mL,按0.5X106/1mL/孔的量接种于六孔培养板中。
S5:将慢病毒从-80℃条件下取出,于室温中融化后,加入到上述含有T细胞的培养板中,混匀,置37℃,5%CO2孵育箱中进行孵育;
所述加入含有T细胞的培养板中的慢病毒用量根据病毒的感染滴度,按照感染复数(multiplicity ofinfection,MOI)5计算病毒用量。
S6:待孵育结束时,向培养板中加入含人血清AB和细胞介素-2的培养基,混匀,置37℃,5%CO2孵育箱中进行孵育(如果收集备用的离心上清没有用完,可与上述培养基混合然后加入孔中);
所述含有人血清AB和细胞介素-2的培养基为含2%的人血清AB和200单位/mL的细胞介素-2的T细胞培养基,其是一种无异源成分的无血清培养基,专门用于人T细胞的生长和扩增。
S7:孵育后进行T细胞的收集,并取少量细胞计数计算总细胞数和细胞存活率,同时用流式细胞仪检测CD19和CD20的表达水平;
S8:将收集的T细胞转移至加有含人血清AB和细胞介素-2的培养基的G-Rex100培养装置中,置37℃,5%CO2孵育箱中进行扩增培养,中间无需换液或其他处理,尽量减少对细胞的干扰(根据培养板的细胞采用G-Rex100培养装置的数量,如一个六孔板的细胞用一个G-Rex100);
所述含有人血清AB和细胞介素-2的培养基为含2%的人血清AB和200单位/mL的细胞介素-2的T细胞培养基,其是一种无异源成分的无血清培养基,专门用于人T细胞的生长和扩增。
S9:待细胞培养结束后,收获扩增细胞,并取少量细胞计数计算总细胞数和细胞存活率,同时用流式细胞仪检测CD19和CD20的表达水平,另取部分细胞进行支原体检测和内毒素检测;
S10:将剩余细胞进行离心,并弃上清,再用复方电解质注射液洗涤细胞一次,再次进行离心后,即得细胞沉淀悬浮细胞;
S11:按照不同的治疗剂量将细胞沉淀悬浮细胞置于细胞冻存液中,并转移到细胞冻存袋中,此时移出1mL细胞进行无菌检测;
所述细胞冻存液包括24%的复方电解质注射液,10%的DMSO,8%的人血清白蛋白。
S12:在将细胞沉淀悬浮细胞于细胞冻存液之前,启动细胞冻存程序;
所述细胞冻存程序,具体包括如下步骤:
a.启动细胞冻存程序,使细胞冻存室温度降至4℃;
b.将含有细胞的冻存袋移至冻存室,继续运行冻存程序;
c.细胞中温度降低1℃/min至-11.5℃;
d.冻存室中温度降低20℃/min至-55℃;
e.冻存室中温度降低15℃/min至-25℃;
f.冻存室中温度降低1℃/min至-45℃;
g.冻存室中温度降低10℃/min至-100℃。
S13:待细胞温度降到-90℃,细胞冻存完成;
S14:将冻存好的细胞移至液氮中进行长期保存。
本发明表达CD19和CD20抗体基因崁合抗原受体T细胞的转化及扩增培养与保存方法,通过构建靶向CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体慢病毒,并将其高效率的转染至T淋巴细胞,对转染后的淋巴T细胞进行了扩增培养并保存,使CD19和CD20作为恶性淋巴细胞白血病免疫治疗的一种有效的靶抗原,对于恶性B淋巴细胞白血病细胞免疫治疗具有重要临床意义。
附图说明:
图1是本发明实施例中表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体T细胞的扩增结果示意图;
图2是实施例中表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体T细胞培养于G-Rex100培养装置中的图片;
图3是实施例中冰冻保存的表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体T细胞。
具体实施方式:
下面对本发明的技术方案作进一步的说明,但并不局限于此,凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1
一种表达CD19和CD20抗体基因崁合抗原受体T细胞的转化及扩增培养与保存方法,包括如下步骤:
S1:将分离获得的CD4和CD8阳性T细胞悬浮于含2%的人血清AB和200单位/mL的细胞介素-2的T细胞培养基中,经T细胞激活试剂在37℃,5%CO2孵育箱中进行培养激活;
S2:经T细胞激活试剂激活作用一天后,将T细胞转移至离心管中,300r离心10min后取上清;
S3:将上清倾倒至另一离心管中备用,轻弹有细胞沉淀的离心管底部使细胞分散,将细胞重新悬浮于收集备用的上清中,移出少量细胞悬液计数;
S4:用备用的离心上清调整细胞浓度为0.5X106/mL,然后按0.5X106/1mL/孔的量接种于六孔培养板中;
S5:将慢病毒从-80℃条件下取出,于室温中融化后,加入到上述含有T细胞的六孔培养板中,混匀,置37℃,5%CO2孵育箱中进行孵育6h;
S6:待孵育结束时,向六孔培养板中每孔加入1mL含2%的人血清AB和200单位/mL的细胞介素-2的T细胞培养基,混匀,置37℃,5%CO2孵育箱中进行孵育4天(如果收集备用的离心上清没有用完,可与上述培养基混合然后加入孔中);
S7:孵育4天后进行T细胞的收集,并取少量细胞计数计算总细胞数和细胞存活率,同时用流式细胞仪检测CD19和CD20的表达水平;
S8:将收集的T细胞转移至加有含2%的人血清AB和200单位/mL的细胞介素-2的T细胞培养基的G-Rex100培养装置中,如图2所示,至培养基体积到450mL,置37℃,5%CO2孵育箱中进行扩增培养8天,中间无需换液或其他处理,尽量减少对细胞的干扰;
S9:待细胞培养至7天结束后,收获扩增细胞,并取少量细胞计数计算总细胞数和细胞存活率,同时用流式细胞仪检测CD19和CD20的表达水平,另取部分细胞进行支原体检测和内毒素检测;
S10:将剩余细胞进行300g离心10min,并弃上清,再用复方电解质注射液洗涤细胞一次,再次进行300g离心10min后,即得细胞沉淀悬浮细胞;
S11:如图3所示,按照不同的治疗剂量将细胞沉淀悬浮细胞置于细胞冻存液中,并转移到细胞冻存袋中,此时移出1mL细胞进行无菌检测;
S12:在将细胞沉淀悬浮细胞于细胞冻存液之前,启动细胞冻存程序;
所述细胞冻存程序,具体包括如下步骤:
a.启动细胞冻存程序,使细胞冻存室温度降至4℃;
b.将含有细胞的冻存袋移至冻存室,继续运行冻存程序;
c.细胞中温度降低1℃/min至-11.5℃;
d.冻存室中温度降低20℃/min至-55℃;
e.冻存室中温度降低15℃/min至-25℃;
f.冻存室中温度降低1℃/min至-45℃;
g.冻存室中温度降低10℃/min至-100℃。
S13:待细胞温度降到-90℃,细胞冻存完成;
S14:将冻存好的细胞移至液氮中进行长期保存。
如图1所示,为表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体T细胞的扩增结果可知:T细胞培养第5天至第13天之间细胞扩增的数量增至1750*106到2200*106,然后可计算总细胞数和细胞存活率。
Claims (7)
1.表达CD19和CD20抗体基因崁合抗原受体T细胞的转化及扩增培养与保存方法,其特征在于:包括如下步骤:
S1:将分离获得的CD4和CD8阳性T细胞悬浮于含人血清AB和细胞介素-2的培养基中,经T细胞激活试剂在37℃,5%CO2孵育箱中进行培养激活;
S2:经T细胞激活试剂激活后,将T细胞转移至离心管中,离心后取上清;
S3:将上述上清倾倒至另一离心管中备用,轻弹有细胞沉淀的离心管底部使细胞分散,将细胞重新悬浮于收集备用的上清中,移出少量细胞悬液计数;
S4:用备用的离心上清调整细胞浓度,然后接种于培养板中;
S5:将慢病毒从-80℃条件下取出,于室温中融化后,加入到上述含有T细胞的培养板中,混匀,置37℃,5%CO2孵育箱中进行孵育;
S6:待孵育结束时,向培养板中加入含人血清AB和细胞介素-2的培养基,混匀,置37℃,5%CO2孵育箱中进行孵育;
S7:孵育后进行T细胞的收集,并取少量细胞计数计算总细胞数和细胞存活率,同时用流式细胞仪检测CD19和CD20的表达水平;
S8:将收集的T细胞转移至加有含人血清AB和细胞介素-2的培养基的G-Rex100培养装置中,置37℃,5%CO2孵育箱中进行扩增培养;
S9:待细胞培养结束后,收获扩增细胞,并取少量细胞计数计算总细胞数和细胞存活率,同时用流式细胞仪检测CD19和CD20的表达水平,另取部分细胞进行支原体检测和内毒素检测;
S10:将剩余细胞进行离心,并弃上清,再用复方电解质注射液洗涤细胞一次,再次进行离心后,即得细胞沉淀悬浮细胞;
S11:按照不同的治疗剂量将细胞沉淀悬浮细胞置于细胞冻存液中,并转移到细胞冻存袋中,此时移出1mL细胞进行无菌检测;
S12:在将细胞沉淀悬浮细胞于细胞冻存液之前,启动细胞冻存程序;
S13:待细胞温度降到-90℃,细胞冻存完成;
S14:将冻存好的细胞移至液氮中进行长期保存。
2.根据权利要求1所述的表达CD19和CD20抗体基因崁合抗原受体T细胞的转化及扩增培养与保存方法,其特征在于:所述含有人血清AB和细胞介素-2的培养基为含2%的人血清AB和200单位/mL的细胞介素-2的T细胞培养基,其是一种无异源成分的无血清培养基,专门用于人T细胞的生长和扩增。
3.根据权利要求1所述的表达CD19和CD20抗体基因崁合抗原受体T细胞的转化及扩增培养与保存方法,其特征在于:步骤S1中所述T细胞激活试剂采用TransAct CD3/28。
4.根据权利要求1所述的表达CD19和CD20抗体基因崁合抗原受体T细胞的转化及扩增培养与保存方法,其特征在于:步骤S4中所述备用的离心上清调整细胞浓度为0.5X106/mL,按0.5X106/1mL/孔的量接种于六孔培养板中。
5.根据权利要求1所述的表达CD19和CD20抗体基因崁合抗原受体T细胞的转化及扩增培养与保存方法,其特征在于:步骤S5中加入含有T细胞的培养板中的慢病毒用量根据病毒的感染滴度,按照感染复数计算病毒用量。
6.根据权利要求1所述的表达CD19和CD20抗体基因崁合抗原受体T细胞的转化及扩增培养与保存方法,其特征在于:步骤S11中所述细胞冻存液包括24%的复方电解质注射液,10%的DMSO,8%的人血清白蛋白。
7.根据权利要求1所述的表达CD19和CD20抗体基因崁合抗原受体T细胞的转化及扩增培养与保存方法,其特征在于:步骤S12中所述细胞冻存程序,具体包括如下步骤:
a.启动细胞冻存程序,使细胞冻存室温度降至4℃;
b.将含有细胞的冻存袋移至冻存室,继续运行冻存程序;
c.细胞中温度降低1℃/min至-11.5℃;
d.冻存室中温度降低20℃/min至-55℃;
e.冻存室中温度降低15℃/min至-25℃;
f.冻存室中温度降低1℃/min至-45℃;
g.冻存室中温度降低10℃/min至-100℃。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170524 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |