CN107384951A - 一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体、制备方法、***及其应用 - Google Patents
一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体、制备方法、***及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107384951A CN107384951A CN201710576441.XA CN201710576441A CN107384951A CN 107384951 A CN107384951 A CN 107384951A CN 201710576441 A CN201710576441 A CN 201710576441A CN 107384951 A CN107384951 A CN 107384951A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- sequences
- gene
- cas9
- sgrna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体,其具有较高的基因编辑效率。该基因编辑载体包括Cas9表达元件、sgRNA表达元件、复制子元件和同源修复序列***位点;cas9表达元件包括抗性基因、操纵子、启动子、SD序列、cas9序列和终止子,cas9序列如SEQ ID No.5所示,SD序列如SEQ ID No.6所示;sgRNA表达元件的包含启动子、sgRNA scaffold序列和终止子,sgRNA scaffold序列包括trancrRNA和crRNA***位点,sgRNA scaffold序列如SEQ ID No.7所示;复制子元件包含谷氨酸棒状杆菌复制子repA。
Description
技术领域
本发明涉及基因编辑领域,具体涉及一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体、制备方法、***及其应用。
背景技术
对于工业微生物来说,从野生型出发菌株到高效的生产菌株需要经历代谢分析及优化,利用基因编辑技术对宿主进行遗传修饰及合理改造。基因编辑技术是指利用外源DNA通过重组方式对受体细胞基因组目标基因进行突变,从而产生目的突变株。基因编辑需要实现基因敲除,基因***及基因替换等基因组操作。
CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/Cas9***是细菌和古细菌应对外源DNA入侵的获得性免疫***,通过RNA介导,Cas9蛋白能够特异性的切割外源遗传物质,用以对抗入侵的病毒和质粒。随着近两年的发展,该技术已经发展成为一套精确的基因编辑***,通过CRISPR/Cas9 介导的打靶***可以试验快速高效的基因敲除、基因敲入、基因沉默。目前该技术已成功应用到动物细胞、大肠杆菌、拟南芥、酿酒酵母等物种中。
CRISPR/Cas9***发挥基因编辑的作用是建立在由trancrRNA与crRNA形成一个tracrRNA-crRNA 复合体,同时该复合体再与Cas9 蛋白结合,tracrRNA-crRNA-cas9复合体能够在crRNA 的引导下识别靶位点序列并结合到目的基因上;复合体对目的片段的切割是由crRNA 上长度为20 bp的向导序列(Guiding sequence)与目的DNA上的特定序列互补来引导Cas9 蛋白对目的基因的切割;除此之外,在所识别的目的DNA 上还必须有一个3′碱基(NGG)组成的PAM (protospacer adjacent motif)区域,识别区域紧跟PAM 的5′端。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium. glutamicum)是一种***,其DNA含有大约56%的GC。该菌在过去的50多年里被广泛用于氨基酸的生产,还被用于新型能源、食品工业、动物饲料和医药产品的生产C. glutamicum被普遍认为是安全无致病性,不产生内毒素的,因而是一种安全的医药蛋白表达宿主。
用于工业生产的谷氨酸棒状杆菌菌株主要通过传统诱变获得。随着代谢工程及基因工程技术的发展,通过基因工程手段定向改造谷氨酸棒状杆菌生产目的产物越来越受到重视,这就需要有很好的基因编辑工具来实现定向的基因改造。
目前,只有pKl8mobsacB/pKl9mobsacB等少数几个用于谷氨酸棒状杆菌基因编辑的载体,但上述载体因为要通过两次同源重组才能实现基因编辑而费时且效率低下。
发明内容
针对上述问题,本发明提供了一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体,其具有较高的基因编辑效率。
一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体,其特征在于:
所述基因编辑载体包括Cas9表达元件、sgRNA表达元件、复制子元件和同源修复序列***位点;
所述cas9表达元件包括抗性基因、操纵子、启动子、SD序列、cas9序列和终止子;所述cas9序列如SEQ ID No.5所示,所述SD序列如SEQ ID No.6所示、并连接在cas9序列的始密码子ATG前;
所述sgRNA表达元件的包含启动子、sgRNA scaffold序列和终止子,所述sgRNAscaffold序列包括trancrRNA和crRNA***位点,所述crRNA***位点为AjuI酶切位点,所述sgRNA scaffold序列如SEQ ID No.7所示;
所述复制子元件包含谷氨酸棒状杆菌复制子repA;
所述同源修复序列***位点连接于所述sgRNA表达元件的终止子后。
进一步的,所述cas9表达元件的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,其抗性基因为cat氯霉素抗性基因,操纵子为lacIq,启动子为Ptac,终止子为rrnB;
所述sgRNA表达元件的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,其启动子为Ptrc,终止子为T1T2;
所述复制子元件的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述复制子原件还包括大肠杆菌复制子oriE;
所述同源修复序列***位点包括AflII酶切位点、BstBI酶切位点、SnaBI酶切位点和SwaI酶切位点。
进一步的,所述基因编辑载体的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
本发明还提供了上述基因编辑载体的制备方法,其特征在于:其包括以下步骤:
a、合成由SD序列和cas9序列连接形成的复合体序列,并在复合体序列的两端引入HindⅢ酶切识别序列、EcoRⅠ酶切识别序列;将带有酶切识别序列的复合体序列以及pXMJ19载体分别酶切、纯化后进行连接,得到所述cas9表达载体;以所述cas9表达载体为模板,PCR扩增包括cat氯霉素抗性基因,乳糖操纵子lacIq,启动子Ptac,SD序列,cas9序列及终止子rrnB的cas9表达元件;
b、合成sgRNA scaffold序列,并在sgRNA scaffold序列两端引入BamHⅠ酶切识别序列、NotⅠ酶切识别序列;将带有酶切识别序列的sgRNA scaffold序列以及pECXK-99载体分别酶切、纯化后进行连接,得到sgRNA表达载体;以所述sgRNA表达载体为模板,PCR扩增包含启动子Ptrc,sgRNA scaffold序列及终止子T1T2的sgRNA表达元件,并在T1T2终止子后引入AflII,BstBI,SnaBI及SwaI四个酶切位点;
c、以复制子序列为模板,扩增得到复制子元件;
d、利用同源重组技术,同源重组连接cas9表达元件,sgRNA表达元件及复制子元件,构建形成所述基因编辑载体。
本发明还提供了一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑***,其特征在于:其包括如权利要求1~3所述的基因编辑载体。
本发明还提供了上述基因编辑载体的应用,其特征在于:所述应用包括以下步骤,
a、将crRNA序列、同源修复序列分别***到基因编辑载体的crRNA***位点、同源修复序列***位点;
b、将构建好的带有crRNA序列及同源修复序列的基因编辑载体转化谷氨酸棒状杆菌;
c、培养、筛选,获得转化子;
其中,待编辑的目的基因具有5′-(N20)-NGG-3′结构,N为A、T、C或G,所述crRNA序列与目的基因5′-(N20)-NGG-3′结构中的N20序列相同,所述同源修复序列由目的基因上游序列、目的基因编辑后形成的序列、目的基因下游序列依次连接形成,所述目的基因上游序列、目的基因下游序列长度为300bp~1000bp。
进一步的,所述应用包括基因敲除和基因替换。
本发明构建的基因编辑***即利用CRISPR/Cas9技术,利用人工设计的sgRNA结合cas9蛋白对基因组靶点位置切割,形成双链断裂缺口;同时提供同源修复序列,以达到基因敲除,基因***和基因替换的目的;其中,SD序列的涉及使得cas9蛋白能够在谷氨酸棒杆菌中顺利表达。
实验证明,利用本发明构建的基因编辑***对谷氨酸棒状杆菌基因组进行编辑,具有周期短,节省成本效率高等优点;并且使用该***对谷氨酸棒状杆菌基因编辑效率能达到100%。
附图说明
图1为本发明的基因编辑载体的质粒图谱。
图2为同源修复序列设计方法示意图。
图3为porB基因敲除后的基因型验证结果,其中,泳道M:marker DL10,000;泳道ck:阴性对照野生型菌株基因型;泳道1-12:敲除菌株基因型验证结果。
图4为porB基因替换为GFP基因后的基因型验证结果,其中,泳道M:marker DL10,000;泳道ck:阴性对照野生型菌株基因型;泳道1-12:敲除菌株基因型验证结果。
图5为porB基因定点突变后的基因型验证结果,其中,泳道M:marker DL10,000;泳道ck:阴性对照野生型菌株基因型;泳道1-6:定点突变菌株基因型验证结果。
具体实施方式
下述实施例或应用例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例或应用例中所用的材料、试剂,基因合成等,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
下述实施例或应用例中所用大肠杆菌DH5α购买自TAKARA。
下述实施例或应用例中所用谷氨酸棒状杆菌C. glutamicumATCC13032购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。
下述实施例或应用例中所用载体骨架pXMJ19和pECXK-99均购自Addgene。
下述实施例或应用例中所用连接液solutionI购买自TaKaRa公司,货号 D6020A。
下述实施例或应用例中所用Gibson Assembly Master Mix溶液购买自NEB( NewEngland Biolabs)公司,货号E2611S。
下述实施例或应用例中大肠杆菌的培养使用LB培养基,培养基配方为:胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g,去离子水1L。
下述实施例或应用例中谷氨酸棒状杆菌的培养使用LBB培养基,培养基配方为:胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g,脑心浸液10g、去离子水1L。
下述实施例或应用例中谷氨酸棒状杆菌的转化子培养使用LBHIS培养基,培养基配方为:胰蛋白胨 5g、酵母提取物 2.5g、NaCl 5g、脑心浸液 18。5g、山梨醇 91g、去离子水1L。
实施例1:一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑***
1、一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体,核苷酸序列如SEQ ID No.4所示,其质粒图谱如图1所示,
基因编辑载体包括Cas9表达元件、sgRNA表达元件、复制子元件和同源修复序列***位点;
cas9表达元件包括cat氯霉素抗性基因、乳糖操纵子lacIq、启动子Ptac、SD序列、cas9序列和终止子rrnB,SD序列连接在cas9序列的始密码子ATG前;
sgRNA表达元件的包含启动子Ptrc、sgRNA scaffold序列和终止子T1T2,sgRNAscaffold序列包括trancrRNA和crRNA***位点,crRNA***位点为AjuI酶切位点;
复制子元件包含谷氨酸棒状杆菌复制子repA和大肠杆菌复制子oriE;
同源修复序列***位点包括AflII酶切位点、BstBI酶切位点、SnaBI酶切位点和SwaI酶切位点,连接于sgRNA表达元件的终止子后。
其中,cas9表达元件、sgRNA表达元件、复制子元件、基因编辑载体、cas9序列、SD序列、sgRNA scaffold 序列分别如SEQ ID No.1~ SEQ ID No.7所示。
2、一种谷氨酸基因编辑***,其包括上述基因编辑载体、谷氨酸棒杆菌、crRNA和同源修复序列。
3、上述基因编辑载体的构建
Cas9表达元件,其制备过程如下:
a、合成由SD序列和cas9序列连接形成的复合体序列,并在复合体序列的两端引入HindIII和EcoRI酶切识别序列;
b、将带有酶切识别序列的复合体序列以及pXMJ19载体分别酶切、纯化后进行连接,得到cas9表达载体;
c、以cas9表达载体为模板PCR扩增包含有lacIq乳糖操纵子,Ptac启动子,SD序列,cas9基因,rrnB终止子及氯霉素抗性基因cat的序列,即为cas9表达元件。
酶切、纯化连接体系如下:20μL反应体系中含有限制性内切酶HindIII和EcoRI各1μL,含有待酶切的复合体及pXMJ19载体0.8ng,37℃反应30min;0.7%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收,胶回收试剂盒纯化,即得到酶切纯化后的复合体序列以及pXMJ19载体片段;纯化后的复合体序列和pXMJ19载体片段摩尔比3:1,连接液Solution I 5μL,无菌水补齐到10μL ,16℃反应1h,热击转化E.coliDH5α感受态细胞;均匀涂布于含有30μg/mL氯霉素的LB固体培养基上,37℃倒置培养16h;挑选阳性克隆子,提取质粒即为cas9表达载体。
PCR扩增体系如下:100μL反应体系中含有模板(cas9表达载体质粒)2μL,Taq酶2μL,dNTP 8μL, Tap buffer 10μL,ddH2O 74μL,正向引物AATGCTTAATCAGTGAGGCGGAAGGGCACCAATAACTG 2μL,反向引物ATCAATTCGCTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAAAG 2μL;反应条件为98℃ 30s;98℃ 10s, 60℃10s,72℃ 3min 共35个循环;72℃ 5min;4℃保存;PCR产物0.7%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收,胶回收试剂盒纯化,即得到纯化后的cas9表达元件。
sgRNA表达元件,其制备过程如下:
a、合成sgRNA scaffold序列,并在sgRNA scaffold序列两端引入BamHⅠ和NotⅠ酶切识别序列,sgRNA scaffold 序列如SEQ ID No.7所示;
b、将带有酶切识别序列的sgRNA序列以及pECXK-99载体分别酶切、纯化后进行连接,得到sgRNA表达载体;Pcr扩增Ptrc启动子,sgRNA scaffold及T1T2终止子序列,即为sgRNA表达元件;
酶切纯化连接体系如下:20μL反应体系中含有限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ各1μL,含有待酶切的sgRNA片段及pECXK-99载体0.8ng,37℃反应30min;0.7%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收,胶回收试剂盒纯化,即得到酶切纯化后的sgRNA片段及pECXK-99载体片段;纯化后的sgRNA片段和pECXK-99载体片段摩尔比3:1,连接液Solution I 5μL,无菌水补齐到10μL ,16℃反应1h,热击转化E.coliDH5α感受态细胞;均匀涂布于含有30μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上,37℃倒置培养16h;挑选阳性克隆子,提取质粒即为sgRNA表达载体。
PCR扩增体系如下:100μL反应体系中含有模板(sgRNA表达载体质粒)2μL,Taq酶2μL,dNTP 8μL, Tap buffer 10μL,ddH2O 74μL,正向引物AATACATTCAGCGAATTGATCTGGTTTG 2μL,反向引物CAAAGCATCAGACGTAGACCCTTAAGTACGTATTCGAAATTTAAATAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAG 2μL;反应条件为98℃ 30s;98℃ 10s,60℃ 10s, 72℃ 30s共35个循环;72℃ 5min;4℃保存;PCR产物0.7%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收,胶回收试剂盒纯化,即得到纯化后的sgRNA表达元件。
复制子元件,其制备过程如下:
合成复制子序列,复制子序列如SEQ ID No.3所示。以复制子序列质粒为模板,正向引物ATTTAAATTTCGAATACGTACTTAAGGGTCTACGTCTGATGCTTTG, 反向引物PCRCGCCTCACTGATTAAGCATTG,PCR扩增得到包含有大肠杆菌复制子oriE及谷氨酸棒状杆菌复制子repA的复制子元件。
扩增体系如下:100μL反应体系中含有模板2μL,Taq酶2μL,dNTP 8μL, Tap buffer10μL,ddH2O 74μL,正向引物2μL,反向引物2μL。反应条件为98℃ 30s;98℃ 10s, 60℃10s, 72℃ 1min 共35个循环;72℃ 5min;4℃保存。PCR产物0.7%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收,胶回收试剂盒纯化,即得到纯化后的复制子元件。
同源重组构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,制备过程如下:
利用同源重组技术,连接cas9表达元件,sgRNA表达元件及复制子元件,并在sgRNA表达元件和复制子元件中引入AflII,BstBI,SnaBI及SwaI四个酶切。
纯化后的cas9表达元件,sgRNA表达元件及复制子元件片段摩尔比1:1:1, GibsonAssembly Master Mix溶液 10μL,无菌水补齐到20μL ,50℃反应1h;热击转化E.coliDH5α感受态细胞;均匀涂布于含有30μg/mL氯霉素的LB固体培养基上,37℃倒置培养16h;挑选阳性克隆子,提取质粒即为CRISPR/Cas9基因编辑载体。
基因编辑操作中需要***crRNA序列及同源修复序列。
其中,目的基因的原序列中具有5′-(N20)-NGG-3′结构;crRNA序列同靶点N20序列,设计两条引物:正向引物5’端需加上 GATCC序列,反向引物5’端需加上CAAAA序列;两条引物利用寡核苷酸退火成双链结构,连接到AjuI酶切过的CRISPR/Cas9基因编辑载体中。
CRISPR/Cas9基因编辑载体中间设计的有AflII,BstBI,SnaBI及SwaI四个酶切为***同源修复序列的位点。
根据目的不同设计不同的同源修复序列,设计方法依据图2所示,
若实现目的基因的敲除,构建由目的基因上游序列和目的基因下游序列融合连接形成的同源修复序列,目的基因上、下游序列长度为300bp~1500bp,并在同源修复序列两端引入酶切位点两端识别序列,利用同源重组技术将同源修复序列及酶切纯化后的CRISPR/Cas9载体连接,得到最终CRISPR/Cas9基因编辑载体,转化E.coliDH5α。
构建体系如下(以SnaBI位点***同源修复序列为例):根据目的基因基因组序列设计引物,分别扩增目的基因上游序列和目的基因下游序列,扩增片段长度为300bp~1500bp,并在两端引物上引入SnaBI酶切识别序列;20μL反应体系中含有限制性内切酶SnaBI1μL,含有待酶切的CRISPR/Cas9基因编辑载体0.8ng,37℃反应30min;0.7%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收,胶回收试剂盒纯化,即得到酶切纯化后CRISPR/Cas9基因编辑载体载体片段;纯化后的目的基因上游序列、目的基因下游序列和CRISPR/Cas9基因编辑载体片段摩尔比3:3:1, Gibson Assembly Master Mix溶液 10μL,无菌水补齐到20μL ,50℃反应1h;热击转化E.coliDH5α感受态细胞;均匀涂布于含有30μg/mL氯霉素的LB固体培养基上,37℃倒置培养16h;挑选阳性克隆子,提取质粒即为最终CRISPR/Cas9基因编辑载体。
若实现目的基因的替换,构建目的基因上游、目的基因编辑后形成的序列和目的基因下游序列连接形成的同源修复序列,目的基因上、下游序列长度为300bp~1500bp,并在同源修复序列两端引入载体SnaBI酶切位点两端的同源序列,其中,目的基因的原序列中具有5′-(N20)-NGG-3′结构;将同源修复序列以及CRISPR/Cas9基因编辑载体利用GibsonAssembly Master Mix溶液进行组装,得到最终CRISPR/Cas9基因编辑载体,转化E.coliDH5α。
构建体系如下:根据目的基因基因组序列设计引物,分别扩增目的基因上游片段、目的基因编辑后形成的序列、目的基因下游片段,目的基因上、下游片段长度为300bp~1500bp,每两个片段中间设计同源位点,可以通过Gibson Assembly Master Mix溶液进行组装,其中组装后片段两端要包含CRISPR/Cas9载体SnaBI酶切位点两端的同源序列,以便于将片段组装到载体CRISPR/Cas9上;20μL反应体系中含有限制性内切酶SnaBI1μL,含有待酶切的CRISPR/Cas9载体0.8ng,37℃反应30min;0.7%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收,胶回收试剂盒纯化,即得到酶切纯化后CRISPR/Cas9载体片段;纯化后的CRISPR/Cas9载体片段、目的基因上游片段、目的基因编辑后形成序列、目的基因下游片段摩尔比1:3:3:3, GibsonAssembly Master Mix溶液 10μL,无菌水补齐到20μL ,50℃反应1h;热击转化E.coliDH5α感受态细胞;均匀涂布于含有30μg/mL氯霉素的LB固体培养基上,37℃倒置培养16h;挑选阳性克隆子,提取质粒即为最终CRISPR/Cas9载体。
2、基因编辑
a、将crRNA序列、同源修复序列分别***到基因编辑载体的crRNA***位点、同源修复序列***位点;
b、将构建好的带有crRNA序列及同源修复序列的基因编辑载体转化谷氨酸棒状杆菌;
c、培养、筛选,获得转化子。
基因编辑具体包括基因敲除和基因替换,如图2所示,其中B为待编辑的目的基因,A、C为待编辑的目的基因两端的同源片段,D为替换后的基因。
应用例1:porb基因的敲除
一种谷氨酸棒状杆菌的porB基因敲除***,包括敲除载体的构建及其应用。
根据谷氨酸棒状杆菌基因组序列(NCBI Reference Sequence: NC_003450.3),针对porb基因寻找5′-(N20)-NGG-3′结构,porB基因正义链的靶点序列、以及针对靶点序列设计的sgRNA N20序列分别如下所示:
靶点序列为:
GGAGGATAGGTTTGCGAAGTCGG;
sgRNA N20序列为:
GGAGGATAGGTTTGCGAAGT;
设计引物正向引物F:5’ GGAGGATAGGTTTGCGAAGTGTTTT3’;
反向引物R:5’ACTTCGCAAACCTATCCTCCGGATC 3’。
寡核苷酸退后成双链后,用连接酶连接到AjuI酶切纯化后的CRISPR/Cas9敲除载体中。
sgRNA序列为:
GGAGGATAGGTTTGCGAAGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT;
b、制备带有酶切识别序列的同源修复序列
根据porB基因序列设计带有酶切识别序列的同源修复序列porB LR,同源修复序列porB LR由porB基因的上游同源片段porB-L、下游同源片段porB-R依次连接组成,其中porB-L、porB-R分别引入SnaBI酶切识别序列。
上游同源片段porB-L的引物为:
porbB L-F: 5’TCTATTTAAATTTCGAATACGGAGTGGACAAGTCACGAT 3’;
porB L-R: 5’TTGGAGGACATGCCACTGTGATGCCTGCGGTTGCT 3’。
下游同源片段porB-R的引物为:
porB R-F: 5’ CACAGTGGCATGTCCTCCAACTTCTCTTCCTAAAA 3’ ;
porB R-R: 5’AGACGTAGACCCTTAAGTACGGGTGAACCTGTTTCTATC 3’。
分别扩增porB-L和porB-R,然后采用同源重组的方法,连接porB-L,porB-R以及SnaBI酶切纯化后的CRISPR/Cas9敲除载体,构建成porB基因敲除载体。
融合形成porB LR,porB LR长度为2068bp,融合后序列如SEQ ID No.8所示。
3、porB基因的敲除具体操作流程:
a、将porB基因敲除载体质粒从E.coli中提出,取1μg DNA转化谷氨酸棒状杆菌感受态,电击转化条件为1800v,50ms,恢复培养后涂布于含有氯霉素的LBHIS固体培养基,30℃培养36h。
b、挑取平板上的单菌落,利用cas9基因引物;
cas9-F:5’ACAACTAATGGATAAAAAGTATTC 3’;
cas9-R:5’ TATGAATTCTTAGTCGCCACCCA 3’。
验证cas9表达载体是否正确转入;
c、挑选正确的转化子,接种于LBB液体培养基中30℃培养12h,将培养物划线与含有氯霉素以及IPTG的固体培养基中,30℃培养24h。
d、挑取平板上的单菌落用同源片段引物porB L-F 和porB R-R PCR验证获得目的菌株,同时把扩增出来的片段进行测序验证,最终根据基因型及测序结果挑选正确的菌株及porB基因敲除菌株,基因型验证结果如图3所示。
实验证明,利用本发明构建的CRISPR/Cas9基因编辑***对谷氨酸棒状杆菌基因组进行编辑,具有周期短,节省成本效率高等优点,使用该***对谷氨酸棒状杆菌基因编辑效率能达到83.4%。
质粒的除去,把挑选出的敲除菌株在不加抗生素的培养基中30℃培养过夜,37℃继续培养8小时后,划线不含抗生素的LBB固体培养基上,载体即可除去;利用cas9引物和抗生素验证载体的消除。
应用例2 :GFP基因替换porB基因
载体的构建
一种谷氨酸棒状杆菌的在porB基因替换***,包括porB基因替换为GFP基因的CRISPR/Cas9载体的构建及其应用。
根据谷氨酸棒状杆菌基因组序列(NCBI Reference Sequence: NC_003450.3),针对porb基因寻找5′-(N20)-NGG-3′结构,porb基因正义链的靶点序列、以及针对靶点序列设计sgRNA N20序列分别如下所示:
靶点序列为:
GGAGGATAGGTTTGCGAAGTCGG
sgRNA N20序列为:
GGAGGATAGGTTTGCGAAGT;
设计引物正向引物F:5’ GGAGGATAGGTTTGCGAAGTGTTTT3’;
反向引物R:5’ACTTCGCAAACCTATCCTCCGGATC 3’。
寡核苷酸退后成双链后,用连接酶连接到AjuI酶切纯化后的CRISPR/Cas9敲除载体中。
sgRNA序列为:
GGAGGATAGGTTTGCGAAGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT;
b、制备带有酶切识别序列的同源修复序列
根据porB基因序列设计带有酶切识别序列的同源修复序列porB LGR,同源修复序列porB LGR由porB基因的上游同源片段porB-L、GFP基因,下游同源片段porB-R依次连接组成,其中porB-L、porB-R分别引入SnaBI识别序列。
上游同源片段porB-L的引物为:
porBILF:5’TCTATTTAAATTTCGAATACCAAGTCACGATCGTTGGAAC 3’;
porBILR:5’ GGCATGATAGGATTTTTAGGGCTCCTTTTAAGG 3’。
GFP基因的引物为:
GFPF:5’ CCTAAAAATCCTATCATGCCATACCGCG 3’;
GFPR:5’CCCGAACCTTTTACTTGTACAGCTCGTC3’。
下游同源片段porB-R的引物为:
PorBIRF: 5’GTACAAGTAAAAGGTTCGGGGGTAACCC3’;
PorBIRR: 5’AGACGTAGACCCTTAAGTACTCTATCGATCCCGATTTTCCATTTG3’。
分别扩增porB-L,GFP和porB-R,然后采用通过同源重组的方法,连接porB-L,GFP,porB-R以及SnaBI酶切纯化后的CRISPR/Cas9敲除载体,构建成porB基因替换载体。
porB LGR长度为3068bp,融合后序列如SEQ ID No.9所示。
3、porB基因的敲除具体操作流程:
a、将porB基因替换载体质粒从E.coli中提出,取1μg DNA共转化谷氨酸棒状杆菌感受态,电击转化条件为1800v,50ms,恢复培养后涂布于含有氯霉素的LBHIS固体培养基,30℃培养36h;
b、挑取平板上的单菌落,利用cas9基因引物;
cas9-F:5’ACAACTAATGGATAAAAAGTATTC 3’;
cas9-R:5’ TATGAATTCTTAGTCGCCACCCA 3’;
验证cas9表达载体是否正确转入;
c、挑选正确的转化子,接种于LBB液体培养基中30℃培养12h,将培养物划线与含有氯霉素以及IPTG的固体培养基中,30℃培养24h;
d、挑取平板上的单菌落用同源片段引物porB L-F 和porB R-R PCR验证获得目的菌株,同时把扩增出来的片段进行测序验证,最终根据基因型及测序结果挑选正确的菌株及porB基因敲除菌株,基因型验证结果如图4所示。
实验证明,利用本发明构建的CRISPR/Cas9基因编辑***对谷氨酸棒状杆菌基因进行替换,具有周期短,节省成本效率高等优点,使用该***对谷氨酸棒状杆菌基因替换效率能达到66.7%。
质粒的除去,把挑选出的敲除菌株在不加抗生素的培养基中30℃培养过夜,37℃继续培养8小时后,划线不含抗生素的LBB固体培养基上,载体即可除去;利用cas9引物和抗生素验证载体的消除。
应用例3 :porB基因定点突变
载体的构建
一种谷氨酸棒状杆菌porB基因定点突变,包括porB基因定点突变的CRISPR/Cas9载体的构建及其应用。
根据谷氨酸棒状杆菌基因组序列(NCBI Reference Sequence: NC_003450.3),针对porb基因寻找5′-(N20)-NGG-3′结构,porb基因正义链的靶点序列、以及针对靶点序列设计sgRNA N20序列分别如下所示:
靶点序列为:
GGAGGATAGGTTTGCGAAGTCGG
sgRNA N20序列为:
GGAGGATAGGTTTGCGAAGT;
设计引物正向引物F:5’GGAGGATAGGTTTGCGAAGTGTTTT3’;
反向引物R:5’ACTTCGCAAACCTATCCTCCGGATC3’。
寡核苷酸退后成双链后,用连接酶连接到AjuI酶切纯化后的CRISPR/Cas9敲除载体中。
sgRNA序列为:
GGAGGATAGGTTTGCGAAGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT;
b、制备带有酶切识别序列的同源修复序列
根据porB基因序列设计带有酶切识别序列的同源修复序列porBMLR,同源修复序列porBMLR由porB基因的上游同源片段porB-L和下游同源片段porB-R依次连接组成,其中porB-L、porB-R分别引入SnaBI识别序列。
上游同源片段porB-L的引物为:
porBMLF:5’TCTATTTAAATTTCGAATACGTCTTTCTAACCAAAAGACC 3’;
porBMLR:5’ GGTTTAGTATCTCGGATG 3’。
下游同源片段porB-R的引物为:
PorBMRF: 5’ATCCGAGATACTAAACCTATC3’;
PorBMRR: 5’AGACGTAGACCCTTAAGTACGAACCTTTTAGGAAGAGAAG3’。
分别扩增porB-L和porB-R,然后采用通过同源重组的方法,连接porB-L,porB-R以及SnaBI酶切纯化后的CRISPR/Cas9敲除载体,构建成porB基因定点突变载体。
porBMLR长度为606bp,融合后序列如SEQ ID No.10所示。
3、porB基因的定点具体操作流程:
a、将porB基因定点载体质粒从E.coli中提出,取1μg DNA转化谷氨酸棒状杆菌感受态,电击转化条件为1800v,50ms,恢复培养后涂布于含有氯霉素的LBHIS固体培养基,30℃培养36h。
b、挑取平板上的单菌落,利用cas9基因引物;
cas9-F:5’ACAACTAATGGATAAAAAGTATTC 3’;
cas9-R:5’ TATGAATTCTTAGTCGCCACCCA 3’;
验证cas9表达载体是否正确转入;
c、挑选正确的转化子,接种于LBB液体培养基中30℃培养12h,将培养物划线与含有氯霉素以及IPTG的固体培养基中,30℃培养24h。
d、挑取平板上的单菌落用同源片段引物porBMLF 和porBMRR PCR验证获得目的菌株,同时把扩增出来的片段进行测序验证,最终根据基因型及测序结果挑选正确的菌株及porB基因敲除菌株,基因型验证结果如图5所示。
实验证明,利用本发明构建的CRISPR/Cas9基因编辑***对谷氨酸棒状杆菌基因定点突变,具有周期短,节省成本效率高等优点,使用该***对谷氨酸棒状杆菌基因定点突变效率能达到100%。
质粒的除去,把挑选出的敲除菌株在不加抗生素的培养基中37℃培养过夜,,划线不含抗生素的LBB固体培养基上,载体即可除去;利用cas9引物和抗生素验证载体的消除。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体、制备方法、***及其应用
<130> 2017
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 6816
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaagggcacc aataactgcc ttaaaaaaat tacgccccgc cctgccactc atcgcagtac 60
tgttgtaatt cattaagcat tctgccgaca tggaagccat cacagacggc atgatgaacc 120
tgaatcgcca gcggcatcag caccttgtcg ccttgcgtat aatatttgcc catggtgaaa 180
acgggggcga agaagttgtc catattggcc acgtttaaat caaaactggt gaaactcacc 240
cagggattgg ctgagacgaa aaacatattc tcaataaacc ctttagggaa ataggccagg 300
ttttcaccgt aacacgccac atcttgcgaa tatatgtgta gaaactgccg gaaatcgtcg 360
tggtattcac tccagagcga tgaaaacgtt tcagtttgct catggaaaac ggtgtaacaa 420
gggtgaacac tatcccatat caccagctca ccgtctttca ttgccatacg gaactccgga 480
tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt gtgcttattt 540
ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt ataggtacat 600
tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga tatatcaacg 660
gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga aaatctcgtc 720
gaagctcggc ggatttgtcc tactcaagct gatccgacaa aatccacaca ttatcccagg 780
tgtccggatc ggtcaaatac gctgccagct catagaccgt atccaaagca tccggggctg 840
atccccggcg ccagggtggt ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag ctgattgccc 900
ttcaccgcct ggccctgaga gagttgcagc aagcggtcca cgtggtttgc cccagcaggc 960
gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct tcggtatcgt 1020
cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta atggcgcgca 1080
ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg atgccctcat 1140
tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct tcccgttccg 1200
ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga cgcagacgcg 1260
ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc aatgcgacca 1320
gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg ttgatgggtg 1380
tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct tccacagcaa 1440
tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt tgcgcgagaa 1500
gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc gacaccacca 1560
cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt 1620
gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt 1680
gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg 1740
ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac 1800
cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac 1860
tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcaccattcg atggtgtcaa 1920
cgtaaatgcc gcttcgcctt cgcgcgcgaa ttgcaagctg atccgggctt atcgactgca 1980
cggtgcacca atgcttctgg cgtcaggcag ccatcggaag ctgtggtatg gctgtgcagg 2040
tcgtaaatca ctgcataatt cgtgtcgctc aaggcgcact cccgttctgg ataatgtttt 2100
ttgcgccgac atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa tgagctgttg acaattaatc 2160
atcggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagaat 2220
taattaagct taaaggagga caactaatgg ataaaaagta ttccattggc ctggacatcg 2280
gcaccaattc tgtgggttgg gcagtcatca ccgacgaata caaggtccca tccaagaagt 2340
tcaaggtgct cggtaatacc gatcgccact ctatcaagaa aaacctgatc ggcgccctgc 2400
tcttcgactc cggcgaaacc gcagaagcaa cccgtctcaa gcgtaccgca cgtcgccgct 2460
acacccgccg taagaatcgc atctgctacc tccaggaaat cttctctaat gagatggcaa 2520
aggtggatga ctcctttttc caccgcctcg aagagtcctt cctggtggaa gaggacaaga 2580
aacacgagcg ccatcctatc ttcggcaata ttgtcgatga agtcgcatat catgaaaaat 2640
acccaaccat ttaccatctc cgtaaaaaac tcgtcgattc caccgataag gcagatctcc 2700
gcctgatcta tctggcactg gcccacatga tcaagtttcg tggccacttc ctgatcgaag 2760
gtgacctcaa tccagacaat tccgacgtgg acaagctgtt catccagctg gtgcaaacct 2820
acaaccagct ctttgaggaa aacccaatca acgcatctgg cgtcgacgca aaagccatcc 2880
tgtccgcccg tctctccaag tctcgtcgcc tcgaaaacct cattgcccag ctccctggcg 2940
agaagaaaaa cggtctgttc ggcaatctga tcgccctgtc tctgggtctg accccaaatt 3000
tcaaatccaa ctttgatctc gcagaagatg ccaagctgca gctctctaag gacacctacg 3060
atgatgacct ggataacctc ctcgcccaga tcggcgacca gtacgccgat ctcttcctcg 3120
cagccaagaa cctctctgac gcaattctgc tgtccgacat cctgcgcgtg aacaccgaaa 3180
tcactaaggc accactctct gcctccatga ttaagcgcta cgacgagcat catcaggatc 3240
tcactctcct caaagccctg gtccgccagc agctcccaga gaagtacaag gaaatctttt 3300
tcgaccaatc caaaaacggc tacgcaggtt acatcgatgg cggcgcctct caggaagagt 3360
tttacaaatt cattaagcca atcctcgaaa agatggacgg caccgaggaa ctgctggtga 3420
aactcaaccg tgaagatctc ctgcgcaaac agcgcacctt cgacaacggt tccattcctc 3480
accagatcca cctgggcgaa ctgcacgcaa tcctccgccg tcaagaggac ttctacccat 3540
tcctgaagga caaccgtgaa aagatcgaaa agattctcac cttccgcatc ccttactacg 3600
tgggtcctct cgcccgtggc aattcccgct tcgcctggat gactcgcaaa tctgaagaga 3660
ccatcacccc ttggaacttt gaggaagtcg tcgataaagg cgcctctgcc caatccttca 3720
tcgagcgcat gaccaacttc gacaagaacc tcccaaacga gaaagtgctg cctaagcatt 3780
ccctcctgta cgagtacttt actgtctaca atgagctgac taaggtgaag tatgtcactg 3840
aaggcatgcg taagccagcc tttctctccg gcgagcagaa aaaggcaatc gtcgacctcc 3900
tgtttaaaac caaccgcaaa gtgactgtga aacagctcaa ggaagattac tttaaaaaaa 3960
tcgaatgctt cgattctgtg gaaatctccg gcgtggagga tcgtttcaac gcctccctgg 4020
gtacctatca cgacctcctg aagattatca aggacaaaga ttttctggat aacgaggaaa 4080
acgaggacat tctcgaggac attgtgctga ccctgaccct cttcgaggac cgcgagatga 4140
tcgaggagcg cctgaagacc tatgcccacc tctttgacga caaggtcatg aagcaactca 4200
agcgccgccg ctataccggt tggggccgtc tctcccgtaa gctcatcaat ggtatccgcg 4260
acaagcaatc cggcaagact atcctggact ttctgaagtc tgacggcttc gccaaccgca 4320
attttatgca actgatccac gacgattccc tgaccttcaa agaggacatc cagaaagccc 4380
aagtgtccgg tcaaggcgac tccctgcacg aacacatcgc caatctggca ggttccccag 4440
caatcaagaa gggcatcctg cagaccgtca aggtggtgga cgaactcgtc aaagtgatgg 4500
gtcgccacaa accagaaaac atcgtcatcg agatggcccg tgagaaccag accacccaga 4560
aaggccagaa aaactcccgt gagcgcatga agcgcattga agaaggcatt aaagagctcg 4620
gctctcagat cctgaaagag catcctgtcg agaacaccca actgcagaat gagaagctgt 4680
atctgtatta tctccagaac ggccgcgaca tgtacgtcga ccaggaactg gacatcaacc 4740
gtctctctga ttacgatgtg gaccatatcg tccctcagtc tttcctgaaa gacgactcta 4800
ttgacaacaa agtcctcacc cgctccgaca agaaccgcgg caagtccgat aacgtgccat 4860
ccgaggaggt cgtgaagaag atgaagaact actggcgcca gctgctcaac gccaagctga 4920
tcactcagcg caagttcgat aacctgacca aggccgaacg tggtggtctc tccgagctcg 4980
acaaggcagg ctttatcaag cgccaactcg tggagactcg ccaaatcact aaacacgtcg 5040
cccagatcct cgactcccgc atgaatacca agtacgatga aaatgacaag ctcatccgcg 5100
aagtgaaagt cattaccctg aagtccaaac tggtctctga ctttcgcaag gatttccagt 5160
tctacaaggt ccgcgagatt aataactatc atcatgcaca cgatgcatac ctcaacgcag 5220
tcgtgggtac cgcactgatc aagaagtacc ctaaactgga gtccgagttc gtctatggcg 5280
actacaaggt gtacgacgtc cgcaaaatga ttgccaagtc cgagcaggag atcggcaaag 5340
caactgccaa atatttcttt tactccaaca tcatgaactt cttcaagacc gaaatcaccc 5400
tcgccaacgg tgaaatccgc aaacgtccac tcatcgagac taatggtgaa accggcgaga 5460
tcgtctggga caagggccgt gacttcgcaa ccgtccgcaa ggtcctctcc atgccacagg 5520
tcaacatcgt gaaaaagacc gaggtgcaaa ccggcggctt ctccaaggag tctatcctgc 5580
ctaaacgcaa ttccgataag ctcattgcac gcaaaaagga ctgggaccct aaaaaatacg 5640
gcggtttcga ctccccaact gtcgcatatt ctgtgctcgt ggtcgccaaa gtggaaaagg 5700
gcaaatccaa aaagctcaag tccgtcaagg aactcctggg tatcaccatc atggaacgct 5760
cctcctttga gaagaaccct atcgatttcc tcgaagcaaa aggttacaag gaggtgaaga 5820
aagatctgat catcaagctc cctaaatact ccctcttcga gctcgagaac ggccgcaagc 5880
gtatgctggc ctccgcaggt gaactgcaaa aaggtaacga gctggcactc ccatccaagt 5940
atgtcaactt tctctacctg gcctcccact acgaaaagct gaaaggttcc ccagaagaca 6000
acgagcagaa acagctgttc gtggagcagc acaagcacta cctggacgaa atcatcgagc 6060
agatctccga gttctctaaa cgcgtcattc tggccgatgc caacctcgat aaagtgctct 6120
ccgcctacaa taagcatcgt gataagccaa tccgtgagca ggcagagaac atcattcacc 6180
tgttcactct caccaacctg ggtgcaccag ccgcctttaa gtacttcgac accaccatcg 6240
accgcaagcg ctatacctcc actaaggagg tgctcgatgc aaccctgatc caccagtcta 6300
tcaccggcct ctacgagact cgcatcgatc tctcccagct gggtggcgac taagaattca 6360
gcttggctgt tttggcggat gagagaagat tttcagcctg atacagatta aatcagaacg 6420
cagaagcggt ctgataaaac agaatttgcc tggcggcagt agcgcggtgg tcccacctga 6480
ccccatgccg aactcagaag tgaaacgccg tagcgccgat ggtagtgtgg ggtctcccca 6540
tgcgagagta gggaactgcc aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg 6600
cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca aatccgccgg 6660
gagcggattt gaacgttgcg aagcaacggc ccggagggtg gcgggcagga cgcccgccat 6720
aaactgccag gcatcaaatt aagcagaagg ccatcctgac ggatggcctt tttgcgtttc 6780
tacaaactct tttgtttatt tttctaaata cattca 6816
<210> 2
<211> 869
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcgaattgat ctggtttgac agcttatcat cgactgcacg gtgcaccaat gcttctggcg 60
tcaggcagcc atcggaagct gtggtatggc tgtgcaggtc gtaaatcact gcataattcg 120
tgtcgctcaa ggcgcactcc cgttctggat aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt 180
ctggcaaata ttctgaaatg agctgttgac aattaatcat ccggctcgta taatgtgtgg 240
aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagacca tgggatccta caatggaaat 300
acagattggg gatgagtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta 360
tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg cttttttgcg gccgcgcatg caagcttggc 420
tgttttggcg gatgagagaa gattttcagc ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc 480
ggtctgataa aacagaattt gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg 540
ccgaactcag aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga 600
gtagggaact gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg 660
ttttatctgt tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga 720
tttgaacgtt gcgaagcaac ggcccggagg gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc 780
caggcatcaa attaagcaga aggccatcct gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac 840
tctatttaaa tttcgaatac gtacttaag 869
<210> 3
<211> 3600
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggtctacgtc tgatgctttg aatcggacgg acttgccgat cttgtatgcg gtgatttttc 60
cctcgtttgc ccacttttta atggtggccg gggtgagagc tacgcgggcg gcgacctgct 120
gcgctgtgat ccaatattcg gggtcgttca ctggttcccc tttctgattt ctggcataga 180
agaacccccg tgaactgtgt ggttccgggg gttgctgatt tttgcgagac ttctcgcgca 240
attccctagc ttaggtgaaa acaccatgaa acactaggga aacacccatg aaacacccat 300
tagggcagta gggcggcttc ttcgtctagg gcttgcattt gggcggtgat ctggtcttta 360
gcgtgtgaaa gtgtgtcgta ggtggcgtgc tcaatgcact cgaacgtcac gtcatttacc 420
gggtcacggt gggcaaagag aactagtggg ttagacattg ttttcctcgt tgtcggtggt 480
ggtgagcttt tctagccgct cggtaaacgc ggcgatcatg aactcttgga ggttttcacc 540
gttctgcatg cctgcgcgct tcatgtcctc acgtagtgcc aaaggaacgc gtgcggtgac 600
cacgacgggc ttagcctttg cctgcgcttc tagtgcttcg atggtggctt gtgcctgcgc 660
ttgctgcgcc tgtagtgcct gttgagcttc ttgtagttgc tgttctagct gtgccttggt 720
tgccatgctt taagactcta gtagctttcc tgcgatatgt catgcgcatg cgtagcaaac 780
attgtcctgc aactcattca ttatgtgcag tgctcctgtt actagtcgta catactcata 840
tttacctagt ctgcatgcag tgcatgcaca tgcagtcatg tcgtgctaat gtgtaaaaca 900
tgtacatgca gattgctggg ggtgcagggg gcggagccac cctgtccatg cggggtgtgg 960
ggcttgcccc gccggtacag acagtgagca ccggggcacc tagtcgcgga taccccccct 1020
aggtatcgga cacgtaaccc tcccatgtcg atgcaaatct ttaacattga gtacgggtaa 1080
gctggcacgc atagccaagc taggcggcca ccaaacacca ctaaaaatta atagtcccta 1140
gacaagacaa acccccgtgc gagctaccaa ctcatatgca cgggggccac ataacccgaa 1200
ggggtttcaa ttgacaacca tagcactagc taagacaacg ggcacaacac ccgcacaaac 1260
tcgcactgcg caaccccgca caacatcggg tctaggtaac actgaaatag aagtgaacac 1320
ctctaaggaa ccgcaggtca atgagggttc taaggtcact cgcgctaggg cgtggcgtag 1380
gcaaaacgtc atgtacaaga tcaccaatag taaggctctg gcggggtgcc ataggtggcg 1440
cagggacgaa gctgttgcgg tgtcctggtc gtctaacggt gcttcgcagt ttgagggtct 1500
gcaaaactct cactctcgct gggggtcatc tctggctgaa ttggaagtca tgggcgaacg 1560
ccgcattgag ctggctattg ctactaagaa tcacttggcg gcgggtggcg cgctcatgat 1620
gtttgtgggc actgttcgac acaaccgctc acagtcattt gcgcaggttg aagcgggtat 1680
taagactgcg tactcttcga tggtgaaaac atctcagtgg aagaaagaac gtgcacggta 1740
cggggtggag cacacctata gtgactatga ggtcacagac tcttgggcga acggttggca 1800
cttgcaccgc aacatgctgt tgttcttgga tcgtccactg tctgacgatg aactcaaggc 1860
gtttgaggat tccatgtttt cccgctggtc tgctggtgtg gttaaggccg gtatggacgc 1920
gccactgcgt gagcacgggg tcaaacttga tcaggtgtct acctggggtg gagacgctgc 1980
gaaaatggca acctacctcg ctaagggcat gtctcaggaa ctgactggct ccgctactaa 2040
aaccgcgtct aaggggtcgt acacgccgtt tcagatgttg gatatgttgg ccgatcaaag 2100
cgacgccggc gaggatatgg acgctgtttt ggtggctcgg tggcgtgagt atgaggttgg 2160
ttctaaaaac ctgcgttcgt cctggtcacg tggggctaag cgtgctttgg gcattgatta 2220
catagacgct gatgtacgtc gtgaaatgga agaagaactg tacaagctcg ccggtctgga 2280
agcaccggaa cgggtcgaat caacccgcgt tgctgttgct ttggtgaagc ccgatgattg 2340
gaaactgatt cagtctgatt tcgcggttag gcagtacgtt ctagattgcg tggataaggc 2400
taaggacgtg gccgctgcgc aacgtgtcgc taatgaggtg ctggcaagtc tgggtgtgga 2460
ttccaccccg tgcatgatcg ttatggatga tgtggacttg gacgcggttc tgcctactca 2520
tggggacgct actaagcgtg atctgaatgc ggcggtgttc gcgggtaatg agcagactat 2580
tcttcgcacc cactaaaagc ggcataaacc ccgttcgata ttttgtgcga tgaatttatg 2640
gtcaatgtcg cgggggcaaa ctatgatggg tcttgttgtt gacaatgaag cttcccgggt 2700
cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 2760
tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 2820
cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 2880
aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 2940
cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 3000
gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 3060
ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 3120
cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 3180
aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 3240
tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 3300
ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 3360
tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 3420
ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 3480
agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 3540
atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggcg 3600
<210> 4
<211> 11285
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 60
acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 120
tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 180
ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 240
ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 300
ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 360
actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 420
gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc 480
tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 540
caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 600
atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 660
acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 720
ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 780
ccaatgctta atcagtgagg cggaagggca ccaataactg ccttaaaaaa attacgcccc 840
gccctgccac tcatcgcagt actgttgtaa ttcattaagc attctgccga catggaagcc 900
atcacagacg gcatgatgaa cctgaatcgc cagcggcatc agcaccttgt cgccttgcgt 960
ataatatttg cccatggtga aaacgggggc gaagaagttg tccatattgg ccacgtttaa 1020
atcaaaactg gtgaaactca cccagggatt ggctgagacg aaaaacatat tctcaataaa 1080
ccctttaggg aaataggcca ggttttcacc gtaacacgcc acatcttgcg aatatatgtg 1140
tagaaactgc cggaaatcgt cgtggtattc actccagagc gatgaaaacg tttcagtttg 1200
ctcatggaaa acggtgtaac aagggtgaac actatcccat atcaccagct caccgtcttt 1260
cattgccata cggaactccg gatgagcatt catcaggcgg gcaagaatgt gaataaaggc 1320
cggataaaac ttgtgcttat ttttctttac ggtctttaaa aaggccgtaa tatccagctg 1380
aacggtctgg ttataggtac attgagcaac tgactgaaat gcctcaaaat gttctttacg 1440
atgccattgg gatatatcaa cggtggtata tccagtgatt tttttctcca ttttagcttc 1500
cttagctcct gaaaatctcg tcgaagctcg gcggatttgt cctactcaag ctgatccgac 1560
aaaatccaca cattatccca ggtgtccgga tcggtcaaat acgctgccag ctcatagacc 1620
gtatccaaag catccggggc tgatccccgg cgccagggtg gtttttcttt tcaccagtga 1680
gacgggcaac agctgattgc ccttcaccgc ctggccctga gagagttgca gcaagcggtc 1740
cacgtggttt gccccagcag gcgaaaatcc tgtttgatgg tggttaacgg cgggatataa 1800
catgagctgt cttcggtatc gtcgtatccc actaccgaga tatccgcacc aacgcgcagc 1860
ccggactcgg taatggcgcg cattgcgccc agcgccatct gatcgttggc aaccagcatc 1920
gcagtgggaa cgatgccctc attcagcatt tgcatggttt gttgaaaacc ggacatggca 1980
ctccagtcgc cttcccgttc cgctatcggc tgaatttgat tgcgagtgag atatttatgc 2040
cagccagcca gacgcagacg cgccgagaca gaacttaatg ggcccgctaa cagcgcgatt 2100
tgctggtgac ccaatgcgac cagatgctcc acgcccagtc gcgtaccgtc ttcatgggag 2160
aaaataatac tgttgatggg tgtctggtca gagacatcaa gaaataacgc cggaacatta 2220
gtgcaggcag cttccacagc aatggcatcc tggtcatcca gcggatagtt aatgatcagc 2280
ccactgacgc gttgcgcgag aagattgtgc accgccgctt tacaggcttc gacgccgctt 2340
cgttctacca tcgacaccac cacgctggca cccagttgat cggcgcgaga tttaatcgcc 2400
gcgacaattt gcgacggcgc gtgcagggcc agactggagg tggcaacgcc aatcagcaac 2460
gactgtttgc ccgccagttg ttgtgccacg cggttgggaa tgtaattcag ctccgccatc 2520
gccgcttcca ctttttcccg cgttttcgca gaaacgtggc tggcctggtt caccacgcgg 2580
gaaacggtct gataagagac accggcatac tctgcgacat cgtataacgt tactggtttc 2640
acattcacca ccctgaattg actctcttcc gggcgctatc atgccatacc gcgaaaggtt 2700
ttgcaccatt cgatggtgtc aacgtaaatg ccgcttcgcc ttcgcgcgcg aattgcaagc 2760
tgatccgggc ttatcgactg cacggtgcac caatgcttct ggcgtcaggc agccatcgga 2820
agctgtggta tggctgtgca ggtcgtaaat cactgcataa ttcgtgtcgc tcaaggcgca 2880
ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac ggttctggca aatattctga 2940
aatgagctgt tgacaattaa tcatcggctc gtataatgtg tggaattgtg agcggataac 3000
aatttcacac aggaaacaga attaattaag cttaaaggag gacaactaat ggataaaaag 3060
tattccattg gcctggacat cggcaccaat tctgtgggtt gggcagtcat caccgacgaa 3120
tacaaggtcc catccaagaa gttcaaggtg ctcggtaata ccgatcgcca ctctatcaag 3180
aaaaacctga tcggcgccct gctcttcgac tccggcgaaa ccgcagaagc aacccgtctc 3240
aagcgtaccg cacgtcgccg ctacacccgc cgtaagaatc gcatctgcta cctccaggaa 3300
atcttctcta atgagatggc aaaggtggat gactcctttt tccaccgcct cgaagagtcc 3360
ttcctggtgg aagaggacaa gaaacacgag cgccatccta tcttcggcaa tattgtcgat 3420
gaagtcgcat atcatgaaaa atacccaacc atttaccatc tccgtaaaaa actcgtcgat 3480
tccaccgata aggcagatct ccgcctgatc tatctggcac tggcccacat gatcaagttt 3540
cgtggccact tcctgatcga aggtgacctc aatccagaca attccgacgt ggacaagctg 3600
ttcatccagc tggtgcaaac ctacaaccag ctctttgagg aaaacccaat caacgcatct 3660
ggcgtcgacg caaaagccat cctgtccgcc cgtctctcca agtctcgtcg cctcgaaaac 3720
ctcattgccc agctccctgg cgagaagaaa aacggtctgt tcggcaatct gatcgccctg 3780
tctctgggtc tgaccccaaa tttcaaatcc aactttgatc tcgcagaaga tgccaagctg 3840
cagctctcta aggacaccta cgatgatgac ctggataacc tcctcgccca gatcggcgac 3900
cagtacgccg atctcttcct cgcagccaag aacctctctg acgcaattct gctgtccgac 3960
atcctgcgcg tgaacaccga aatcactaag gcaccactct ctgcctccat gattaagcgc 4020
tacgacgagc atcatcagga tctcactctc ctcaaagccc tggtccgcca gcagctccca 4080
gagaagtaca aggaaatctt tttcgaccaa tccaaaaacg gctacgcagg ttacatcgat 4140
ggcggcgcct ctcaggaaga gttttacaaa ttcattaagc caatcctcga aaagatggac 4200
ggcaccgagg aactgctggt gaaactcaac cgtgaagatc tcctgcgcaa acagcgcacc 4260
ttcgacaacg gttccattcc tcaccagatc cacctgggcg aactgcacgc aatcctccgc 4320
cgtcaagagg acttctaccc attcctgaag gacaaccgtg aaaagatcga aaagattctc 4380
accttccgca tcccttacta cgtgggtcct ctcgcccgtg gcaattcccg cttcgcctgg 4440
atgactcgca aatctgaaga gaccatcacc ccttggaact ttgaggaagt cgtcgataaa 4500
ggcgcctctg cccaatcctt catcgagcgc atgaccaact tcgacaagaa cctcccaaac 4560
gagaaagtgc tgcctaagca ttccctcctg tacgagtact ttactgtcta caatgagctg 4620
actaaggtga agtatgtcac tgaaggcatg cgtaagccag cctttctctc cggcgagcag 4680
aaaaaggcaa tcgtcgacct cctgtttaaa accaaccgca aagtgactgt gaaacagctc 4740
aaggaagatt actttaaaaa aatcgaatgc ttcgattctg tggaaatctc cggcgtggag 4800
gatcgtttca acgcctccct gggtacctat cacgacctcc tgaagattat caaggacaaa 4860
gattttctgg ataacgagga aaacgaggac attctcgagg acattgtgct gaccctgacc 4920
ctcttcgagg accgcgagat gatcgaggag cgcctgaaga cctatgccca cctctttgac 4980
gacaaggtca tgaagcaact caagcgccgc cgctataccg gttggggccg tctctcccgt 5040
aagctcatca atggtatccg cgacaagcaa tccggcaaga ctatcctgga ctttctgaag 5100
tctgacggct tcgccaaccg caattttatg caactgatcc acgacgattc cctgaccttc 5160
aaagaggaca tccagaaagc ccaagtgtcc ggtcaaggcg actccctgca cgaacacatc 5220
gccaatctgg caggttcccc agcaatcaag aagggcatcc tgcagaccgt caaggtggtg 5280
gacgaactcg tcaaagtgat gggtcgccac aaaccagaaa acatcgtcat cgagatggcc 5340
cgtgagaacc agaccaccca gaaaggccag aaaaactccc gtgagcgcat gaagcgcatt 5400
gaagaaggca ttaaagagct cggctctcag atcctgaaag agcatcctgt cgagaacacc 5460
caactgcaga atgagaagct gtatctgtat tatctccaga acggccgcga catgtacgtc 5520
gaccaggaac tggacatcaa ccgtctctct gattacgatg tggaccatat cgtccctcag 5580
tctttcctga aagacgactc tattgacaac aaagtcctca cccgctccga caagaaccgc 5640
ggcaagtccg ataacgtgcc atccgaggag gtcgtgaaga agatgaagaa ctactggcgc 5700
cagctgctca acgccaagct gatcactcag cgcaagttcg ataacctgac caaggccgaa 5760
cgtggtggtc tctccgagct cgacaaggca ggctttatca agcgccaact cgtggagact 5820
cgccaaatca ctaaacacgt cgcccagatc ctcgactccc gcatgaatac caagtacgat 5880
gaaaatgaca agctcatccg cgaagtgaaa gtcattaccc tgaagtccaa actggtctct 5940
gactttcgca aggatttcca gttctacaag gtccgcgaga ttaataacta tcatcatgca 6000
cacgatgcat acctcaacgc agtcgtgggt accgcactga tcaagaagta ccctaaactg 6060
gagtccgagt tcgtctatgg cgactacaag gtgtacgacg tccgcaaaat gattgccaag 6120
tccgagcagg agatcggcaa agcaactgcc aaatatttct tttactccaa catcatgaac 6180
ttcttcaaga ccgaaatcac cctcgccaac ggtgaaatcc gcaaacgtcc actcatcgag 6240
actaatggtg aaaccggcga gatcgtctgg gacaagggcc gtgacttcgc aaccgtccgc 6300
aaggtcctct ccatgccaca ggtcaacatc gtgaaaaaga ccgaggtgca aaccggcggc 6360
ttctccaagg agtctatcct gcctaaacgc aattccgata agctcattgc acgcaaaaag 6420
gactgggacc ctaaaaaata cggcggtttc gactccccaa ctgtcgcata ttctgtgctc 6480
gtggtcgcca aagtggaaaa gggcaaatcc aaaaagctca agtccgtcaa ggaactcctg 6540
ggtatcacca tcatggaacg ctcctccttt gagaagaacc ctatcgattt cctcgaagca 6600
aaaggttaca aggaggtgaa gaaagatctg atcatcaagc tccctaaata ctccctcttc 6660
gagctcgaga acggccgcaa gcgtatgctg gcctccgcag gtgaactgca aaaaggtaac 6720
gagctggcac tcccatccaa gtatgtcaac tttctctacc tggcctccca ctacgaaaag 6780
ctgaaaggtt ccccagaaga caacgagcag aaacagctgt tcgtggagca gcacaagcac 6840
tacctggacg aaatcatcga gcagatctcc gagttctcta aacgcgtcat tctggccgat 6900
gccaacctcg ataaagtgct ctccgcctac aataagcatc gtgataagcc aatccgtgag 6960
caggcagaga acatcattca cctgttcact ctcaccaacc tgggtgcacc agccgccttt 7020
aagtacttcg acaccaccat cgaccgcaag cgctatacct ccactaagga ggtgctcgat 7080
gcaaccctga tccaccagtc tatcaccggc ctctacgaga ctcgcatcga tctctcccag 7140
ctgggtggcg actaagaatt cagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcagcc 7200
tgatacagat taaatcagaa cgcagaagcg gtctgataaa acagaatttg cctggcggca 7260
gtagcgcggt ggtcccacct gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg 7320
atggtagtgt ggggtctccc catgcgagag tagggaactg ccaggcatca aataaaacga 7380
aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc 7440
ctgagtagga caaatccgcc gggagcggat ttgaacgttg cgaagcaacg gcccggaggg 7500
tggcgggcag gacgcccgcc ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg 7560
acggatggcc tttttgcgtt tctacaaact cttttgttta tttttctaaa tacattcagc 7620
gaattgatct ggtttgacag cttatcatcg actgcacggt gcaccaatgc ttctggcgtc 7680
aggcagccat cggaagctgt ggtatggctg tgcaggtcgt aaatcactgc ataattcgtg 7740
tcgctcaagg cgcactcccg ttctggataa tgttttttgc gccgacatca taacggttct 7800
ggcaaatatt ctgaaatgag ctgttgacaa ttaatcatcc ggctcgtata atgtgtggaa 7860
ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagaccatg ggatcctaca atggaaatac 7920
agattgggga tgagttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc 7980
aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct tttttgcggc cgcgcatgca agcttggctg 8040
ttttggcgga tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt aaatcagaac gcagaagcgg 8100
tctgataaaa cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg gtcccacctg accccatgcc 8160
gaactcagaa gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg gggtctcccc atgcgagagt 8220
agggaactgc caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt 8280
ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt 8340
tgaacgttgc gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca taaactgcca 8400
ggcatcaaat taagcagaag gccatcctga cggatggcct ttttgcgttt ctacaaactc 8460
tatttaaatt tcgaatacgt acttaagggt ctacgtctga tgctttgaat cggacggact 8520
tgccgatctt gtatgcggtg atttttccct cgtttgccca ctttttaatg gtggccgggg 8580
tgagagctac gcgggcggcg acctgctgcg ctgtgatcca atattcgggg tcgttcactg 8640
gttccccttt ctgatttctg gcatagaaga acccccgtga actgtgtggt tccgggggtt 8700
gctgattttt gcgagacttc tcgcgcaatt ccctagctta ggtgaaaaca ccatgaaaca 8760
ctagggaaac acccatgaaa cacccattag ggcagtaggg cggcttcttc gtctagggct 8820
tgcatttggg cggtgatctg gtctttagcg tgtgaaagtg tgtcgtaggt ggcgtgctca 8880
atgcactcga acgtcacgtc atttaccggg tcacggtggg caaagagaac tagtgggtta 8940
gacattgttt tcctcgttgt cggtggtggt gagcttttct agccgctcgg taaacgcggc 9000
gatcatgaac tcttggaggt tttcaccgtt ctgcatgcct gcgcgcttca tgtcctcacg 9060
tagtgccaaa ggaacgcgtg cggtgaccac gacgggctta gcctttgcct gcgcttctag 9120
tgcttcgatg gtggcttgtg cctgcgcttg ctgcgcctgt agtgcctgtt gagcttcttg 9180
tagttgctgt tctagctgtg ccttggttgc catgctttaa gactctagta gctttcctgc 9240
gatatgtcat gcgcatgcgt agcaaacatt gtcctgcaac tcattcatta tgtgcagtgc 9300
tcctgttact agtcgtacat actcatattt acctagtctg catgcagtgc atgcacatgc 9360
agtcatgtcg tgctaatgtg taaaacatgt acatgcagat tgctgggggt gcagggggcg 9420
gagccaccct gtccatgcgg ggtgtggggc ttgccccgcc ggtacagaca gtgagcaccg 9480
gggcacctag tcgcggatac cccccctagg tatcggacac gtaaccctcc catgtcgatg 9540
caaatcttta acattgagta cgggtaagct ggcacgcata gccaagctag gcggccacca 9600
aacaccacta aaaattaata gtccctagac aagacaaacc cccgtgcgag ctaccaactc 9660
atatgcacgg gggccacata acccgaaggg gtttcaattg acaaccatag cactagctaa 9720
gacaacgggc acaacacccg cacaaactcg cactgcgcaa ccccgcacaa catcgggtct 9780
aggtaacact gaaatagaag tgaacacctc taaggaaccg caggtcaatg agggttctaa 9840
ggtcactcgc gctagggcgt ggcgtaggca aaacgtcatg tacaagatca ccaatagtaa 9900
ggctctggcg gggtgccata ggtggcgcag ggacgaagct gttgcggtgt cctggtcgtc 9960
taacggtgct tcgcagtttg agggtctgca aaactctcac tctcgctggg ggtcatctct 10020
ggctgaattg gaagtcatgg gcgaacgccg cattgagctg gctattgcta ctaagaatca 10080
cttggcggcg ggtggcgcgc tcatgatgtt tgtgggcact gttcgacaca accgctcaca 10140
gtcatttgcg caggttgaag cgggtattaa gactgcgtac tcttcgatgg tgaaaacatc 10200
tcagtggaag aaagaacgtg cacggtacgg ggtggagcac acctatagtg actatgaggt 10260
cacagactct tgggcgaacg gttggcactt gcaccgcaac atgctgttgt tcttggatcg 10320
tccactgtct gacgatgaac tcaaggcgtt tgaggattcc atgttttccc gctggtctgc 10380
tggtgtggtt aaggccggta tggacgcgcc actgcgtgag cacggggtca aacttgatca 10440
ggtgtctacc tggggtggag acgctgcgaa aatggcaacc tacctcgcta agggcatgtc 10500
tcaggaactg actggctccg ctactaaaac cgcgtctaag gggtcgtaca cgccgtttca 10560
gatgttggat atgttggccg atcaaagcga cgccggcgag gatatggacg ctgttttggt 10620
ggctcggtgg cgtgagtatg aggttggttc taaaaacctg cgttcgtcct ggtcacgtgg 10680
ggctaagcgt gctttgggca ttgattacat agacgctgat gtacgtcgtg aaatggaaga 10740
agaactgtac aagctcgccg gtctggaagc accggaacgg gtcgaatcaa cccgcgttgc 10800
tgttgctttg gtgaagcccg atgattggaa actgattcag tctgatttcg cggttaggca 10860
gtacgttcta gattgcgtgg ataaggctaa ggacgtggcc gctgcgcaac gtgtcgctaa 10920
tgaggtgctg gcaagtctgg gtgtggattc caccccgtgc atgatcgtta tggatgatgt 10980
ggacttggac gcggttctgc ctactcatgg ggacgctact aagcgtgatc tgaatgcggc 11040
ggtgttcgcg ggtaatgagc agactattct tcgcacccac taaaagcggc ataaaccccg 11100
ttcgatattt tgtgcgatga atttatggtc aatgtcgcgg gggcaaacta tgatgggtct 11160
tgttgttgac aatgaagctt cccgggtcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 11220
tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 11280
aaaaa 11285
<210> 5
<211> 4107
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atggataaaa agtattccat tggcctggac atcggcacca attctgtggg ttgggcagtc 60
atcaccgacg aatacaaggt cccatccaag aagttcaagg tgctcggtaa taccgatcgc 120
cactctatca agaaaaacct gatcggcgcc ctgctcttcg actccggcga aaccgcagaa 180
gcaacccgtc tcaagcgtac cgcacgtcgc cgctacaccc gccgtaagaa tcgcatctgc 240
tacctccagg aaatcttctc taatgagatg gcaaaggtgg atgactcctt tttccaccgc 300
ctcgaagagt ccttcctggt ggaagaggac aagaaacacg agcgccatcc tatcttcggc 360
aatattgtcg atgaagtcgc atatcatgaa aaatacccaa ccatttacca tctccgtaaa 420
aaactcgtcg attccaccga taaggcagat ctccgcctga tctatctggc actggcccac 480
atgatcaagt ttcgtggcca cttcctgatc gaaggtgacc tcaatccaga caattccgac 540
gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcaa acctacaacc agctctttga ggaaaaccca 600
atcaacgcat ctggcgtcga cgcaaaagcc atcctgtccg cccgtctctc caagtctcgt 660
cgcctcgaaa acctcattgc ccagctccct ggcgagaaga aaaacggtct gttcggcaat 720
ctgatcgccc tgtctctggg tctgacccca aatttcaaat ccaactttga tctcgcagaa 780
gatgccaagc tgcagctctc taaggacacc tacgatgatg acctggataa cctcctcgcc 840
cagatcggcg accagtacgc cgatctcttc ctcgcagcca agaacctctc tgacgcaatt 900
ctgctgtccg acatcctgcg cgtgaacacc gaaatcacta aggcaccact ctctgcctcc 960
atgattaagc gctacgacga gcatcatcag gatctcactc tcctcaaagc cctggtccgc 1020
cagcagctcc cagagaagta caaggaaatc tttttcgacc aatccaaaaa cggctacgca 1080
ggttacatcg atggcggcgc ctctcaggaa gagttttaca aattcattaa gccaatcctc 1140
gaaaagatgg acggcaccga ggaactgctg gtgaaactca accgtgaaga tctcctgcgc 1200
aaacagcgca ccttcgacaa cggttccatt cctcaccaga tccacctggg cgaactgcac 1260
gcaatcctcc gccgtcaaga ggacttctac ccattcctga aggacaaccg tgaaaagatc 1320
gaaaagattc tcaccttccg catcccttac tacgtgggtc ctctcgcccg tggcaattcc 1380
cgcttcgcct ggatgactcg caaatctgaa gagaccatca ccccttggaa ctttgaggaa 1440
gtcgtcgata aaggcgcctc tgcccaatcc ttcatcgagc gcatgaccaa cttcgacaag 1500
aacctcccaa acgagaaagt gctgcctaag cattccctcc tgtacgagta ctttactgtc 1560
tacaatgagc tgactaaggt gaagtatgtc actgaaggca tgcgtaagcc agcctttctc 1620
tccggcgagc agaaaaaggc aatcgtcgac ctcctgttta aaaccaaccg caaagtgact 1680
gtgaaacagc tcaaggaaga ttactttaaa aaaatcgaat gcttcgattc tgtggaaatc 1740
tccggcgtgg aggatcgttt caacgcctcc ctgggtacct atcacgacct cctgaagatt 1800
atcaaggaca aagattttct ggataacgag gaaaacgagg acattctcga ggacattgtg 1860
ctgaccctga ccctcttcga ggaccgcgag atgatcgagg agcgcctgaa gacctatgcc 1920
cacctctttg acgacaaggt catgaagcaa ctcaagcgcc gccgctatac cggttggggc 1980
cgtctctccc gtaagctcat caatggtatc cgcgacaagc aatccggcaa gactatcctg 2040
gactttctga agtctgacgg cttcgccaac cgcaatttta tgcaactgat ccacgacgat 2100
tccctgacct tcaaagagga catccagaaa gcccaagtgt ccggtcaagg cgactccctg 2160
cacgaacaca tcgccaatct ggcaggttcc ccagcaatca agaagggcat cctgcagacc 2220
gtcaaggtgg tggacgaact cgtcaaagtg atgggtcgcc acaaaccaga aaacatcgtc 2280
atcgagatgg cccgtgagaa ccagaccacc cagaaaggcc agaaaaactc ccgtgagcgc 2340
atgaagcgca ttgaagaagg cattaaagag ctcggctctc agatcctgaa agagcatcct 2400
gtcgagaaca cccaactgca gaatgagaag ctgtatctgt attatctcca gaacggccgc 2460
gacatgtacg tcgaccagga actggacatc aaccgtctct ctgattacga tgtggaccat 2520
atcgtccctc agtctttcct gaaagacgac tctattgaca acaaagtcct cacccgctcc 2580
gacaagaacc gcggcaagtc cgataacgtg ccatccgagg aggtcgtgaa gaagatgaag 2640
aactactggc gccagctgct caacgccaag ctgatcactc agcgcaagtt cgataacctg 2700
accaaggccg aacgtggtgg tctctccgag ctcgacaagg caggctttat caagcgccaa 2760
ctcgtggaga ctcgccaaat cactaaacac gtcgcccaga tcctcgactc ccgcatgaat 2820
accaagtacg atgaaaatga caagctcatc cgcgaagtga aagtcattac cctgaagtcc 2880
aaactggtct ctgactttcg caaggatttc cagttctaca aggtccgcga gattaataac 2940
tatcatcatg cacacgatgc atacctcaac gcagtcgtgg gtaccgcact gatcaagaag 3000
taccctaaac tggagtccga gttcgtctat ggcgactaca aggtgtacga cgtccgcaaa 3060
atgattgcca agtccgagca ggagatcggc aaagcaactg ccaaatattt cttttactcc 3120
aacatcatga acttcttcaa gaccgaaatc accctcgcca acggtgaaat ccgcaaacgt 3180
ccactcatcg agactaatgg tgaaaccggc gagatcgtct gggacaaggg ccgtgacttc 3240
gcaaccgtcc gcaaggtcct ctccatgcca caggtcaaca tcgtgaaaaa gaccgaggtg 3300
caaaccggcg gcttctccaa ggagtctatc ctgcctaaac gcaattccga taagctcatt 3360
gcacgcaaaa aggactggga ccctaaaaaa tacggcggtt tcgactcccc aactgtcgca 3420
tattctgtgc tcgtggtcgc caaagtggaa aagggcaaat ccaaaaagct caagtccgtc 3480
aaggaactcc tgggtatcac catcatggaa cgctcctcct ttgagaagaa ccctatcgat 3540
ttcctcgaag caaaaggtta caaggaggtg aagaaagatc tgatcatcaa gctccctaaa 3600
tactccctct tcgagctcga gaacggccgc aagcgtatgc tggcctccgc aggtgaactg 3660
caaaaaggta acgagctggc actcccatcc aagtatgtca actttctcta cctggcctcc 3720
cactacgaaa agctgaaagg ttccccagaa gacaacgagc agaaacagct gttcgtggag 3780
cagcacaagc actacctgga cgaaatcatc gagcagatct ccgagttctc taaacgcgtc 3840
attctggccg atgccaacct cgataaagtg ctctccgcct acaataagca tcgtgataag 3900
ccaatccgtg agcaggcaga gaacatcatt cacctgttca ctctcaccaa cctgggtgca 3960
ccagccgcct ttaagtactt cgacaccacc atcgaccgca agcgctatac ctccactaag 4020
gaggtgctcg atgcaaccct gatccaccag tctatcaccg gcctctacga gactcgcatc 4080
gatctctccc agctgggtgg cgactaa 4107
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aaaggaggac aacta 15
<210> 7
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tacaatggaa atacagattg gggatgagtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 60
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgctttttt 109
<210> 8
<211> 2068
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggagtggaca agtcacgatc gttggaacac aacaggtttg cggcactcaa tgctgcgtca 60
tcaatttggt tggggtccgc taccccatca ccgtttgcat ccaatcccat aagtcgccac 120
gtttccggaa tgaactgcat gggacctacc gcgcgatcat attcagtatc gccatctaat 180
tccccaccat cagtgtcggg aatttccgca aaccccggtg aaccatcaag tggaacgccg 240
atgattggag gggttgcaac tccattttca tccagggaac tgcccccgaa cattttgccg 300
ttgtaggtac cgtgacgggt ttccacctgg ccgatacctg ccaaggtatt ccaccccaga 360
ttgcagccag accacgcagt actcgcaatg agctctgcgt ttccataagc cgcaatcgct 420
tgagcggaca caccagtatc ttgagcaatt ggttccgccc aaaaacgcaa atggtcggat 480
gtgcgtccat ctgcccctgt atcaatttgc ggaacttcta caccacgcgc cggcggaaca 540
tcttcaggga tttgctggag ttggcgaata ggtgccgttc catccatgaa gctaagcgcc 600
catccaacaa atgagatcac catgatgacg gccaaaaccg aaccgcatcc aaatcccatt 660
gcttttctaa cccctgaact catgagggtc gatgttaccg gctcgtttta gaactctcgc 720
attggctaga aaaacctgat tacttcacgc ctctttaagt aaaaaatcct gtgtctttct 780
aaccaaaaga cccaaaaaga cacgctaaat cagcctccta tgcaattagt agagcattca 840
catacaccgt gccaagacct aatttccacg actgaaactt caccaaatcc gcaggtagaa 900
actttgatga tctacatcac aaatttacaa tgtgtgatga gttgttcata taacccaagg 960
acttgaacct taaaaggagc cttagaatca tgaagctttc acaccgcatc gcagcaatgg 1020
cagcaaccgc aggcatcaca gtggcatgtc ctccaacttc tcttcctaaa aggttcgggg 1080
gtaaccccaa aaatcactta agccacaaca gtcacataaa tcacttcagt aacgtacgat 1140
tttggactgt tgtggctttt gccatattta tttcatttcc atctcagtga tctcttaagg 1200
aaacccatga agaaactacg tttcgccacc atcgcggccg ctaccgttgc cctgactgcg 1260
agcctttccc tctcagcttc cgcacaggac ttcaaccaaa tcatcgacaa ctttgattgt 1320
ggcatcctcc agaccgctat ctacaccacc ggtctggctc acgagaactc cactcgctca 1380
gagctcgctg ctaatctgcg caactccgca gctgtcggcc aactagactt cccattgaat 1440
atcgcggcta ccggctactc cgagcgcatc gctaaccgcg cactgacctg cggaatcgtg 1500
aaggaagatc cacaggactt cctctcccag ctgcagcttc tgtcctctaa cctatcttct 1560
tccttcttca ctgcttagtt tctcttgggc ttttccttga gcccacagcc gttgctgctc 1620
gacggtgtcc acaattccgg tggagccgtc gaacaggttc ggcgaacgag attgcatctt 1680
ggctacgaaa ctcgccgcca cgtcaaaaat gtcgaatcga ccctgacggg cggcgatttc 1740
tgcatgaaaa agcacctgca gcaaaacatc ccccagtgcg cttttcatgt gctcatcatc 1800
gccaccatga atcgcttcaa taaactcctg cgattcttct tccagatacg gaatcaaact 1860
ctcatgggtt tgcgtgcgtt cccactcgcc gcggcccacg gccgcccgca tgacgccgac 1920
ggcctcatgc aaagggttga ggggcgcgtc gataagcagc gtgctttgcg gttttgcggt 1980
gataaaccag gaggcgcttg tcgacgtctt gatcccccat ttttcaatat caaatggaaa 2040
atcgggatcg atagaaacag gttcaccc 2068
<210> 9
<211> 3060
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
caagtcacga tcgttggaac acaacaggtt tgcggcactc aatgctgcgt catcaatttg 60
gttggggtcc gctaccccat caccgtttgc atccaatccc ataagtcgcc acgtttccgg 120
aatgaactgc atgggaccta ccgcgcgatc atattcagta tcgccatcta attccccacc 180
atcagtgtcg ggaatttccg caaaccccgg tgaaccatca agtggaacgc cgatgattgg 240
aggggttgca actccatttt catccaggga actgcccccg aacattttgc cgttgtaggt 300
accgtgacgg gtttccacct ggccgatacc tgccaaggta ttccacccca gattgcagcc 360
aggccacgca gtactcgcga tgagctctgc gtttccataa gccgcaatcg cttgagcgga 420
cacaccagta tcttgagcaa ttggttccgc ccaaaaacgc aaatggttgg atgtgcgtcc 480
atctgcctct gtatcaattt gcggaacttc tacaccacgc gccggcggaa catcttcagg 540
gatttgctgg agttggcgaa taggtgccgt tccatccatg aagctgagcg cccatccaac 600
aaatgagatc accatgatga cggccaaaac cgaaccgcat ccaaatccca ttgcttttct 660
aacccctgaa ctcatggggg tcgatgttac cggctcgttt tagaactctc gcattggcta 720
gaaaaacctg attacttcac gcctctttaa gtaaaaaatc ctgtgtcttt ctaaccaaaa 780
gacccaaaaa gacacgctaa atcagcctcc tatgcaatta gtagagcatt cacatacacc 840
gtgccaagac ctgatttcca cgactgaaac ttcattaaat ccactggtag aagctttgat 900
gatctacatc acaaatttac aatgtgtggt gagttattca tattacccaa ggacttaaac 960
cttaaaagga gccctaaaaa tcctatcatg ccataccgcg aaaggttttg caccattcga 1020
tggtgtcaac gtaaatgccg cttcgccttc gcgcgcgaat tgcaagctga tccgggctta 1080
tcgactgcac ggtgcaccaa tgcttctggc gtcaggcagc catcggaagc tgtggtatgg 1140
ctgtgcaggt cgtaaatcac tgcataattc gtgtcgctca aggcgcactc ccgttctgga 1200
taatgttttt tgcgccgaca tcataacggt tctggcaaat attctgaaat gagctgttga 1260
caattaatca tcggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg 1320
aaacagaatt aattaagctt aaaggaggac aaccatggtg agcaagggcg aggagctgtt 1380
caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag 1440
cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg 1500
caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt 1560
gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat 1620
gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac 1680
ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat 1740
cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca 1800
caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg 1860
ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat 1920
cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag 1980
caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg 2040
gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaaaaggtt cgggggtaac cccaaaaatc 2100
acttaagtca caacagtcac ataaatcact tcagtaacgt atgattttgg actgttgtgg 2160
cttttgccat atttatttca tttccatctc agtgatctct taaggaaacc catgaagaaa 2220
ctacgtttcg ccaccatcgc tgccgctacc gttgccctga ctgcgagcct taccccctca 2280
gcttccgcac aggatttcaa ccaaatcatc gacaactttg attgcggcat ccttcagacc 2340
gctatctaca ccaccggcct ggctcacgag aactccactc gctcagagct cgccgctaat 2400
ctgcgcaact ccgcagctgt cggccaacta gacttcccat tgaatatcgc ggctaccggc 2460
tactccgagc gcatcgctaa ccgcgcactg acctgcggaa tcgtgaagga agatccacag 2520
gacttcctct cccagctgca gcttctgtcc tctaacctat cttcttcctt cttcactgct 2580
tagtttctct tgggcttttc cttgagccca cagccgctgc tgctcgtcgg tgtccacaat 2640
tccggtagag ccgtcgaaca ggtacggcga acgagattgc atcttggcta cgaaactcgc 2700
cgccacgtca aaaatgtcga atcgaccctg acgggcggcg atttctgcat gaaaaagcac 2760
ctgcagcaaa acatccccca gttcgctttt catgtgctca tcatcgccac catgaatcgc 2820
ttcaataaac tcctgcgatt cttcttccag atacggaatc aaactctcat gggtttgcgt 2880
gcgttcccac tcgccgcggc ccacggccgc ccgcatgacg ccgacggcct catgcaaagg 2940
gttgaggggc gcgtcgataa gcagcgtgct ttgcggtttt gcgatgataa accaggaggc 3000
gcttgtcgac gtcttgatcc cccatttttc aatatcaaat ggaaaatcgg gatcgataga 3060
<210> 10
<211> 606
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gtctttctaa ccaaaagacc caaaaagaca cgctaaatca gcctcctatg caattagtag 60
agcattcaca tacaccgtgc caagacctga tttccacgac tgaaacttca ttaaatccac 120
tggtagaagc tttgatgatc tacatcacaa atttacaatg tgtggtgagt tattcatatt 180
acccaaggac ttaaacctta aaaggagccc taaaaatcat gaagctttca caccgcatcg 240
cagcaatggc agcaaccgca ggcatcacag tggcagcatt cgcagcacct gcttccgcat 300
ccgagatact aaacctatcc tccaccaaca aagaactgtc ccctcagtac aactgggttg 360
cttgcggcat ccttgagggt ggcctcaaag cagctggcgt ccttgaagaa ggccagtaca 420
accgcgagct cgcagaagca atcgccgcaa agggtgaagg cttctggacc actcagttcc 480
cacaaatcgg tgattggaac gaagatcagg cagcagcact tgccgaccgc gcacaaacct 540
gtggcctagt taaggctgac acctaccttt ctgagctgtc ctccaacttc tcttcctaaa 600
aggttc 606
Claims (7)
1.一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体,其特征在于:
所述基因编辑载体包括Cas9表达元件、sgRNA表达元件、复制子元件和同源修复序列***位点;
所述cas9表达元件包括抗性基因、操纵子、启动子、SD序列、cas9序列和终止子,所述cas9序列如SEQ ID No.5所示,所述SD序列如SEQ ID No.6所示、并连接在cas9序列的始密码子ATG前;
所述sgRNA表达元件的包含启动子、sgRNA scaffold序列和终止子,所述sgRNAscaffold序列包括trancrRNA和crRNA***位点,所述crRNA***位点为AjuI酶切位点,所述sgRNA scaffold序列如SEQ ID No.7所示;
所述复制子元件包含谷氨酸棒状杆菌复制子repA;
所述同源修复序列***位点连接于所述sgRNA表达元件的终止子后。
2.根据权利要求1所述的一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体,其特征在于:所述cas9表达元件的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,其抗性基因为cat氯霉素抗性基因,操纵子为lacIq,启动子为Ptac,终止子为rrnB;
所述sgRNA表达元件的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,其启动子为Ptrc,终止子为T1T2;
所述复制子元件的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述复制子原件还包括大肠杆菌复制子oriE;
所述同源修复序列***位点包括AflII酶切位点、BstBI酶切位点、SnaBI酶切位点和SwaI酶切位点。
3.根据权利要求2所述的一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体,其特征在于:所述基因编辑载体的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
4.如权利要求3所述的一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体的制备方法,其特征在于:其包括以下步骤,
a、合成由SD序列和cas9序列连接形成的复合体序列,并在复合体序列的两端引入HindⅢ酶切识别序列、EcoRⅠ酶切识别序列;将带有酶切识别序列的复合体序列以及pXMJ19载体分别酶切、纯化后进行连接,得到所述cas9表达载体;以所述cas9表达载体为模板,PCR扩增包括cat氯霉素抗性基因,乳糖操纵子lacIq,启动子Ptac,SD序列,cas9序列及终止子rrnB的cas9表达元件;
b、合成sgRNA scaffold序列,并在sgRNA scaffold序列两端引入BamHⅠ酶切识别序列、NotⅠ酶切识别序列;将带有酶切识别序列的sgRNA scaffold序列以及pECXK-99载体分别酶切、纯化后进行连接,得到sgRNA表达载体;以所述sgRNA表达载体为模板,PCR扩增包含启动子Ptrc,sgRNA scaffold序列及终止子T1T2的sgRNA表达元件,并在T1T2终止子后引入AflII,BstBI,SnaBI及SwaI四个酶切位点;
c、合成复制子元件;
d、利用同源重组技术,同源重组连接cas9表达元件,sgRNA表达元件及复制子元件,构建形成所述基因编辑载体。
5.一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑***,其特征在于:其包括如权利要求1~3所述的基因编辑载体。
6.如权利要求1~3所述的一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体的应用,其特征在于:所述应用包括以下步骤,
a、将crRNA序列、同源修复序列分别***到基因编辑载体的crRNA***位点、同源修复序列***位点;
b、将构建好的带有crRNA序列及同源修复序列的基因编辑载体转化谷氨酸棒状杆菌;
c、培养、筛选,获得转化子;
其中,待编辑的目的基因具有5′-(N20)-NGG-3′结构,N为A、T、C或G,所述crRNA序列与目的基因5′-(N20)-NGG-3′结构中的N20序列相同,所述同源修复序列由目的基因上游序列、目的基因编辑后形成的序列、目的基因下游序列依次连接形成,所述目的基因上游序列、目的基因下游序列长度为300bp~1000bp。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:所述应用包括基因敲除和基因替换。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710576441.XA CN107384951A (zh) | 2017-07-14 | 2017-07-14 | 一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体、制备方法、***及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710576441.XA CN107384951A (zh) | 2017-07-14 | 2017-07-14 | 一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体、制备方法、***及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107384951A true CN107384951A (zh) | 2017-11-24 |
Family
ID=60339230
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710576441.XA Pending CN107384951A (zh) | 2017-07-14 | 2017-07-14 | 一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体、制备方法、***及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN107384951A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108085287A (zh) * | 2017-12-14 | 2018-05-29 | 江南大学 | 一种重组谷氨酸棒状杆菌、其制备方法及其应用 |
CN108486145A (zh) * | 2018-02-12 | 2018-09-04 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 基于CRISPR/Cas9的植物高效同源重组方法 |
CN110066829A (zh) * | 2019-04-30 | 2019-07-30 | 江南大学 | 一种CRISPR/Cas9基因编辑***及其应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103409446A (zh) * | 2013-05-31 | 2013-11-27 | 江南大学 | 一种棒状杆菌基因连续敲除***及其构建方法和应用 |
CN105238806A (zh) * | 2015-11-02 | 2016-01-13 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种用于微生物的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建及其应用 |
CN106480081A (zh) * | 2016-09-22 | 2017-03-08 | 苏州泓迅生物科技有限公司 | 一种单质粒***的CRISPRi载体及其制备方法 |
CN106701810A (zh) * | 2016-12-12 | 2017-05-24 | 江南大学 | 一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑***及其应用 |
-
2017
- 2017-07-14 CN CN201710576441.XA patent/CN107384951A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103409446A (zh) * | 2013-05-31 | 2013-11-27 | 江南大学 | 一种棒状杆菌基因连续敲除***及其构建方法和应用 |
CN105238806A (zh) * | 2015-11-02 | 2016-01-13 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种用于微生物的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建及其应用 |
CN106480081A (zh) * | 2016-09-22 | 2017-03-08 | 苏州泓迅生物科技有限公司 | 一种单质粒***的CRISPRi载体及其制备方法 |
CN106701810A (zh) * | 2016-12-12 | 2017-05-24 | 江南大学 | 一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑***及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
YAOJUN TONG等: "CRISPR-Cas9 Based Engineering of Actinomycetal Genomes", 《ACS SYNTHETIC BIOLOGY》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108085287A (zh) * | 2017-12-14 | 2018-05-29 | 江南大学 | 一种重组谷氨酸棒状杆菌、其制备方法及其应用 |
CN108085287B (zh) * | 2017-12-14 | 2021-08-24 | 江南大学 | 一种重组谷氨酸棒状杆菌、其制备方法及其应用 |
CN108486145A (zh) * | 2018-02-12 | 2018-09-04 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 基于CRISPR/Cas9的植物高效同源重组方法 |
CN110066829A (zh) * | 2019-04-30 | 2019-07-30 | 江南大学 | 一种CRISPR/Cas9基因编辑***及其应用 |
CN110066829B (zh) * | 2019-04-30 | 2023-04-28 | 江南大学 | 一种CRISPR/Cas9基因编辑***及其应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2021203937B2 (en) | Compositions and methods for rapid and dynamic flux control using synthetic metabolic valves | |
CN108486146B (zh) | LbCpf1-RR突变体用于CRISPR/Cpf1***在植物基因编辑中的应用 | |
KR102630763B1 (ko) | 동시 유전자 편집 및 반수체 유도 | |
US6709861B2 (en) | Cloning vectors and vector components | |
DK2931918T5 (en) | PROCEDURE FOR IDENTIFYING A CELL WITH INCREASED CONCENTRATION OF A PARTICULAR METABOLIT COMPARED TO THE SIMILAR WILD TYPE CELL ..... | |
CN107384951A (zh) | 一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体、制备方法、***及其应用 | |
CN102337284A (zh) | 一种用于DNA Marker制备的质粒及其构建方法与用途 | |
CN108085287B (zh) | 一种重组谷氨酸棒状杆菌、其制备方法及其应用 | |
CN110499274B (zh) | 一种基因工程红球菌及其构建方法与应用 | |
KR20230163460A (ko) | 식물에서의 증가된 형질전환성 및 반수체 유도 | |
KR102304834B1 (ko) | 숙신산 생산을 위한 개선된 미생물 | |
JP2023514422A (ja) | 一本鎖dnaポリヌクレオチドを生成するための方法および生成物 | |
CN110643628B (zh) | 水稻bZIP基因及其下游基因qLTG3-1在提高植物耐低温上的应用 | |
KR102170566B1 (ko) | 목적 유전자의 발현을 조기 종결하기 위한 벡터 및 이를 포함하는 균주 | |
Yadav et al. | A novel method of plasmid isolation using laundry detergent | |
CN110747186B (zh) | 在植物中高效生成不携带转基因元件的突变体的CRISPR/Cas9***和方法 | |
CN110669794B (zh) | 以突变的筛选剂抗性基因为报告体系的c·t碱基替换的细胞富集技术及其应用 | |
CN111850050B (zh) | 一种基因编辑工具及其制备方法与多轮基因编辑的方法 | |
KR102399035B1 (ko) | 산업 균주 내 온-타겟 효율의 감소 없이 오프-타겟이 없는 사이토신 염기 편집기를 발현하는 벡터 및 이의 용도 | |
CN110268064A (zh) | 同源染色体之间的靶向重组及其用途 | |
CN110724689B (zh) | Cas9介导的麻竹基因编辑载体和应用 | |
CN110835630B (zh) | 一种高效的sgRNA及其在基因编辑中的应用 | |
CN110878321B (zh) | 一种用于肺炎克雷伯菌基因编辑的表达载体 | |
CN113166771A (zh) | 基因治疗dna载体gdtt1.8nas12及用于获得它的方法 | |
KR102081699B1 (ko) | 스쿠알렌 생성능을 가지는 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20171124 |