CN107384951A - 一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体、制备方法、***及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体，其具有较高的基因编辑效率。该基因编辑载体包括Cas9表达元件、sgRNA表达元件、复制子元件和同源修复序列***位点；cas9表达元件包括抗性基因、操纵子、启动子、SD序列、cas9序列和终止子，cas9序列如SEQ ID No.5所示，SD序列如SEQ ID No.6所示；sgRNA表达元件的包含启动子、sgRNA scaffold序列和终止子，sgRNA scaffold序列包括trancrRNA和crRNA***位点，sgRNA scaffold序列如SEQ ID No.7所示；复制子元件包含谷氨酸棒状杆菌复制子repA。

Description

一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体、制备方法、***及其 应用

技术领域

本发明涉及基因编辑领域，具体涉及一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体、制备方法、***及其应用。

背景技术

对于工业微生物来说，从野生型出发菌株到高效的生产菌株需要经历代谢分析及优化，利用基因编辑技术对宿主进行遗传修饰及合理改造。基因编辑技术是指利用外源DNA通过重组方式对受体细胞基因组目标基因进行突变，从而产生目的突变株。基因编辑需要实现基因敲除，基因***及基因替换等基因组操作。

CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/Cas9***是细菌和古细菌应对外源DNA入侵的获得性免疫***，通过RNA介导，Cas9蛋白能够特异性的切割外源遗传物质，用以对抗入侵的病毒和质粒。随着近两年的发展，该技术已经发展成为一套精确的基因编辑***，通过CRISPR/Cas9 介导的打靶***可以试验快速高效的基因敲除、基因敲入、基因沉默。目前该技术已成功应用到动物细胞、大肠杆菌、拟南芥、酿酒酵母等物种中。

CRISPR/Cas9***发挥基因编辑的作用是建立在由trancrRNA与crRNA形成一个tracrRNA-crRNA 复合体，同时该复合体再与Cas9 蛋白结合，tracrRNA-crRNA-cas9复合体能够在crRNA 的引导下识别靶位点序列并结合到目的基因上；复合体对目的片段的切割是由crRNA 上长度为20 bp的向导序列(Guiding sequence)与目的DNA上的特定序列互补来引导Cas9 蛋白对目的基因的切割；除此之外，在所识别的目的DNA 上还必须有一个3′碱基(NGG)组成的PAM (protospacer adjacent motif)区域，识别区域紧跟PAM 的5′端。

谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium. glutamicum）是一种***，其DNA含有大约56%的GC。该菌在过去的50多年里被广泛用于氨基酸的生产，还被用于新型能源、食品工业、动物饲料和医药产品的生产C. glutamicum被普遍认为是安全无致病性，不产生内毒素的，因而是一种安全的医药蛋白表达宿主。

用于工业生产的谷氨酸棒状杆菌菌株主要通过传统诱变获得。随着代谢工程及基因工程技术的发展，通过基因工程手段定向改造谷氨酸棒状杆菌生产目的产物越来越受到重视，这就需要有很好的基因编辑工具来实现定向的基因改造。

目前，只有pKl8mobsacB/pKl9mobsacB等少数几个用于谷氨酸棒状杆菌基因编辑的载体，但上述载体因为要通过两次同源重组才能实现基因编辑而费时且效率低下。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体，其具有较高的基因编辑效率。

一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体，其特征在于：

所述基因编辑载体包括Cas9表达元件、sgRNA表达元件、复制子元件和同源修复序列***位点；

所述cas9表达元件包括抗性基因、操纵子、启动子、SD序列、cas9序列和终止子；所述cas9序列如SEQ ID No.5所示，所述SD序列如SEQ ID No.6所示、并连接在cas9序列的始密码子ATG前；

所述sgRNA表达元件的包含启动子、sgRNA scaffold序列和终止子，所述sgRNAscaffold序列包括trancrRNA和crRNA***位点，所述crRNA***位点为AjuI酶切位点，所述sgRNA scaffold序列如SEQ ID No.7所示；

所述复制子元件包含谷氨酸棒状杆菌复制子repA；

所述同源修复序列***位点连接于所述sgRNA表达元件的终止子后。

进一步的，所述cas9表达元件的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其抗性基因为cat氯霉素抗性基因，操纵子为lacIq，启动子为Ptac，终止子为rrnB；

所述sgRNA表达元件的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，其启动子为Ptrc，终止子为T1T2；

所述复制子元件的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述复制子原件还包括大肠杆菌复制子oriE；

所述同源修复序列***位点包括AflII酶切位点、BstBI酶切位点、SnaBI酶切位点和SwaI酶切位点。

进一步的，所述基因编辑载体的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供了上述基因编辑载体的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：

a、合成由SD序列和cas9序列连接形成的复合体序列，并在复合体序列的两端引入HindⅢ酶切识别序列、EcoRⅠ酶切识别序列；将带有酶切识别序列的复合体序列以及pXMJ19载体分别酶切、纯化后进行连接，得到所述cas9表达载体；以所述cas9表达载体为模板，PCR扩增包括cat氯霉素抗性基因，乳糖操纵子lacIq，启动子Ptac，SD序列，cas9序列及终止子rrnB的cas9表达元件；

b、合成sgRNA scaffold序列，并在sgRNA scaffold序列两端引入BamHⅠ酶切识别序列、NotⅠ酶切识别序列；将带有酶切识别序列的sgRNA scaffold序列以及pECXK-99载体分别酶切、纯化后进行连接，得到sgRNA表达载体；以所述sgRNA表达载体为模板，PCR扩增包含启动子Ptrc，sgRNA scaffold序列及终止子T1T2的sgRNA表达元件，并在T1T2终止子后引入AflII，BstBI，SnaBI及SwaI四个酶切位点；

c、以复制子序列为模板，扩增得到复制子元件；

d、利用同源重组技术，同源重组连接cas9表达元件，sgRNA表达元件及复制子元件，构建形成所述基因编辑载体。

本发明还提供了一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑***，其特征在于：其包括如权利要求1~3所述的基因编辑载体。

本发明还提供了上述基因编辑载体的应用，其特征在于：所述应用包括以下步骤，

a、将crRNA序列、同源修复序列分别***到基因编辑载体的crRNA***位点、同源修复序列***位点；

b、将构建好的带有crRNA序列及同源修复序列的基因编辑载体转化谷氨酸棒状杆菌；

c、培养、筛选，获得转化子；

其中，待编辑的目的基因具有5′-（N₂₀）-NGG-3′结构，N为A、T、C或G，所述crRNA序列与目的基因5′-（N₂₀）-NGG-3′结构中的N20序列相同，所述同源修复序列由目的基因上游序列、目的基因编辑后形成的序列、目的基因下游序列依次连接形成，所述目的基因上游序列、目的基因下游序列长度为300bp~1000bp。

进一步的，所述应用包括基因敲除和基因替换。

本发明构建的基因编辑***即利用CRISPR/Cas9技术，利用人工设计的sgRNA结合cas9蛋白对基因组靶点位置切割，形成双链断裂缺口；同时提供同源修复序列，以达到基因敲除，基因***和基因替换的目的；其中，SD序列的涉及使得cas9蛋白能够在谷氨酸棒杆菌中顺利表达。

实验证明，利用本发明构建的基因编辑***对谷氨酸棒状杆菌基因组进行编辑，具有周期短，节省成本效率高等优点；并且使用该***对谷氨酸棒状杆菌基因编辑效率能达到100%。

附图说明

图1为本发明的基因编辑载体的质粒图谱。

图2为同源修复序列设计方法示意图。

图3为porB基因敲除后的基因型验证结果，其中，泳道M：marker DL10,000；泳道ck：阴性对照野生型菌株基因型；泳道1-12：敲除菌株基因型验证结果。

图4为porB基因替换为GFP基因后的基因型验证结果，其中，泳道M：marker DL10,000；泳道ck：阴性对照野生型菌株基因型；泳道1-12：敲除菌株基因型验证结果。

图5为porB基因定点突变后的基因型验证结果，其中，泳道M：marker DL10,000；泳道ck：阴性对照野生型菌株基因型；泳道1-6：定点突变菌株基因型验证结果。

具体实施方式

下述实施例或应用例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例或应用例中所用的材料、试剂，基因合成等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例或应用例中所用大肠杆菌DH5α购买自TAKARA。

下述实施例或应用例中所用谷氨酸棒状杆菌C. glutamicumATCC13032购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。

下述实施例或应用例中所用载体骨架pXMJ19和pECXK-99均购自Addgene。

下述实施例或应用例中所用连接液solutionI购买自TaKaRa公司，货号 D6020A。

下述实施例或应用例中所用Gibson Assembly Master Mix溶液购买自NEB( NewEngland Biolabs)公司，货号E2611S。

下述实施例或应用例中大肠杆菌的培养使用LB培养基，培养基配方为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，去离子水1L。

下述实施例或应用例中谷氨酸棒状杆菌的培养使用LBB培养基，培养基配方为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，脑心浸液10g、去离子水1L。

下述实施例或应用例中谷氨酸棒状杆菌的转化子培养使用LBHIS培养基，培养基配方为：胰蛋白胨 5g、酵母提取物 2.5g、NaCl 5g、脑心浸液 18。5g、山梨醇 91g、去离子水1L。

实施例1：一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑***

1、一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，其质粒图谱如图1所示，

基因编辑载体包括Cas9表达元件、sgRNA表达元件、复制子元件和同源修复序列***位点；

cas9表达元件包括cat氯霉素抗性基因、乳糖操纵子lacIq、启动子Ptac、SD序列、cas9序列和终止子rrnB，SD序列连接在cas9序列的始密码子ATG前；

sgRNA表达元件的包含启动子Ptrc、sgRNA scaffold序列和终止子T1T2，sgRNAscaffold序列包括trancrRNA和crRNA***位点，crRNA***位点为AjuI酶切位点；

复制子元件包含谷氨酸棒状杆菌复制子repA和大肠杆菌复制子oriE；

同源修复序列***位点包括AflII酶切位点、BstBI酶切位点、SnaBI酶切位点和SwaI酶切位点，连接于sgRNA表达元件的终止子后。

其中，cas9表达元件、sgRNA表达元件、复制子元件、基因编辑载体、cas9序列、SD序列、sgRNA scaffold 序列分别如SEQ ID No.1~ SEQ ID No.7所示。

2、一种谷氨酸基因编辑***，其包括上述基因编辑载体、谷氨酸棒杆菌、crRNA和同源修复序列。

3、上述基因编辑载体的构建

Cas9表达元件，其制备过程如下：

a、合成由SD序列和cas9序列连接形成的复合体序列，并在复合体序列的两端引入HindIII和EcoRI酶切识别序列；

b、将带有酶切识别序列的复合体序列以及pXMJ19载体分别酶切、纯化后进行连接，得到cas9表达载体；

c、以cas9表达载体为模板PCR扩增包含有lacIq乳糖操纵子，Ptac启动子，SD序列，cas9基因，rrnB终止子及氯霉素抗性基因cat的序列，即为cas9表达元件。

酶切、纯化连接体系如下：20μL反应体系中含有限制性内切酶HindIII和EcoRI各1μL，含有待酶切的复合体及pXMJ19载体0.8ng，37℃反应30min；0.7%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，胶回收试剂盒纯化，即得到酶切纯化后的复合体序列以及pXMJ19载体片段；纯化后的复合体序列和pXMJ19载体片段摩尔比3:1，连接液Solution I 5μL，无菌水补齐到10μL ，16℃反应1h，热击转化E.coliDH5α感受态细胞；均匀涂布于含有30μg/mL氯霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h；挑选阳性克隆子，提取质粒即为cas9表达载体。

PCR扩增体系如下：100μL反应体系中含有模板（cas9表达载体质粒）2μL，Taq酶2μL，dNTP 8μL, Tap buffer 10μL，ddH₂O 74μL，正向引物AATGCTTAATCAGTGAGGCGGAAGGGCACCAATAACTG 2μL，反向引物ATCAATTCGCTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAAAG 2μL；反应条件为98℃ 30s；98℃ 10s， 60℃10s，72℃ 3min 共35个循环；72℃ 5min；4℃保存；PCR产物0.7%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，胶回收试剂盒纯化，即得到纯化后的cas9表达元件。

sgRNA表达元件，其制备过程如下：

a、合成sgRNA scaffold序列，并在sgRNA scaffold序列两端引入BamHⅠ和NotⅠ酶切识别序列，sgRNA scaffold 序列如SEQ ID No.7所示；

b、将带有酶切识别序列的sgRNA序列以及pECXK-99载体分别酶切、纯化后进行连接，得到sgRNA表达载体；Pcr扩增Ptrc启动子，sgRNA scaffold及T1T2终止子序列，即为sgRNA表达元件；

酶切纯化连接体系如下：20μL反应体系中含有限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ各1μL，含有待酶切的sgRNA片段及pECXK-99载体0.8ng，37℃反应30min；0.7%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，胶回收试剂盒纯化，即得到酶切纯化后的sgRNA片段及pECXK-99载体片段；纯化后的sgRNA片段和pECXK-99载体片段摩尔比3:1，连接液Solution I 5μL，无菌水补齐到10μL ，16℃反应1h，热击转化E.coliDH5α感受态细胞；均匀涂布于含有30μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h；挑选阳性克隆子，提取质粒即为sgRNA表达载体。

PCR扩增体系如下：100μL反应体系中含有模板（sgRNA表达载体质粒）2μL，Taq酶2μL，dNTP 8μL, Tap buffer 10μL，ddH₂O 74μL，正向引物AATACATTCAGCGAATTGATCTGGTTTG 2μL，反向引物CAAAGCATCAGACGTAGACCCTTAAGTACGTATTCGAAATTTAAATAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAG 2μL；反应条件为98℃ 30s；98℃ 10s，60℃ 10s， 72℃ 30s共35个循环；72℃ 5min；4℃保存；PCR产物0.7%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，胶回收试剂盒纯化，即得到纯化后的sgRNA表达元件。

复制子元件，其制备过程如下：

合成复制子序列，复制子序列如SEQ ID No.3所示。以复制子序列质粒为模板,正向引物ATTTAAATTTCGAATACGTACTTAAGGGTCTACGTCTGATGCTTTG， 反向引物PCRCGCCTCACTGATTAAGCATTG，PCR扩增得到包含有大肠杆菌复制子oriE及谷氨酸棒状杆菌复制子repA的复制子元件。

扩增体系如下：100μL反应体系中含有模板2μL，Taq酶2μL，dNTP 8μL, Tap buffer10μL，ddH₂O 74μL，正向引物2μL，反向引物2μL。反应条件为98℃ 30s;98℃ 10s, 60℃10s, 72℃ 1min 共35个循环；72℃ 5min；4℃保存。PCR产物0.7%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，胶回收试剂盒纯化，即得到纯化后的复制子元件。

同源重组构建CRISPR/Cas9基因编辑载体，制备过程如下：

利用同源重组技术，连接cas9表达元件，sgRNA表达元件及复制子元件，并在sgRNA表达元件和复制子元件中引入AflII，BstBI，SnaBI及SwaI四个酶切。

纯化后的cas9表达元件，sgRNA表达元件及复制子元件片段摩尔比1:1:1， GibsonAssembly Master Mix溶液 10μL，无菌水补齐到20μL ，50℃反应1h；热击转化E.coliDH5α感受态细胞；均匀涂布于含有30μg/mL氯霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h；挑选阳性克隆子，提取质粒即为CRISPR/Cas9基因编辑载体。

基因编辑操作中需要***crRNA序列及同源修复序列。

其中，目的基因的原序列中具有5′-（N₂₀）-NGG-3′结构；crRNA序列同靶点N20序列，设计两条引物：正向引物5’端需加上 GATCC序列，反向引物5’端需加上CAAAA序列；两条引物利用寡核苷酸退火成双链结构，连接到AjuI酶切过的CRISPR/Cas9基因编辑载体中。

CRISPR/Cas9基因编辑载体中间设计的有AflII，BstBI，SnaBI及SwaI四个酶切为***同源修复序列的位点。

根据目的不同设计不同的同源修复序列，设计方法依据图2所示，

若实现目的基因的敲除，构建由目的基因上游序列和目的基因下游序列融合连接形成的同源修复序列，目的基因上、下游序列长度为300bp~1500bp，并在同源修复序列两端引入酶切位点两端识别序列，利用同源重组技术将同源修复序列及酶切纯化后的CRISPR/Cas9载体连接，得到最终CRISPR/Cas9基因编辑载体，转化E.coliDH5α。

构建体系如下（以SnaBI位点***同源修复序列为例）：根据目的基因基因组序列设计引物，分别扩增目的基因上游序列和目的基因下游序列，扩增片段长度为300bp~1500bp，并在两端引物上引入SnaBI酶切识别序列；20μL反应体系中含有限制性内切酶SnaBI1μL，含有待酶切的CRISPR/Cas9基因编辑载体0.8ng，37℃反应30min；0.7%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，胶回收试剂盒纯化，即得到酶切纯化后CRISPR/Cas9基因编辑载体载体片段；纯化后的目的基因上游序列、目的基因下游序列和CRISPR/Cas9基因编辑载体片段摩尔比3:3:1， Gibson Assembly Master Mix溶液 10μL，无菌水补齐到20μL ，50℃反应1h；热击转化E.coliDH5α感受态细胞；均匀涂布于含有30μg/mL氯霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h；挑选阳性克隆子，提取质粒即为最终CRISPR/Cas9基因编辑载体。

若实现目的基因的替换，构建目的基因上游、目的基因编辑后形成的序列和目的基因下游序列连接形成的同源修复序列，目的基因上、下游序列长度为300bp~1500bp，并在同源修复序列两端引入载体SnaBI酶切位点两端的同源序列，其中，目的基因的原序列中具有5′-（N₂₀）-NGG-3′结构；将同源修复序列以及CRISPR/Cas9基因编辑载体利用GibsonAssembly Master Mix溶液进行组装，得到最终CRISPR/Cas9基因编辑载体，转化E.coliDH5α。

构建体系如下：根据目的基因基因组序列设计引物，分别扩增目的基因上游片段、目的基因编辑后形成的序列、目的基因下游片段，目的基因上、下游片段长度为300bp~1500bp，每两个片段中间设计同源位点，可以通过Gibson Assembly Master Mix溶液进行组装，其中组装后片段两端要包含CRISPR/Cas9载体SnaBI酶切位点两端的同源序列，以便于将片段组装到载体CRISPR/Cas9上；20μL反应体系中含有限制性内切酶SnaBI1μL，含有待酶切的CRISPR/Cas9载体0.8ng，37℃反应30min；0.7%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，胶回收试剂盒纯化，即得到酶切纯化后CRISPR/Cas9载体片段；纯化后的CRISPR/Cas9载体片段、目的基因上游片段、目的基因编辑后形成序列、目的基因下游片段摩尔比1:3:3:3， GibsonAssembly Master Mix溶液 10μL，无菌水补齐到20μL ，50℃反应1h；热击转化E.coliDH5α感受态细胞；均匀涂布于含有30μg/mL氯霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h；挑选阳性克隆子，提取质粒即为最终CRISPR/Cas9载体。

2、基因编辑

a、将crRNA序列、同源修复序列分别***到基因编辑载体的crRNA***位点、同源修复序列***位点；

b、将构建好的带有crRNA序列及同源修复序列的基因编辑载体转化谷氨酸棒状杆菌；

c、培养、筛选，获得转化子。

基因编辑具体包括基因敲除和基因替换，如图２所示，其中B为待编辑的目的基因，A、C为待编辑的目的基因两端的同源片段，D为替换后的基因。

应用例1：porb基因的敲除

一种谷氨酸棒状杆菌的porB基因敲除***，包括敲除载体的构建及其应用。

根据谷氨酸棒状杆菌基因组序列（NCBI Reference Sequence: NC_003450.3），针对porb基因寻找5′-（N₂₀）-NGG-3′结构，porB基因正义链的靶点序列、以及针对靶点序列设计的sgRNA N20序列分别如下所示：

靶点序列为：

GGAGGATAGGTTTGCGAAGTCGG；

sgRNA N20序列为：

GGAGGATAGGTTTGCGAAGT；

设计引物正向引物F：5’ GGAGGATAGGTTTGCGAAGTGTTTT3’；

反向引物R：5’ACTTCGCAAACCTATCCTCCGGATC 3’。

寡核苷酸退后成双链后，用连接酶连接到AjuI酶切纯化后的CRISPR/Cas9敲除载体中。

sgRNA序列为：

GGAGGATAGGTTTGCGAAGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT；

b、制备带有酶切识别序列的同源修复序列

根据porB基因序列设计带有酶切识别序列的同源修复序列porB LR，同源修复序列porB LR由porB基因的上游同源片段porB-L、下游同源片段porB-R依次连接组成，其中porB-L、porB-R分别引入SnaBI酶切识别序列。

上游同源片段porB-L的引物为：

porbB L-F: 5’TCTATTTAAATTTCGAATACGGAGTGGACAAGTCACGAT 3’；

porB L-R: 5’TTGGAGGACATGCCACTGTGATGCCTGCGGTTGCT 3’。

下游同源片段porB-R的引物为：

porB R-F: 5’ CACAGTGGCATGTCCTCCAACTTCTCTTCCTAAAA 3’ ；

porB R-R: 5’AGACGTAGACCCTTAAGTACGGGTGAACCTGTTTCTATC 3’。

分别扩增porB-L和porB-R，然后采用同源重组的方法，连接porB-L，porB-R以及SnaBI酶切纯化后的CRISPR/Cas9敲除载体，构建成porB基因敲除载体。

融合形成porB LR，porB LR长度为2068bp，融合后序列如SEQ ID No.8所示。

3、porB基因的敲除具体操作流程：

a、将porB基因敲除载体质粒从E.coli中提出，取1μg DNA转化谷氨酸棒状杆菌感受态，电击转化条件为1800v，50ms，恢复培养后涂布于含有氯霉素的LBHIS固体培养基，30℃培养36h。

b、挑取平板上的单菌落，利用cas9基因引物；

cas9-F:5’ACAACTAATGGATAAAAAGTATTC 3’；

cas9-R:5’ TATGAATTCTTAGTCGCCACCCA 3’。

验证cas9表达载体是否正确转入；

c、挑选正确的转化子，接种于LBB液体培养基中30℃培养12h，将培养物划线与含有氯霉素以及IPTG的固体培养基中，30℃培养24h。

d、挑取平板上的单菌落用同源片段引物porB L-F 和porB R-R PCR验证获得目的菌株，同时把扩增出来的片段进行测序验证，最终根据基因型及测序结果挑选正确的菌株及porB基因敲除菌株，基因型验证结果如图3所示。

实验证明，利用本发明构建的CRISPR/Cas9基因编辑***对谷氨酸棒状杆菌基因组进行编辑，具有周期短，节省成本效率高等优点，使用该***对谷氨酸棒状杆菌基因编辑效率能达到83.4%。

质粒的除去，把挑选出的敲除菌株在不加抗生素的培养基中30℃培养过夜，37℃继续培养8小时后，划线不含抗生素的LBB固体培养基上，载体即可除去；利用cas9引物和抗生素验证载体的消除。

应用例2 ：GFP基因替换porB基因

载体的构建

一种谷氨酸棒状杆菌的在porB基因替换***，包括porB基因替换为GFP基因的CRISPR/Cas9载体的构建及其应用。

根据谷氨酸棒状杆菌基因组序列（NCBI Reference Sequence: NC_003450.3），针对porb基因寻找5′-（N₂₀）-NGG-3′结构，porb基因正义链的靶点序列、以及针对靶点序列设计sgRNA N20序列分别如下所示：

靶点序列为：

GGAGGATAGGTTTGCGAAGTCGG

sgRNA N20序列为：

GGAGGATAGGTTTGCGAAGT；

设计引物正向引物F：5’ GGAGGATAGGTTTGCGAAGTGTTTT3’；

反向引物R：5’ACTTCGCAAACCTATCCTCCGGATC 3’。

寡核苷酸退后成双链后，用连接酶连接到AjuI酶切纯化后的CRISPR/Cas9敲除载体中。

sgRNA序列为：

GGAGGATAGGTTTGCGAAGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT；

b、制备带有酶切识别序列的同源修复序列

根据porB基因序列设计带有酶切识别序列的同源修复序列porB LGR，同源修复序列porB LGR由porB基因的上游同源片段porB-L、GFP基因，下游同源片段porB-R依次连接组成，其中porB-L、porB-R分别引入SnaBI识别序列。

上游同源片段porB-L的引物为：

porBILF：5’TCTATTTAAATTTCGAATACCAAGTCACGATCGTTGGAAC 3’；

porBILR：5’ GGCATGATAGGATTTTTAGGGCTCCTTTTAAGG 3’。

GFP基因的引物为：

GFPF:5’ CCTAAAAATCCTATCATGCCATACCGCG 3’；

GFPR:5’CCCGAACCTTTTACTTGTACAGCTCGTC3’。

下游同源片段porB-R的引物为：

PorBIRF: 5’GTACAAGTAAAAGGTTCGGGGGTAACCC3’；

PorBIRR: 5’AGACGTAGACCCTTAAGTACTCTATCGATCCCGATTTTCCATTTG3’。

分别扩增porB-L，GFP和porB-R，然后采用通过同源重组的方法，连接porB-L，GFP，porB-R以及SnaBI酶切纯化后的CRISPR/Cas9敲除载体，构建成porB基因替换载体。

porB LGR长度为3068bp，融合后序列如SEQ ID No.9所示。

3、porB基因的敲除具体操作流程：

a、将porB基因替换载体质粒从E.coli中提出，取1μg DNA共转化谷氨酸棒状杆菌感受态，电击转化条件为1800v，50ms，恢复培养后涂布于含有氯霉素的LBHIS固体培养基，30℃培养36h；

b、挑取平板上的单菌落，利用cas9基因引物；

cas9-F:5’ACAACTAATGGATAAAAAGTATTC 3’；

cas9-R:5’ TATGAATTCTTAGTCGCCACCCA 3’；

验证cas9表达载体是否正确转入；

c、挑选正确的转化子，接种于LBB液体培养基中30℃培养12h，将培养物划线与含有氯霉素以及IPTG的固体培养基中，30℃培养24h；

d、挑取平板上的单菌落用同源片段引物porB L-F 和porB R-R PCR验证获得目的菌株，同时把扩增出来的片段进行测序验证，最终根据基因型及测序结果挑选正确的菌株及porB基因敲除菌株，基因型验证结果如图4所示。

实验证明，利用本发明构建的CRISPR/Cas9基因编辑***对谷氨酸棒状杆菌基因进行替换，具有周期短，节省成本效率高等优点，使用该***对谷氨酸棒状杆菌基因替换效率能达到66.7%。

质粒的除去，把挑选出的敲除菌株在不加抗生素的培养基中30℃培养过夜，37℃继续培养8小时后，划线不含抗生素的LBB固体培养基上，载体即可除去；利用cas9引物和抗生素验证载体的消除。

应用例3 ：porB基因定点突变

载体的构建

一种谷氨酸棒状杆菌porB基因定点突变，包括porB基因定点突变的CRISPR/Cas9载体的构建及其应用。

根据谷氨酸棒状杆菌基因组序列（NCBI Reference Sequence: NC_003450.3），针对porb基因寻找5′-（N₂₀）-NGG-3′结构，porb基因正义链的靶点序列、以及针对靶点序列设计sgRNA N20序列分别如下所示：

靶点序列为：

GGAGGATAGGTTTGCGAAGTCGG

sgRNA N20序列为：

GGAGGATAGGTTTGCGAAGT；

设计引物正向引物F：5’GGAGGATAGGTTTGCGAAGTGTTTT3’；

反向引物R：5’ACTTCGCAAACCTATCCTCCGGATC3’。

寡核苷酸退后成双链后，用连接酶连接到AjuI酶切纯化后的CRISPR/Cas9敲除载体中。

sgRNA序列为：

GGAGGATAGGTTTGCGAAGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT；

b、制备带有酶切识别序列的同源修复序列

根据porB基因序列设计带有酶切识别序列的同源修复序列porBMLR，同源修复序列porBMLR由porB基因的上游同源片段porB-L和下游同源片段porB-R依次连接组成，其中porB-L、porB-R分别引入SnaBI识别序列。

上游同源片段porB-L的引物为：

porBMLF：5’TCTATTTAAATTTCGAATACGTCTTTCTAACCAAAAGACC 3’；

porBMLR：5’ GGTTTAGTATCTCGGATG 3’。

下游同源片段porB-R的引物为：

PorBMRF: 5’ATCCGAGATACTAAACCTATC3’；

PorBMRR: 5’AGACGTAGACCCTTAAGTACGAACCTTTTAGGAAGAGAAG3’。

分别扩增porB-L和porB-R，然后采用通过同源重组的方法，连接porB-L，porB-R以及SnaBI酶切纯化后的CRISPR/Cas9敲除载体，构建成porB基因定点突变载体。

porBMLR长度为606bp，融合后序列如SEQ ID No.10所示。

3、porB基因的定点具体操作流程：

a、将porB基因定点载体质粒从E.coli中提出，取1μg DNA转化谷氨酸棒状杆菌感受态，电击转化条件为1800v，50ms，恢复培养后涂布于含有氯霉素的LBHIS固体培养基，30℃培养36h。

b、挑取平板上的单菌落，利用cas9基因引物；

cas9-F:5’ACAACTAATGGATAAAAAGTATTC 3’；

cas9-R:5’ TATGAATTCTTAGTCGCCACCCA 3’；

验证cas9表达载体是否正确转入；

c、挑选正确的转化子，接种于LBB液体培养基中30℃培养12h，将培养物划线与含有氯霉素以及IPTG的固体培养基中，30℃培养24h。

d、挑取平板上的单菌落用同源片段引物porBMLF 和porBMRR PCR验证获得目的菌株，同时把扩增出来的片段进行测序验证，最终根据基因型及测序结果挑选正确的菌株及porB基因敲除菌株，基因型验证结果如图5所示。

实验证明，利用本发明构建的CRISPR/Cas9基因编辑***对谷氨酸棒状杆菌基因定点突变，具有周期短，节省成本效率高等优点，使用该***对谷氨酸棒状杆菌基因定点突变效率能达到100%。

质粒的除去，把挑选出的敲除菌株在不加抗生素的培养基中37℃培养过夜，，划线不含抗生素的LBB固体培养基上，载体即可除去；利用cas9引物和抗生素验证载体的消除。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体、制备方法、***及其应用

<130> 2017

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 6816

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaagggcacc aataactgcc ttaaaaaaat tacgccccgc cctgccactc atcgcagtac 60

tgttgtaatt cattaagcat tctgccgaca tggaagccat cacagacggc atgatgaacc 120

tgaatcgcca gcggcatcag caccttgtcg ccttgcgtat aatatttgcc catggtgaaa 180

acgggggcga agaagttgtc catattggcc acgtttaaat caaaactggt gaaactcacc 240

cagggattgg ctgagacgaa aaacatattc tcaataaacc ctttagggaa ataggccagg 300

ttttcaccgt aacacgccac atcttgcgaa tatatgtgta gaaactgccg gaaatcgtcg 360

tggtattcac tccagagcga tgaaaacgtt tcagtttgct catggaaaac ggtgtaacaa 420

gggtgaacac tatcccatat caccagctca ccgtctttca ttgccatacg gaactccgga 480

tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt gtgcttattt 540

ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt ataggtacat 600

tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga tatatcaacg 660

gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga aaatctcgtc 720

gaagctcggc ggatttgtcc tactcaagct gatccgacaa aatccacaca ttatcccagg 780

tgtccggatc ggtcaaatac gctgccagct catagaccgt atccaaagca tccggggctg 840

atccccggcg ccagggtggt ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag ctgattgccc 900

ttcaccgcct ggccctgaga gagttgcagc aagcggtcca cgtggtttgc cccagcaggc 960

gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct tcggtatcgt 1020

cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta atggcgcgca 1080

ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg atgccctcat 1140

tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct tcccgttccg 1200

ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga cgcagacgcg 1260

ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc aatgcgacca 1320

gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg ttgatgggtg 1380

tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct tccacagcaa 1440

tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt tgcgcgagaa 1500

gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc gacaccacca 1560

cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt 1620

gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt 1680

gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg 1740

ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac 1800

cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac 1860

tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcaccattcg atggtgtcaa 1920

cgtaaatgcc gcttcgcctt cgcgcgcgaa ttgcaagctg atccgggctt atcgactgca 1980

cggtgcacca atgcttctgg cgtcaggcag ccatcggaag ctgtggtatg gctgtgcagg 2040

tcgtaaatca ctgcataatt cgtgtcgctc aaggcgcact cccgttctgg ataatgtttt 2100

ttgcgccgac atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa tgagctgttg acaattaatc 2160

atcggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagaat 2220

taattaagct taaaggagga caactaatgg ataaaaagta ttccattggc ctggacatcg 2280

gcaccaattc tgtgggttgg gcagtcatca ccgacgaata caaggtccca tccaagaagt 2340

tcaaggtgct cggtaatacc gatcgccact ctatcaagaa aaacctgatc ggcgccctgc 2400

tcttcgactc cggcgaaacc gcagaagcaa cccgtctcaa gcgtaccgca cgtcgccgct 2460

acacccgccg taagaatcgc atctgctacc tccaggaaat cttctctaat gagatggcaa 2520

aggtggatga ctcctttttc caccgcctcg aagagtcctt cctggtggaa gaggacaaga 2580

aacacgagcg ccatcctatc ttcggcaata ttgtcgatga agtcgcatat catgaaaaat 2640

acccaaccat ttaccatctc cgtaaaaaac tcgtcgattc caccgataag gcagatctcc 2700

gcctgatcta tctggcactg gcccacatga tcaagtttcg tggccacttc ctgatcgaag 2760

gtgacctcaa tccagacaat tccgacgtgg acaagctgtt catccagctg gtgcaaacct 2820

acaaccagct ctttgaggaa aacccaatca acgcatctgg cgtcgacgca aaagccatcc 2880

tgtccgcccg tctctccaag tctcgtcgcc tcgaaaacct cattgcccag ctccctggcg 2940

agaagaaaaa cggtctgttc ggcaatctga tcgccctgtc tctgggtctg accccaaatt 3000

tcaaatccaa ctttgatctc gcagaagatg ccaagctgca gctctctaag gacacctacg 3060

atgatgacct ggataacctc ctcgcccaga tcggcgacca gtacgccgat ctcttcctcg 3120

cagccaagaa cctctctgac gcaattctgc tgtccgacat cctgcgcgtg aacaccgaaa 3180

tcactaaggc accactctct gcctccatga ttaagcgcta cgacgagcat catcaggatc 3240

tcactctcct caaagccctg gtccgccagc agctcccaga gaagtacaag gaaatctttt 3300

tcgaccaatc caaaaacggc tacgcaggtt acatcgatgg cggcgcctct caggaagagt 3360

tttacaaatt cattaagcca atcctcgaaa agatggacgg caccgaggaa ctgctggtga 3420

aactcaaccg tgaagatctc ctgcgcaaac agcgcacctt cgacaacggt tccattcctc 3480

accagatcca cctgggcgaa ctgcacgcaa tcctccgccg tcaagaggac ttctacccat 3540

tcctgaagga caaccgtgaa aagatcgaaa agattctcac cttccgcatc ccttactacg 3600

tgggtcctct cgcccgtggc aattcccgct tcgcctggat gactcgcaaa tctgaagaga 3660

ccatcacccc ttggaacttt gaggaagtcg tcgataaagg cgcctctgcc caatccttca 3720

tcgagcgcat gaccaacttc gacaagaacc tcccaaacga gaaagtgctg cctaagcatt 3780

ccctcctgta cgagtacttt actgtctaca atgagctgac taaggtgaag tatgtcactg 3840

aaggcatgcg taagccagcc tttctctccg gcgagcagaa aaaggcaatc gtcgacctcc 3900

tgtttaaaac caaccgcaaa gtgactgtga aacagctcaa ggaagattac tttaaaaaaa 3960

tcgaatgctt cgattctgtg gaaatctccg gcgtggagga tcgtttcaac gcctccctgg 4020

gtacctatca cgacctcctg aagattatca aggacaaaga ttttctggat aacgaggaaa 4080

acgaggacat tctcgaggac attgtgctga ccctgaccct cttcgaggac cgcgagatga 4140

tcgaggagcg cctgaagacc tatgcccacc tctttgacga caaggtcatg aagcaactca 4200

agcgccgccg ctataccggt tggggccgtc tctcccgtaa gctcatcaat ggtatccgcg 4260

acaagcaatc cggcaagact atcctggact ttctgaagtc tgacggcttc gccaaccgca 4320

attttatgca actgatccac gacgattccc tgaccttcaa agaggacatc cagaaagccc 4380

aagtgtccgg tcaaggcgac tccctgcacg aacacatcgc caatctggca ggttccccag 4440

caatcaagaa gggcatcctg cagaccgtca aggtggtgga cgaactcgtc aaagtgatgg 4500

gtcgccacaa accagaaaac atcgtcatcg agatggcccg tgagaaccag accacccaga 4560

aaggccagaa aaactcccgt gagcgcatga agcgcattga agaaggcatt aaagagctcg 4620

gctctcagat cctgaaagag catcctgtcg agaacaccca actgcagaat gagaagctgt 4680

atctgtatta tctccagaac ggccgcgaca tgtacgtcga ccaggaactg gacatcaacc 4740

gtctctctga ttacgatgtg gaccatatcg tccctcagtc tttcctgaaa gacgactcta 4800

ttgacaacaa agtcctcacc cgctccgaca agaaccgcgg caagtccgat aacgtgccat 4860

ccgaggaggt cgtgaagaag atgaagaact actggcgcca gctgctcaac gccaagctga 4920

tcactcagcg caagttcgat aacctgacca aggccgaacg tggtggtctc tccgagctcg 4980

acaaggcagg ctttatcaag cgccaactcg tggagactcg ccaaatcact aaacacgtcg 5040

cccagatcct cgactcccgc atgaatacca agtacgatga aaatgacaag ctcatccgcg 5100

aagtgaaagt cattaccctg aagtccaaac tggtctctga ctttcgcaag gatttccagt 5160

tctacaaggt ccgcgagatt aataactatc atcatgcaca cgatgcatac ctcaacgcag 5220

tcgtgggtac cgcactgatc aagaagtacc ctaaactgga gtccgagttc gtctatggcg 5280

actacaaggt gtacgacgtc cgcaaaatga ttgccaagtc cgagcaggag atcggcaaag 5340

caactgccaa atatttcttt tactccaaca tcatgaactt cttcaagacc gaaatcaccc 5400

tcgccaacgg tgaaatccgc aaacgtccac tcatcgagac taatggtgaa accggcgaga 5460

tcgtctggga caagggccgt gacttcgcaa ccgtccgcaa ggtcctctcc atgccacagg 5520

tcaacatcgt gaaaaagacc gaggtgcaaa ccggcggctt ctccaaggag tctatcctgc 5580

ctaaacgcaa ttccgataag ctcattgcac gcaaaaagga ctgggaccct aaaaaatacg 5640

gcggtttcga ctccccaact gtcgcatatt ctgtgctcgt ggtcgccaaa gtggaaaagg 5700

gcaaatccaa aaagctcaag tccgtcaagg aactcctggg tatcaccatc atggaacgct 5760

cctcctttga gaagaaccct atcgatttcc tcgaagcaaa aggttacaag gaggtgaaga 5820

aagatctgat catcaagctc cctaaatact ccctcttcga gctcgagaac ggccgcaagc 5880

gtatgctggc ctccgcaggt gaactgcaaa aaggtaacga gctggcactc ccatccaagt 5940

atgtcaactt tctctacctg gcctcccact acgaaaagct gaaaggttcc ccagaagaca 6000

acgagcagaa acagctgttc gtggagcagc acaagcacta cctggacgaa atcatcgagc 6060

agatctccga gttctctaaa cgcgtcattc tggccgatgc caacctcgat aaagtgctct 6120

ccgcctacaa taagcatcgt gataagccaa tccgtgagca ggcagagaac atcattcacc 6180

tgttcactct caccaacctg ggtgcaccag ccgcctttaa gtacttcgac accaccatcg 6240

accgcaagcg ctatacctcc actaaggagg tgctcgatgc aaccctgatc caccagtcta 6300

tcaccggcct ctacgagact cgcatcgatc tctcccagct gggtggcgac taagaattca 6360

gcttggctgt tttggcggat gagagaagat tttcagcctg atacagatta aatcagaacg 6420

cagaagcggt ctgataaaac agaatttgcc tggcggcagt agcgcggtgg tcccacctga 6480

ccccatgccg aactcagaag tgaaacgccg tagcgccgat ggtagtgtgg ggtctcccca 6540

tgcgagagta gggaactgcc aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg 6600

cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca aatccgccgg 6660

gagcggattt gaacgttgcg aagcaacggc ccggagggtg gcgggcagga cgcccgccat 6720

aaactgccag gcatcaaatt aagcagaagg ccatcctgac ggatggcctt tttgcgtttc 6780

tacaaactct tttgtttatt tttctaaata cattca 6816

<210> 2

<211> 869

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcgaattgat ctggtttgac agcttatcat cgactgcacg gtgcaccaat gcttctggcg 60

tcaggcagcc atcggaagct gtggtatggc tgtgcaggtc gtaaatcact gcataattcg 120

tgtcgctcaa ggcgcactcc cgttctggat aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt 180

ctggcaaata ttctgaaatg agctgttgac aattaatcat ccggctcgta taatgtgtgg 240

aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagacca tgggatccta caatggaaat 300

acagattggg gatgagtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta 360

tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg cttttttgcg gccgcgcatg caagcttggc 420

tgttttggcg gatgagagaa gattttcagc ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc 480

ggtctgataa aacagaattt gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg 540

ccgaactcag aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga 600

gtagggaact gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg 660

ttttatctgt tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga 720

tttgaacgtt gcgaagcaac ggcccggagg gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc 780

caggcatcaa attaagcaga aggccatcct gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac 840

tctatttaaa tttcgaatac gtacttaag 869

<210> 3

<211> 3600

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggtctacgtc tgatgctttg aatcggacgg acttgccgat cttgtatgcg gtgatttttc 60

cctcgtttgc ccacttttta atggtggccg gggtgagagc tacgcgggcg gcgacctgct 120

gcgctgtgat ccaatattcg gggtcgttca ctggttcccc tttctgattt ctggcataga 180

agaacccccg tgaactgtgt ggttccgggg gttgctgatt tttgcgagac ttctcgcgca 240

attccctagc ttaggtgaaa acaccatgaa acactaggga aacacccatg aaacacccat 300

tagggcagta gggcggcttc ttcgtctagg gcttgcattt gggcggtgat ctggtcttta 360

gcgtgtgaaa gtgtgtcgta ggtggcgtgc tcaatgcact cgaacgtcac gtcatttacc 420

gggtcacggt gggcaaagag aactagtggg ttagacattg ttttcctcgt tgtcggtggt 480

ggtgagcttt tctagccgct cggtaaacgc ggcgatcatg aactcttgga ggttttcacc 540

gttctgcatg cctgcgcgct tcatgtcctc acgtagtgcc aaaggaacgc gtgcggtgac 600

cacgacgggc ttagcctttg cctgcgcttc tagtgcttcg atggtggctt gtgcctgcgc 660

ttgctgcgcc tgtagtgcct gttgagcttc ttgtagttgc tgttctagct gtgccttggt 720

tgccatgctt taagactcta gtagctttcc tgcgatatgt catgcgcatg cgtagcaaac 780

attgtcctgc aactcattca ttatgtgcag tgctcctgtt actagtcgta catactcata 840

tttacctagt ctgcatgcag tgcatgcaca tgcagtcatg tcgtgctaat gtgtaaaaca 900

tgtacatgca gattgctggg ggtgcagggg gcggagccac cctgtccatg cggggtgtgg 960

ggcttgcccc gccggtacag acagtgagca ccggggcacc tagtcgcgga taccccccct 1020

aggtatcgga cacgtaaccc tcccatgtcg atgcaaatct ttaacattga gtacgggtaa 1080

gctggcacgc atagccaagc taggcggcca ccaaacacca ctaaaaatta atagtcccta 1140

gacaagacaa acccccgtgc gagctaccaa ctcatatgca cgggggccac ataacccgaa 1200

ggggtttcaa ttgacaacca tagcactagc taagacaacg ggcacaacac ccgcacaaac 1260

tcgcactgcg caaccccgca caacatcggg tctaggtaac actgaaatag aagtgaacac 1320

ctctaaggaa ccgcaggtca atgagggttc taaggtcact cgcgctaggg cgtggcgtag 1380

gcaaaacgtc atgtacaaga tcaccaatag taaggctctg gcggggtgcc ataggtggcg 1440

cagggacgaa gctgttgcgg tgtcctggtc gtctaacggt gcttcgcagt ttgagggtct 1500

gcaaaactct cactctcgct gggggtcatc tctggctgaa ttggaagtca tgggcgaacg 1560

ccgcattgag ctggctattg ctactaagaa tcacttggcg gcgggtggcg cgctcatgat 1620

gtttgtgggc actgttcgac acaaccgctc acagtcattt gcgcaggttg aagcgggtat 1680

taagactgcg tactcttcga tggtgaaaac atctcagtgg aagaaagaac gtgcacggta 1740

cggggtggag cacacctata gtgactatga ggtcacagac tcttgggcga acggttggca 1800

cttgcaccgc aacatgctgt tgttcttgga tcgtccactg tctgacgatg aactcaaggc 1860

gtttgaggat tccatgtttt cccgctggtc tgctggtgtg gttaaggccg gtatggacgc 1920

gccactgcgt gagcacgggg tcaaacttga tcaggtgtct acctggggtg gagacgctgc 1980

gaaaatggca acctacctcg ctaagggcat gtctcaggaa ctgactggct ccgctactaa 2040

aaccgcgtct aaggggtcgt acacgccgtt tcagatgttg gatatgttgg ccgatcaaag 2100

cgacgccggc gaggatatgg acgctgtttt ggtggctcgg tggcgtgagt atgaggttgg 2160

ttctaaaaac ctgcgttcgt cctggtcacg tggggctaag cgtgctttgg gcattgatta 2220

catagacgct gatgtacgtc gtgaaatgga agaagaactg tacaagctcg ccggtctgga 2280

agcaccggaa cgggtcgaat caacccgcgt tgctgttgct ttggtgaagc ccgatgattg 2340

gaaactgatt cagtctgatt tcgcggttag gcagtacgtt ctagattgcg tggataaggc 2400

taaggacgtg gccgctgcgc aacgtgtcgc taatgaggtg ctggcaagtc tgggtgtgga 2460

ttccaccccg tgcatgatcg ttatggatga tgtggacttg gacgcggttc tgcctactca 2520

tggggacgct actaagcgtg atctgaatgc ggcggtgttc gcgggtaatg agcagactat 2580

tcttcgcacc cactaaaagc ggcataaacc ccgttcgata ttttgtgcga tgaatttatg 2640

gtcaatgtcg cgggggcaaa ctatgatggg tcttgttgtt gacaatgaag cttcccgggt 2700

cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 2760

tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 2820

cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 2880

aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 2940

cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 3000

gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 3060

ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 3120

cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 3180

aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 3240

tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 3300

ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 3360

tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 3420

ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 3480

agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 3540

atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggcg 3600

<210> 4

<211> 11285

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 60

acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 120

tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 180

ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 240

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accaaggccg aacgtggtgg tctctccgag ctcgacaagg caggctttat caagcgccaa 2760

ctcgtggaga ctcgccaaat cactaaacac gtcgcccaga tcctcgactc ccgcatgaat 2820

accaagtacg atgaaaatga caagctcatc cgcgaagtga aagtcattac cctgaagtcc 2880

aaactggtct ctgactttcg caaggatttc cagttctaca aggtccgcga gattaataac 2940

tatcatcatg cacacgatgc atacctcaac gcagtcgtgg gtaccgcact gatcaagaag 3000

taccctaaac tggagtccga gttcgtctat ggcgactaca aggtgtacga cgtccgcaaa 3060

atgattgcca agtccgagca ggagatcggc aaagcaactg ccaaatattt cttttactcc 3120

aacatcatga acttcttcaa gaccgaaatc accctcgcca acggtgaaat ccgcaaacgt 3180

ccactcatcg agactaatgg tgaaaccggc gagatcgtct gggacaaggg ccgtgacttc 3240

gcaaccgtcc gcaaggtcct ctccatgcca caggtcaaca tcgtgaaaaa gaccgaggtg 3300

caaaccggcg gcttctccaa ggagtctatc ctgcctaaac gcaattccga taagctcatt 3360

gcacgcaaaa aggactggga ccctaaaaaa tacggcggtt tcgactcccc aactgtcgca 3420

tattctgtgc tcgtggtcgc caaagtggaa aagggcaaat ccaaaaagct caagtccgtc 3480

aaggaactcc tgggtatcac catcatggaa cgctcctcct ttgagaagaa ccctatcgat 3540

ttcctcgaag caaaaggtta caaggaggtg aagaaagatc tgatcatcaa gctccctaaa 3600

tactccctct tcgagctcga gaacggccgc aagcgtatgc tggcctccgc aggtgaactg 3660

caaaaaggta acgagctggc actcccatcc aagtatgtca actttctcta cctggcctcc 3720

cactacgaaa agctgaaagg ttccccagaa gacaacgagc agaaacagct gttcgtggag 3780

cagcacaagc actacctgga cgaaatcatc gagcagatct ccgagttctc taaacgcgtc 3840

attctggccg atgccaacct cgataaagtg ctctccgcct acaataagca tcgtgataag 3900

ccaatccgtg agcaggcaga gaacatcatt cacctgttca ctctcaccaa cctgggtgca 3960

ccagccgcct ttaagtactt cgacaccacc atcgaccgca agcgctatac ctccactaag 4020

gaggtgctcg atgcaaccct gatccaccag tctatcaccg gcctctacga gactcgcatc 4080

gatctctccc agctgggtgg cgactaa 4107

<210> 6

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaaggaggac aacta 15

<210> 7

<211> 109

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tacaatggaa atacagattg gggatgagtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 60

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgctttttt 109

<210> 8

<211> 2068

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggagtggaca agtcacgatc gttggaacac aacaggtttg cggcactcaa tgctgcgtca 60

tcaatttggt tggggtccgc taccccatca ccgtttgcat ccaatcccat aagtcgccac 120

gtttccggaa tgaactgcat gggacctacc gcgcgatcat attcagtatc gccatctaat 180

tccccaccat cagtgtcggg aatttccgca aaccccggtg aaccatcaag tggaacgccg 240

atgattggag gggttgcaac tccattttca tccagggaac tgcccccgaa cattttgccg 300

ttgtaggtac cgtgacgggt ttccacctgg ccgatacctg ccaaggtatt ccaccccaga 360

ttgcagccag accacgcagt actcgcaatg agctctgcgt ttccataagc cgcaatcgct 420

tgagcggaca caccagtatc ttgagcaatt ggttccgccc aaaaacgcaa atggtcggat 480

gtgcgtccat ctgcccctgt atcaatttgc ggaacttcta caccacgcgc cggcggaaca 540

tcttcaggga tttgctggag ttggcgaata ggtgccgttc catccatgaa gctaagcgcc 600

catccaacaa atgagatcac catgatgacg gccaaaaccg aaccgcatcc aaatcccatt 660

gcttttctaa cccctgaact catgagggtc gatgttaccg gctcgtttta gaactctcgc 720

attggctaga aaaacctgat tacttcacgc ctctttaagt aaaaaatcct gtgtctttct 780

aaccaaaaga cccaaaaaga cacgctaaat cagcctccta tgcaattagt agagcattca 840

catacaccgt gccaagacct aatttccacg actgaaactt caccaaatcc gcaggtagaa 900

actttgatga tctacatcac aaatttacaa tgtgtgatga gttgttcata taacccaagg 960

acttgaacct taaaaggagc cttagaatca tgaagctttc acaccgcatc gcagcaatgg 1020

cagcaaccgc aggcatcaca gtggcatgtc ctccaacttc tcttcctaaa aggttcgggg 1080

gtaaccccaa aaatcactta agccacaaca gtcacataaa tcacttcagt aacgtacgat 1140

tttggactgt tgtggctttt gccatattta tttcatttcc atctcagtga tctcttaagg 1200

aaacccatga agaaactacg tttcgccacc atcgcggccg ctaccgttgc cctgactgcg 1260

agcctttccc tctcagcttc cgcacaggac ttcaaccaaa tcatcgacaa ctttgattgt 1320

ggcatcctcc agaccgctat ctacaccacc ggtctggctc acgagaactc cactcgctca 1380

gagctcgctg ctaatctgcg caactccgca gctgtcggcc aactagactt cccattgaat 1440

atcgcggcta ccggctactc cgagcgcatc gctaaccgcg cactgacctg cggaatcgtg 1500

aaggaagatc cacaggactt cctctcccag ctgcagcttc tgtcctctaa cctatcttct 1560

tccttcttca ctgcttagtt tctcttgggc ttttccttga gcccacagcc gttgctgctc 1620

gacggtgtcc acaattccgg tggagccgtc gaacaggttc ggcgaacgag attgcatctt 1680

ggctacgaaa ctcgccgcca cgtcaaaaat gtcgaatcga ccctgacggg cggcgatttc 1740

tgcatgaaaa agcacctgca gcaaaacatc ccccagtgcg cttttcatgt gctcatcatc 1800

gccaccatga atcgcttcaa taaactcctg cgattcttct tccagatacg gaatcaaact 1860

ctcatgggtt tgcgtgcgtt cccactcgcc gcggcccacg gccgcccgca tgacgccgac 1920

ggcctcatgc aaagggttga ggggcgcgtc gataagcagc gtgctttgcg gttttgcggt 1980

gataaaccag gaggcgcttg tcgacgtctt gatcccccat ttttcaatat caaatggaaa 2040

atcgggatcg atagaaacag gttcaccc 2068

<210> 9

<211> 3060

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caagtcacga tcgttggaac acaacaggtt tgcggcactc aatgctgcgt catcaatttg 60

gttggggtcc gctaccccat caccgtttgc atccaatccc ataagtcgcc acgtttccgg 120

aatgaactgc atgggaccta ccgcgcgatc atattcagta tcgccatcta attccccacc 180

atcagtgtcg ggaatttccg caaaccccgg tgaaccatca agtggaacgc cgatgattgg 240

aggggttgca actccatttt catccaggga actgcccccg aacattttgc cgttgtaggt 300

accgtgacgg gtttccacct ggccgatacc tgccaaggta ttccacccca gattgcagcc 360

aggccacgca gtactcgcga tgagctctgc gtttccataa gccgcaatcg cttgagcgga 420

cacaccagta tcttgagcaa ttggttccgc ccaaaaacgc aaatggttgg atgtgcgtcc 480

atctgcctct gtatcaattt gcggaacttc tacaccacgc gccggcggaa catcttcagg 540

gatttgctgg agttggcgaa taggtgccgt tccatccatg aagctgagcg cccatccaac 600

aaatgagatc accatgatga cggccaaaac cgaaccgcat ccaaatccca ttgcttttct 660

aacccctgaa ctcatggggg tcgatgttac cggctcgttt tagaactctc gcattggcta 720

gaaaaacctg attacttcac gcctctttaa gtaaaaaatc ctgtgtcttt ctaaccaaaa 780

gacccaaaaa gacacgctaa atcagcctcc tatgcaatta gtagagcatt cacatacacc 840

gtgccaagac ctgatttcca cgactgaaac ttcattaaat ccactggtag aagctttgat 900

gatctacatc acaaatttac aatgtgtggt gagttattca tattacccaa ggacttaaac 960

cttaaaagga gccctaaaaa tcctatcatg ccataccgcg aaaggttttg caccattcga 1020

tggtgtcaac gtaaatgccg cttcgccttc gcgcgcgaat tgcaagctga tccgggctta 1080

tcgactgcac ggtgcaccaa tgcttctggc gtcaggcagc catcggaagc tgtggtatgg 1140

ctgtgcaggt cgtaaatcac tgcataattc gtgtcgctca aggcgcactc ccgttctgga 1200

taatgttttt tgcgccgaca tcataacggt tctggcaaat attctgaaat gagctgttga 1260

caattaatca tcggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg 1320

aaacagaatt aattaagctt aaaggaggac aaccatggtg agcaagggcg aggagctgtt 1380

caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag 1440

cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg 1500

caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt 1560

gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat 1620

gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac 1680

ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat 1740

cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca 1800

caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg 1860

ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat 1920

cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag 1980

caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg 2040

gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaaaaggtt cgggggtaac cccaaaaatc 2100

acttaagtca caacagtcac ataaatcact tcagtaacgt atgattttgg actgttgtgg 2160

cttttgccat atttatttca tttccatctc agtgatctct taaggaaacc catgaagaaa 2220

ctacgtttcg ccaccatcgc tgccgctacc gttgccctga ctgcgagcct taccccctca 2280

gcttccgcac aggatttcaa ccaaatcatc gacaactttg attgcggcat ccttcagacc 2340

gctatctaca ccaccggcct ggctcacgag aactccactc gctcagagct cgccgctaat 2400

ctgcgcaact ccgcagctgt cggccaacta gacttcccat tgaatatcgc ggctaccggc 2460

tactccgagc gcatcgctaa ccgcgcactg acctgcggaa tcgtgaagga agatccacag 2520

gacttcctct cccagctgca gcttctgtcc tctaacctat cttcttcctt cttcactgct 2580

tagtttctct tgggcttttc cttgagccca cagccgctgc tgctcgtcgg tgtccacaat 2640

tccggtagag ccgtcgaaca ggtacggcga acgagattgc atcttggcta cgaaactcgc 2700

cgccacgtca aaaatgtcga atcgaccctg acgggcggcg atttctgcat gaaaaagcac 2760

ctgcagcaaa acatccccca gttcgctttt catgtgctca tcatcgccac catgaatcgc 2820

ttcaataaac tcctgcgatt cttcttccag atacggaatc aaactctcat gggtttgcgt 2880

gcgttcccac tcgccgcggc ccacggccgc ccgcatgacg ccgacggcct catgcaaagg 2940

gttgaggggc gcgtcgataa gcagcgtgct ttgcggtttt gcgatgataa accaggaggc 3000

gcttgtcgac gtcttgatcc cccatttttc aatatcaaat ggaaaatcgg gatcgataga 3060

<210> 10

<211> 606

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtctttctaa ccaaaagacc caaaaagaca cgctaaatca gcctcctatg caattagtag 60

agcattcaca tacaccgtgc caagacctga tttccacgac tgaaacttca ttaaatccac 120

tggtagaagc tttgatgatc tacatcacaa atttacaatg tgtggtgagt tattcatatt 180

acccaaggac ttaaacctta aaaggagccc taaaaatcat gaagctttca caccgcatcg 240

cagcaatggc agcaaccgca ggcatcacag tggcagcatt cgcagcacct gcttccgcat 300

ccgagatact aaacctatcc tccaccaaca aagaactgtc ccctcagtac aactgggttg 360

cttgcggcat ccttgagggt ggcctcaaag cagctggcgt ccttgaagaa ggccagtaca 420

accgcgagct cgcagaagca atcgccgcaa agggtgaagg cttctggacc actcagttcc 480

cacaaatcgg tgattggaac gaagatcagg cagcagcact tgccgaccgc gcacaaacct 540

gtggcctagt taaggctgac acctaccttt ctgagctgtc ctccaacttc tcttcctaaa 600

aggttc 606

Claims (7)

1.一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体，其特征在于：

所述基因编辑载体包括Cas9表达元件、sgRNA表达元件、复制子元件和同源修复序列***位点；

所述cas9表达元件包括抗性基因、操纵子、启动子、SD序列、cas9序列和终止子，所述cas9序列如SEQ ID No.5所示，所述SD序列如SEQ ID No.6所示、并连接在cas9序列的始密码子ATG前；

所述sgRNA表达元件的包含启动子、sgRNA scaffold序列和终止子，所述sgRNAscaffold序列包括trancrRNA和crRNA***位点，所述crRNA***位点为AjuI酶切位点，所述sgRNA scaffold序列如SEQ ID No.7所示；

所述复制子元件包含谷氨酸棒状杆菌复制子repA；

所述同源修复序列***位点连接于所述sgRNA表达元件的终止子后。

2.根据权利要求1所述的一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体，其特征在于：所述cas9表达元件的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其抗性基因为cat氯霉素抗性基因，操纵子为lacIq，启动子为Ptac，终止子为rrnB；

所述sgRNA表达元件的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，其启动子为Ptrc，终止子为T1T2；

所述复制子元件的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述复制子原件还包括大肠杆菌复制子oriE；

所述同源修复序列***位点包括AflII酶切位点、BstBI酶切位点、SnaBI酶切位点和SwaI酶切位点。

3.根据权利要求2所述的一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体，其特征在于：所述基因编辑载体的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

4.如权利要求3所述的一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤，

a、合成由SD序列和cas9序列连接形成的复合体序列，并在复合体序列的两端引入HindⅢ酶切识别序列、EcoRⅠ酶切识别序列；将带有酶切识别序列的复合体序列以及pXMJ19载体分别酶切、纯化后进行连接，得到所述cas9表达载体；以所述cas9表达载体为模板，PCR扩增包括cat氯霉素抗性基因，乳糖操纵子lacIq，启动子Ptac，SD序列，cas9序列及终止子rrnB的cas9表达元件；

b、合成sgRNA scaffold序列，并在sgRNA scaffold序列两端引入BamHⅠ酶切识别序列、NotⅠ酶切识别序列；将带有酶切识别序列的sgRNA scaffold序列以及pECXK-99载体分别酶切、纯化后进行连接，得到sgRNA表达载体；以所述sgRNA表达载体为模板，PCR扩增包含启动子Ptrc，sgRNA scaffold序列及终止子T1T2的sgRNA表达元件，并在T1T2终止子后引入AflII，BstBI，SnaBI及SwaI四个酶切位点；

c、合成复制子元件；

d、利用同源重组技术，同源重组连接cas9表达元件，sgRNA表达元件及复制子元件，构建形成所述基因编辑载体。

5.一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑***，其特征在于：其包括如权利要求1~3所述的基因编辑载体。

6.如权利要求1~3所述的一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体的应用，其特征在于：所述应用包括以下步骤，

a、将crRNA序列、同源修复序列分别***到基因编辑载体的crRNA***位点、同源修复序列***位点；

b、将构建好的带有crRNA序列及同源修复序列的基因编辑载体转化谷氨酸棒状杆菌；

c、培养、筛选，获得转化子；

其中，待编辑的目的基因具有5′-（N₂₀）-NGG-3′结构，N为A、T、C或G，所述crRNA序列与目的基因5′-（N₂₀）-NGG-3′结构中的N20序列相同，所述同源修复序列由目的基因上游序列、目的基因编辑后形成的序列、目的基因下游序列依次连接形成，所述目的基因上游序列、目的基因下游序列长度为300bp~1000bp。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述应用包括基因敲除和基因替换。