CN107356588A - 一种简单灵敏的超氧自由基和过氧化氢纸基检测方法 - Google Patents

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赵新玉
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Abstract

本发明公开了一种简单灵敏的超氧自由基和过氧化氢纸基检测方法，涉及比色分析检测领域。利用显色剂与显色源特异性识别的特点，设计特殊的显色反应途径，从而达到目标物的特异性识别以及检测目标物转化的目的；通过在纸基复杂纤维上进行反应，实现信号的表征。本方法检测成本低、灵敏度高。

Description

一种简单灵敏的超氧自由基和过氧化氢纸基检测方法
技术领域
本发明涉及比色分析检测领域，更具体的说是一种以显色剂与显色源特异性识别显色作信号的方式构建的比色分析检测超氧自由基和过氧化氢的方法。
背景技术
细胞内活性氧(ROS)，如超氧阴离子自由基(·O2 -)、过氧化氢(H2O2) 和羟基自由基(·OH) 、脂自由基(ROO·)和过氧亚硝基阴离子(ONOO-)和一氧化氮(NO)，是具有代表性的重要自由基，分别与各种生理、病理密切相关。当生物体长时间暴露在氧化应激状态下，过量的活性氧的产生和积累会引起一系列有害的细胞信号，从而导致机体疾病的产生和衰老。因此，对活性氧自由基对细胞水平检测方法的发展，细胞内自由基含量的变化及实验数据的转换，对于疾病的早期诊断和治疗、深入理解生命活动的本质、药物筛选的研究具有重要的科学意义和潜在的的应用价值。
过氧化氢和超氧阴离子是生命活动中具有重要代表性的活性氧，作为多种信号转导途径的第二信使。当体内的这两种活性氧浓度水平处于正常状态时，它们将参与细胞信号转导、细胞增殖、能量合成、凋亡、分化，重要的生物材料的合成和细胞代谢，但当氧化应激条件下，过量的超氧阴离子和过氧化氢会有一系列的铅体引起的有害细胞损伤引起的各种疾病和衰老的。此外，过氧化氢和超氧自由基与羟基自由基(·OH)，过氧化亚硝酸盐和一氧化氮(NO)等活性氧密切相关。
目前已经创建的的能够测定活性氧自由基的方法，主要有化学发光法及光电显微术，电化学方法，电子自旋共振法，荧光方法，分光光度法，生物传感器法等。虽然这些方法可以提供较低的检测限，但是这些分析***都是依赖于特定的实验设施，通常是昂贵的，大型的，复杂的仪器。且上述方法都显示出不可避免的缺点. 因此有必要开发一种方法，它不仅可以解决长期运行稳定性低的问题，并且有能力实现简单，可视化，可靠的检测H2O2和O2 -。本实验试图开发一种更简单直观的方法，能够同时检测超氧阴离子和过氧化氢，该方法不需要大型仪器的支持，也不需要较长的分析时间，能够非常直观的观察到结果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是构建一种能特异性显色以识别超氧自由基和过氧化氢的低成本高灵敏的可视化同时检测方法。
一种简单灵敏的超氧自由基和过氧化氢纸基检测方法，其特征是包括以下步骤：
(1)制备所需要的催化剂石墨烯量子点：
将0.25 g XC-72炭黑加入50 mL 6 mol/L HNO3中；超声处理1小时后，将悬浮液在130℃下回流24小时；冷却至室温后，将悬浮液以8000 rpm离心30分钟，得到黄色上清液；将上清液在100 ℃下加热以除去水和硝酸，并获得作为红棕色固体的石墨烯量子点；随后，将红棕色固体在透析袋中进一步透析3天；透析后，将溶液离心30分钟；最后，将得到的石墨烯量子点溶液保持在4 ℃用于进一步使用；
(2)检测溶液的制备
该步骤中的总反应混合液体积为1.6 mL，显色液加入样品溶液在缓冲液中反应，所得混合溶液即为检测溶液；其成分为1 mL pH=7.0的缓冲溶液，200 μL 1 mM的黄嘌呤溶液，16μL 5%的噻唑蓝显色液，20 μL 20 mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色液，360 μL的石墨烯量子点溶液；
(3)可视化检测
取1 mL的pH=7.0的缓冲溶液，200 μL浓度为1 mM的黄嘌呤溶液，16 μL 5%的噻唑蓝显色液，并加入5 μL的黄嘌呤氧化酶溶液，快速混匀，静置后显色；
取1 mL的pH=7.0的缓冲溶液，200 μL浓度为1 mM的黄嘌呤溶液，20 μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色液，加入5 μL的黄嘌呤氧化酶溶液，360 μL的石墨烯量子点，快速混匀，静置后显色；
(4)检测基底设计及流程
检测基底由三部分组成，分别为样品区，超氧自由基检测区，过氧化氢检测区；检测时，将含有超氧自由基和过氧化氢的样品放入检测区；事先将超氧自由基显色剂和过氧化氢显色剂干法分别添加到超氧自由基检测区和过氧化氢检测区上；待样品流经检测区即可显色并证明相应物质的存在。
本发明的有益效果
（1） 利用染料的配体技术，能够实现目标物超氧自由基和过氧化氢的特异性识别；
（2） 利用纸基固化染色剂的方法，实现易于观察的表征；
（3） 本发明所述方法检测成本低、灵敏度高。
附图说明
图1为本文所述方法的实验原理图。
图2为本文所述基底的设计图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施。
实施例1
一种简单灵敏的超氧自由基和过氧化氢纸基检测方法，其特征是包括以下步骤：
(1)制备所需要的催化剂石墨烯量子点：
将0.25 g XC-72炭黑加入50 mL 6 mol/L HNO3中；超声处理1小时后，将悬浮液在130℃下回流24小时；冷却至室温后，将悬浮液以8000 rpm离心30分钟，得到黄色上清液；将上清液在100 ℃下加热以除去水和硝酸，并获得作为红棕色固体的石墨烯量子点；随后，将红棕色固体在透析袋中进一步透析3天；透析后，将溶液离心30分钟；最后，将得到的石墨烯量子点溶液保持在4 ℃用于进一步使用；
(2)检测溶液的制备
该步骤中的总反应混合液体积为1.6 mL，显色液加入样品溶液在缓冲液中反应，所得混合溶液即为检测溶液；其成分为1 mL pH=7.0的缓冲溶液，200 μL 1 mM的黄嘌呤溶液，16μL 5%的噻唑蓝显色液，20 μL 20 mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色液，360 μL的石墨烯量子点溶液；
(3)可视化检测
取1 mL的pH=7.0的缓冲溶液，200 μL浓度为1 mM的黄嘌呤溶液，16 μL 5%的噻唑蓝显色液，并加入5 μL的黄嘌呤氧化酶溶液，快速混匀，静置后显色；
取1 mL的pH=7.0的缓冲溶液，200 μL浓度为1 mM的黄嘌呤溶液，20 μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色液，加入5 μL的黄嘌呤氧化酶溶液，360 μL的石墨烯量子点，快速混匀，静置后显色；
(4)检测基底设计及流程
检测基底由三部分组成，分别为样品区，超氧自由基检测区，过氧化氢检测区；检测时，将含有超氧自由基和过氧化氢的样品放入检测区；事先将超氧自由基显色剂和过氧化氢显色剂干法分别添加到超氧自由基检测区和过氧化氢检测区上；待样品流经检测区即可显色并证明相应物质的存在。
实施例2
检测步骤同例1，不同之处是：HEPES缓冲溶液pH分别为5.4、5.6、5.8、6.0、7.0、7.4、7.8。

Claims (4)

1.一种简单灵敏的超氧自由基和过氧化氢纸基检测方法，其特征是包括以下步骤：
1.1制备所需要的催化剂石墨烯量子点：
将0.25g XC-72炭黑加入50mL 6mol/L HNO3中；超声处理1小时后，将悬浮液在130℃下回流24小时。冷却至室温后，将悬浮液以8000rpm离心30分钟，得到黄色上清液；将上清液在100℃下加热以除去水和硝酸，并获得作为红棕色固体的石墨烯量子点；随后，将红棕色固体在透析袋中进一步透析3天；透析后，将溶液离心30分钟；最后，将得到的石墨烯量子点溶液保持在4℃用于进一步使用；
1.2检测溶液的制备
该步骤中的总反应混合液体积为1.6mL，显色液加入样品溶液在缓冲液中反应，所得混合溶液即为检测溶液；其成分为1mL pH＝7.0的缓冲溶液，200μL 1mM的黄嘌呤溶液，16μL5％的噻唑蓝显色液，20μL 20mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色液，360μL的石墨烯量子点溶液；
1.3可视化检测
取1mL的pH＝7.0的缓冲溶液，200μL浓度为1mM的黄嘌呤溶液，16μL 5％的噻唑蓝显色液，并加入5μL的黄嘌呤氧化酶溶液，快速混匀，静置后显色；取1mL的pH＝7.0的缓冲溶液，200μL浓度为1mM的黄嘌呤溶液，20μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色液，加入5μL的黄嘌呤氧化酶溶液，360μL的石墨烯量子点，快速混匀，静置后显色；
1.4检测基底设计及流程
检测基底由三部分组成，分别为样品区，超氧自由基检测区，过氧化氢检测区；检测时，将含有超氧自由基和过氧化氢的样品放入检测区；事先将超氧自由基显色剂和过氧化氢显色剂干法分别添加到超氧自由基检测区和过氧化氢检测区上，待样品流经检测区即可显色并证明相应物质的存在。
2.根据权利要求1所述，一种简单灵敏的超氧自由基和过氧化氢纸基检测方法，其特征在于，染色剂在纸上表征，纸的多孔结构易于染色剂与底物反应产生颜色，便于观察，显色明显。
3.根据权利要求1所述，一种简单灵敏的超氧自由基和过氧化氢纸基检测方法，其特征在于，使用特异性催化剂石墨烯量子点，催化过氧化氢参与反应。
4.根据权利要求1所述，一种简单灵敏的超氧自由基和过氧化氢纸基检测方法，其特征在于，使用专一性染色剂噻唑蓝和3,3',5,5'-四甲基联苯胺，能够特异性识别超氧自由基和过氧化氢。
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