CN101822288A - 海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的真空冷冻干燥制品的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的真空冷冻干燥制品的制备方法。按1％～5％的接种量将海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman接种于酵母培养基中，在20～30℃，100～300转/分钟培养20～50小时，通过离心收集海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌体，弃去上清液，用无菌水洗涤2～3次，用血球计数法计数，并用保护剂调整成1×109～1×1011cells/ml细胞悬浮液，将细胞悬浮液孵育0.5-3小时，再进行真空冷冻干燥，得到真空冷冻干燥制品；真空度为0.005～0.01mbar，干燥温度为-55～-65℃，干燥时间12～36小时。本发明制备的真空冷冻干燥制品，可以保持R.paludigenum的存活率≥80％。本发明生产工艺简单，无污染、安全性高，能明显降低果蔬病害，将在多种果蔬的采后贮藏保鲜以及涉及R.paludigenum的产品开发中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman的真空冷冻干燥制品的制备方法。
背景技术
中国不仅是世界果蔬生产大国，也是农药生产和使用大国。长期频繁、过量的使用化学杀真菌剂，会严重破坏土壤的微生物环境、污染空气和水质、增强病虫害抗性，从而影响农业的出口创汇，危害了民众的身体健康，严重制约我国农业的可持续发展。随着食品安全观念的日益深入人心，越来越多的化学杀菌剂被限制使用。发展更多高效低价、安全无毒的生物保鲜剂成为当务之急。
发达国家目前最常用的非化学保鲜手段是冷链技术。中国地区发展不平衡，冷链技术对设备、成本都有较高的要求，短时间内在全国普及具有较大难度。拮抗酵母不产生抗生素，不需要购置特殊设备、操作简便，利于推广应用，是最有潜力替代化学杀菌剂的果蔬贮藏保鲜方法之一[1]。
已有的研究结果显示，拮抗菌的主要作用机理是细胞与病原菌之间营养和空间的竞争，拮抗菌的防治效果取决于细胞的使用浓度和生长活性[2]。生物保鲜已经在实验室积累了很多成功的经验，但是商业化的生防制剂包含了生产、包装、运输、销售和最终在不同果实上使用等诸多环节。因此，生防菌要真正实现产业化，必须形式适合商品销售的产品形式。
真空冷冻干燥具有很多优点，比如干燥过程中的微生物细胞收缩小，产品溶解性高和复水后活性强等，较为适合用于制备活性拮抗酵母干粉[3]。微生物在冻干过程中的存活力受到多种因素的影响，包括起始浓度[4]、保护剂的种类和浓度[5]。此外，冻干的起始浓度对微生物存活力和生产成本也有很大的影响[6]。
研究表明，海洋酵母Rhodosporidium paludigenum对多种果实采后真菌病害具有显著的抑制效果[7，8]。考虑到海洋酵母在逆境适应性方面的优势，R.paludigenum极具市场开发应用的潜力。目前，国内外还没有关于海洋酵母R.paludigenum真空冷冻干燥活性干粉的报道。
参考文献：
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发明内容
本发明的目的是提供一种海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell &Tallman的真空冷冻干燥制品的制备方法。
海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman的真空冷冻干燥制品的制备方法是：按1％～5％的接种量将海洋酵母Rhodosporidium paludigenumFell & Tallman接种于酵母培养基中，在20～30℃，100～300转/分钟培养20～50小时，通过离心收集海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman菌体，弃去上清液，用无菌水洗涤2～3次，用血球计数法计数，并用保护剂调整成1×109～1×1011cells/ml细胞悬浮液，将细胞悬浮液孵育0.5-3小时，再进行真空冷冻干燥，得到真空冷冻干燥制品；真空度为0.005～0.01mbar，干燥温度为-55～-65℃，干燥时间12～36小时。
所述海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman在英国国际真菌研究所(International Mycological Institute)国际农业与生物中心基因资源保藏中心(CABI Genetic Resource Collection)保藏，保藏号为IMI 394084。
所述酵母培养基的组成为：牛肉膏5～10g/L、酵母粉3～6g/L、葡萄糖8～12g/L，氯化钠10～40g/L。
所述保护剂为：质量百分含量为1～5％的蔗糖、质量百分含量为1～5％的海藻糖、质量百分含量为1～5％的脱脂奶粉或质量百分含量为0.5～1％的氯化钠中一种或多种。
本发明制备的真空冷冻干燥制品，可以保持R.paludigenum的存活率≥80％。本发明生产工艺简单，无污染、安全性高，能明显降低果蔬病害，将在多种果蔬的采后贮藏保鲜以及涉及R.paludigenum的产品开发中发挥重要作用。
具体实施方式
实施例1
本发明的保护剂对海洋酵母R.paludigenum真空冷冻干燥制品活菌率的影响
按1％的接种量将海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman接种于酵母培养基中，在20℃，100转/分钟培养50小时，通过离心收集海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman菌体，弃去上清液，用无菌水洗涤2次，用血球计数法计数，并用1％海藻糖调整成1×109cells/ml细胞悬浮液，将细胞悬浮液孵育0.5小时，再进行真空冷冻干燥，得到真空冷冻干燥制品；真空度为0.005mbar，干燥温度为-55℃，干燥时间36小时。
称取上述真空冷冻干燥制品0.1g加入100ml灭菌的生理盐水中，常温下孵育30min后，稀释一定梯度，取0.1ml悬浮液均匀涂布于酵母培养基平板，28℃培养48h后计算菌落数。活菌率计算公式：活菌率＝活菌数/总菌数×100％。
从表1可以看出，添加了保护剂的海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell& Tallman的冷冻干燥样品为淡红色粉末，具有酵母的特殊气味，无异味，活菌率≥80％，显著地高于不添加保护剂的对照样品活菌率。
表1 海藻糖对R.paludigenum真空冷冻干燥制品活菌率的影响
实施例2
本发明的保护剂对海洋酵母R.paludigenum真空冷冻干燥制品活菌率的影响
按5％的接种量将海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman接种于酵母培养基中，在30℃，300转/分钟培养20小时，通过离心收集海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman菌体，弃去上清液，用无菌水洗涤3次，用血球计数法计数，并用2.5％海藻糖、2.5％脱脂乳、2.5％蔗糖和0.85％氯化钠混合的保护剂调整成1×1011cells/ml细胞悬浮液，将细胞悬浮液孵育3小时，再进行真空冷冻干燥，得到真空冷冻干燥制品；真空度为0.01mbar，干燥温度为-65℃，干燥时间12小时。按照上述方法统计活菌率。
从表2可以看出，添加了保护剂的海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell& Tallman的冷冻干燥样品为淡红色粉末，具有酵母的特殊气味，无异味，活菌率≥90％，显著地高于不添加保护剂的对照样品活菌率。
表2 保护剂对R.paludigenum真空冷冻干燥制品活菌率的影响
实施例3
本发明的保护剂对海洋酵母R.paludigenum真空冷冻干燥制品活菌率的影响
按2％的接种量将海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman接种于酵母培养基中，在28℃，200转/分钟培养36小时，通过离心收集海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman菌体，弃去上清液，用无菌水洗涤3次，用血球计数法计数，并用2.5％海藻糖和2.5％蔗糖混合的保护剂调整成1×1010cells/ml细胞悬浮液，将细胞悬浮液孵育1小时，再进行真空冷冻干燥，得到真空冷冻干燥制品；真空度为0.01mbar，干燥温度为-65℃，干燥时间24小时。按照上述方法统计活菌率。
从表3可以看出，添加了保护剂的海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell& Tallman的冷冻干燥样品为淡红色粉末，具有酵母的特殊气味，无异味，活菌率≥83％，显著地高于不添加保护剂的对照样品活菌率。
表3 保护剂对R.paludigenum真空冷冻干燥制品活菌率的影响
实施例4
本发明的海洋酵母R.paludigenum真空冷冻干燥制品的货架寿命
按3％的接种量将海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman接种于酵母培养基中，在26℃，200转/分钟培养48小时，通过离心收集海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman菌体，弃去上清液，用无菌水洗涤3次，用血球计数法计数，并用2.5％海藻糖、2.5％脱脂乳和2.5％蔗糖混合的保护剂调整成5×1010cells/ml细胞悬浮液，将细胞悬浮液孵育2小时，再进行真空冷冻干燥，得到真空冷冻干燥制品；真空度为0.01mbar，干燥温度为-60℃，干燥时间24小时。将上述冷样品贮藏于4℃冰箱，每隔30天取样，测定样品的活菌率。活菌率测定方法同上。
从表4可以看出，添加了保护剂的海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell& Tallman的真空冷冻干燥制品在贮藏的前4月，活菌率没有显著下降。
表4 海洋酵母R.paludigenum真空冷冻干燥制品货架寿命
实施例5
本发明的海洋酵母R.paludigenum真空冷冻干燥制品对水果采后青霉病的抑制效果
按4％的接种量将海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman接种于酵母培养基中，在26℃，250转/分钟培养30小时，通过离心收集海洋酵母Rhodosporidiumpaludigenum Fell & Tallman菌体，弃去上清液，用无菌水洗涤2次，用血球计数法计数，分别用5％海藻糖、5％脱脂乳、5％蔗糖作为保护剂调整成1×1010cells/ml细胞悬浮液，将细胞悬浮液孵育1小时，再进行真空冷冻干燥，得到真空冷冻干燥制品；真空度为0.01mbar，干燥温度为-65℃，干燥时间24小时。按照上述方法统计活菌率。
根据样品的活菌率，用一定无菌水将将上述样品配制成浓度为1×108cells/ml的酵母细胞悬浮液。本实施例以梨和苹果为试验材料。果实来源于杭州郊区果园。
病原菌：扩展青霉(Penicillium expansum)
果实刺伤后接种样品细胞悬浮液和作为对照的无菌水。接种量30μl为。2小时后，接种15μl浓度为5×104个/mL的病原菌孢子悬浮液。果实处理后20℃下入库贮藏5天，观察果实的发病率。
海洋酵母R.paludigenum真空冷冻干燥制品对果实采后青霉病的防治效果如表5和6所示，该制品可有效降低果实青霉病的发病率。
表5 海洋酵母R.paludigenum真空冷冻干燥制品对梨青霉病的抑制效果
表6 海洋酵母R.paludigenum真空冷冻干燥制品对苹果青霉病的抑制效果
Claims (4)
1.一种海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的真空冷冻干燥制品的制备方法，其特征在于按1％～5％的接种量将海洋酵母Rhodosporidiumpaludigenum Fell&Tallman接种于酵母培养基中，在20～30℃，100～300转/分钟培养20～50小时，通过离心收集海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌体，弃去上清液，用无菌水洗涤2～3次，用血球计数法计数，并用保护剂调整成1×109～1×1011cells/ml细胞悬浮液，将细胞悬浮液孵育0.5-3小时，再进行真空冷冻干燥，得到真空冷冻干燥制品；真空度为0.005～0.01mbar，干燥温度为-55～-65℃，干燥时间12～36小时。
2.根据权利要求1所述的一种海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的真空冷冻干燥制品的制备方法，其特征在于所述海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman在英国国际真菌研究所(InternationalMycological Institute)国际农业与生物中心基因资源保藏中心(CABI GeneticResource Collection)保藏，保藏号为IMI 394084。
3.根据权利要求1所述的一种海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的真空冷冻干燥制品的制备方法，其特征在于所述酵母培养基的组成为：牛肉膏5～10g/L、酵母粉3～6g/L、葡萄糖8～12g/L，氯化钠10～40g/L。
4.根据权利要求1所述的一种海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的真空冷冻干燥制品的制备方法，其特征在于所述保护剂为：质量百分含量为1～5％的蔗糖、质量百分含量为1～5％的海藻糖、质量百分含量为1～5％的脱脂奶粉或质量百分含量为0.5～1％的氯化钠中一种或多种。
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