CN107304412A - 视网膜色素上皮细胞的培养基及其应用 - Google Patents

视网膜色素上皮细胞的培养基及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了视网膜色素上皮细胞的培养基及其应用，具体地，本发明提供了一种无血清的培养视网膜色素上皮细胞的培养基，所述培养基为含有基础培养基和添加物的培养液，其中，所述的添加物包括人血小板裂解液(HPL)和肝素，并且所述培养液不添加动物血清。本发明提供的培养基培养的人的视网膜色素上皮细胞，不仅形态上具有呈典型的六边形铺路石样，蛋白标记物RPE65呈阳性的细胞(即RPE65+视网膜色素上皮细胞)的比例高达94.5％。

Description

视网膜色素上皮细胞的培养基及其应用
技术领域
本发明涉及细胞培养领域。更具体地，本发明涉及一种视网膜色素上皮细胞的培养基及其应用。
背景技术
视网膜退行性病变是引起不可逆致盲眼病的主要病因，其中主要包括年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、Stargardt病。其中年龄相关性黄斑变性患者，全球大约有3千万到5千万，而视网膜色素变性患者约1百万。目前我国的年龄相关性黄斑变性患者大约超过2000万人，并预计将在2050年增加一倍。
由于视网膜退行性病变主要表现为黄斑区视网膜色素上皮(Retinal PigmentEpithelium,RPE)的损伤，因此再生医学RPE细胞的替代移植治疗成为治疗研究的主要方向。迄今已报道了多种来源的RPE细胞移植，主要有患者自体RPE细胞移植、虹膜色素上皮细胞(Iris Pigment Epithelium,IPE)移植，胚胎和成人RPE细胞移植，以及胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)来源的RPE细胞移植。这些细胞移植在动物实验中均显示出明确的治疗作用，但是又均存在各自的缺陷。患者自体RPE移植手术复杂，存在PVR并发症，AMD复发的问题；IPE对某些视网膜变性模型具有治疗作用，但是对IPE和RPE的表达谱研究表明IPE缺乏视紫红质循环中的某些关键酶，并不能完全替代RPE的生理功能，近年来的相关研究也日趋减少；胚胎干细胞的临床应用存在伦理争议，因潜在致瘤性其安全性也始终令人诟病；iPSCs在构建过程中被导入了潜在的原癌基因，逆转录病毒整合进入宿主基因组也会增加致瘤的风险，最近的研究也证实了iPSCs比胚胎干细胞有更高的畸胎瘤形成倾向。虽然有研究报道减少或完全去除外源性转录因子，或者通过小分子化合物，或者通过导入后再去除的办法来解决问题。但是无论那一种方法对iPSCs进入临床前的安全性还有待进一步验证。
研究表明，人RPE细胞具有免疫原性小，不引起T细胞显著的特异性免疫反应，还可以抑制T细胞激活，避免了免疫抑制剂的使用；具有极大的体外增殖能力，一个人眼球可以用于治疗数百名AMD患者，减轻了对人RPE细胞临床应用的取材限制、经济负担和伦理争论；人RPE细胞在体内可以分泌营养因子，与宿主视网膜形成突触连接；在致肿瘤性风险上明显优于干细胞来源的RPE细胞；能够表达多种RPE特有的功能性标志物等优点，是视网膜色素上皮细胞移植替代治疗最有希望的细胞来源之一。
以往视网膜色素上皮细胞的分离和培养都是在添加动物血清(主要为FBS)的培养体系下进行的。一方面，由于动物血清具有异种蛋白免疫排斥的风险，且动物血清中的成分不明确，可能含有动物来源的病原体，易被病毒、支原体、疯牛病病毒感染，在生产临床级别的人用细胞制剂时，理论上会导致一些病原体的传播，因此在临床应用中具有潜在的危险。另一方面，血清间具有批次差异，造成不同批次培养的细胞表型、增殖能力、长期培养后的细胞功能等存在较大差异，直接影响了视网膜色素上皮细胞的临床应用。因此，如果想让人视网膜色素上皮细胞进行大规模生产并广泛应用于临床，必须先有无动物源性成分的体外培养方法。2008年David M.Gamm等提出用F12混合营养物和B27等组成的无血清成分培养基培养人视网膜色素上皮细胞,但由于其成分繁多，配制复杂，而且成本昂贵，并不适合临床上大规模生产。
因此，本领域迫切需要开发一种无动物血清(如胎牛血清)的培养基。
发明内容
本发明提供了一种无动物血清(如胎牛血清)的培养基。
本发明第一方面提供了一种无血清的培养视网膜色素上皮细胞的培养基，所述培养基为含有基础培养基和添加物的培养液，其中，所述的添加物包括人血小板裂解液(HPL)和肝素，并且所述培养液不添加动物血清。
在另一优选例中，所述的动物血清包括：人血清、非人哺乳动物血清。
在另一优选例中，所述的动物血清包括：胎牛血清。
在另一优选例中，所述的培养液不添加任何的胎牛血清或其它家畜的胎血清。
在另一优选例中，所述无血清的培养视网膜色素上皮细胞的培养基具有选自下组的一个或多个特征：
(a)所述培养基中，所述血小板裂解液(HPL)的浓度(v/v)为5％-20％，较佳地，8-20％，更佳地，10-18％，更佳地，10-15％；
(b)所述培养基中，所述肝素的浓度为1-8U/ml，较佳地，1.5-6U/ml，更佳地，2-5U/ml；
所述血小板裂解液(HPL)与所述肝素的比例为1ml：5-50U，较佳地，1ml：10-40U，更佳地，1ml：15-30U。
在另一优选例中，所述基础培养基包括如下组分：
MEM培养基(α-modification)、N1补充剂、L-谷氨酸、抗生素(如青霉素-链霉素)、非必需氨基酸、牛磺酸、氢化可的松、三碘甲状腺氨酸。
在另一优选例中，所述基础培养基中各个组分的浓度如下：
其中，各浓度按无血清的视网膜色素上皮细胞培养基的总体积计。
本发明第二方面提供了一种用于无血清培养视网膜色素上皮细胞的培养基试剂盒，包括以下组分：
(i)基础培养基；
(ii)人血小板裂解液(HPL)；和
(iii)肝素。
在另一优选例中，所述试剂盒包括：
(i)第一混合物，所述第一混合物由人血小板裂解液(HPL)和基础培养基混合而成；和
(ii)肝素。
在另一优选例中，所述血小板裂解液(HPL)与所述肝素的比例为1ml：5-50U，较佳地，1ml：10-40U，更佳地，1ml：15-30U。
本发明第三方面提供了一种本发明第一方面所述的无血清的培养视网膜色素上皮细胞的培养基的制备方法，包括步骤：
(a)将基础培养基和添加物进行混合，从而形成培养液，即为本发明第一方面所述的含有基础培养基和添加物的培养液，其中，所述的添加物包括人血小板裂解液(HPL)和肝素，
并且所述的方法不包括添加血清的步骤。
本发明第四方面提供了一种体外扩增视网膜色素上皮细胞的方法，包括步骤：
(a)在适合生长且无血清条件下，在本发明第一方面所述的无血清的培养视网膜色素上皮细胞的培养基中，体外培养视网膜色素上皮细胞，从而获得经扩增的视网膜色素上皮细胞。
在另一优选例中，所述的无血清条件指：不添加任何的胎牛血清或其它家畜的胎血清，也不添加人血清。
在另一优选例中，所述的步骤(a)中，所述经扩增的视网膜色素上皮细胞的浓度为5×105-20×105个/ml,较佳地8×105-15×105个/ml。
在另一优选例中，所述的方法还包括(b)：对所述经扩增的视网膜色素上皮细胞进行鉴定。
在另一优选例中，所述的鉴定包括：形态鉴定、RPE65+标志物鉴定、细胞浓度测定或其组合。
在另一优选例中，所述的方法是非治疗性和非诊断性的。
在另一优选例中，所述的方法还包括：将所述经扩增的视网膜色素上皮细胞与药学上可接受的载体进行混合，从而制得一生物制剂。
在另一优选例中，所述的生物制剂(即细胞制剂)为可注射的。
在另一优选例中，所述的生物制剂为眼内注射的注射剂。
本发明第五方面提供了本发明第一方面所述培养基或本发明第二方面所述试剂盒的用途，用于培养视网膜色素上皮细胞。
在另一优选例中，所述的用途是非治疗性和非诊断性的。
本发明第六方面提供了一种组合物或混合物的用途，所述组合物或混合物由血小板裂解液和肝素构成，用于制备本发明第一方面所述的无血清培养视网膜色素上皮细胞的培养基。
在另一优选例中，所述血小板裂解液(HPL)与所述肝素的比例为1ml：5-50U，较佳地，1ml：10-40U，更佳地，1ml：15-30U。
本发明第七方面提供了一种视网膜色素上皮细胞，所述视网膜色素上皮细胞是用本发明第四方面所述的方法获得的、经扩增的视网膜色素上皮细胞。
在另一优选例中，在经扩增的视网膜色素上皮细胞所构成的细胞群中，蛋白标记物RPE65呈阳性的细胞(即RPE65+视网膜色素上皮细胞)的比例为≥93％，较佳地≥94％，如94-96％，按所述细胞群的细胞总数计。
本发明第八方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明第七方面所述的视网膜色素上皮细胞和药学上可接受的载体，并且所述的药物组合物的剂型为注射剂。
在另一优选例中，所述的剂型为眼内注射剂。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明中胰蛋白酶消化后离心获得的人视网膜色素上皮细胞。
图2显示了本发明HPL和肝素培养下的P0代人视网膜色素上皮细胞。
图3显示了P2代和P3代人视网膜色素上皮细胞在四种培养方法下培养的图片。
图4显示了P2代人视网膜色素上皮细胞在四种培养方法下用ELISA检测生长因子VEGF含量的结果。
图5显示了消化的本发明的HPL和肝素培养下和胎牛血清培养下的已培养4周的P2代人视网膜色素上皮细胞。
图6显示了P3代人视网膜色素上皮细胞在四种培养方法下的生长曲线。
图7显示了流式检测本发明HPL和肝素培养下培养的P3代人视网膜色素上皮细胞和胎牛血清培养的P3代细胞的表达蛋白标志物RPE65含量的比较结果。
图8显示了P3代人视网膜色素上皮细胞在只含有血小板裂解液不含肝素的培养基培养下变圆脱落。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量筛选和测试，首次意外发现，在无血清条件下，将血小板裂解液和肝素添加到基础培养基中，所制备的培养基可以非常有效地对人的视网膜色素上皮细胞进行体外培养和扩增，不仅扩增获得的视网膜色素上皮细胞数量远高于采用胎牛血清的培养基，并且所扩增的视网膜色素上皮细胞的形态好且质量稳定(优于采用胎牛血清的培养基所扩增的细胞)。试验结果表明，用本发明的不含胎牛血清的培养基培养扩增的人的视网膜色素上皮细胞，不仅形态上具有呈典型的六边形铺路石样，还能够大量表达视网膜色素上皮细胞特有的蛋白标记物RPE65。在此基础上完成了本发明。
视网膜色素上皮细胞
视网膜色素上皮(Retinal Pigment Epithelium,RPE)细胞在视网膜十层结构中扮演着极其重要和多重的角色，包括营养和支持光感受器细胞，参与血视网膜屏障的建立等等。RPE细胞的退化是许多不可逆致盲眼病的主要诱因和主要病理变化，其中主要包括年龄相关性黄斑变性(Age-related Macular Degeneration,AMD)、视网膜色素上皮细胞变性(Retinitis Pigmentosa,RP)、Startgardt's症等视网膜退行性病变。
在临床上，除了湿性AMD可以利用Avastin、Lucentis等抗VEGF药物控制疾病的进展，干性AMD、RP和Startgardt's症均无任何有效治疗方法。因此再生医学RPE细胞的移植替代治疗已成为治疗研究的主要方向，而大规模生产符合GMP标准的功能稳定的人RPE细胞，需要无血清、无动物源性的培养基。
血小板裂解液
人血小板裂解液(HPL)是含有高浓度生长因子和细胞因子的细胞培养添加剂。
在本发明中，原料来自于美国的血液中心提供的经过全面检测合格的血小板，可追本溯源，在GMP条件下生产，安全性极高，批次间稳定。依据美国FDA公布的细胞培养安全等级标准，符合二级，可用于人体临床。
通常，血小板裂解液可用常规方法制得。目前血小板裂解液已商品化，可从Helios公司购得。
在本发明中，还可以将血小板裂解液和肝素一起添加到培养基中，对人的视网膜色素上皮细胞进行培养。
培养基(或培养液)
通常，培养视网膜色素上皮细胞的培养基都含有动物血清(如胎牛血清)。在本发明中，在不含胎牛血清的基础培养基中加入血小板裂解液和肝素，对人的视网膜色素上皮细胞进行培养。
其中，所述基础培养基的成分不受特别的限制，在一优选例中，所述基础培养基包括如下组分：
MEM培养基(α-modification)、N1补充剂、L-谷氨酸、青霉素-链霉素、非必需氨基酸、牛磺酸、氢化可的松、三碘甲状腺氨酸。
并且，所述基础培养基中各个组分的浓度也不受特别的限制，在一优选例中，所述基础培养基中各个组分的浓度如下所示：
在本发明中，血小板裂解液的浓度不受特别的限制，一种优选的血小板裂解液的浓度(v/v)为5-20％，较佳地，8-20％，更佳地，10-18％，更佳地，10-15％。
在本发明中，肝素的浓度不受特别的限制，一种优选的肝素的浓度为1-8U/ml，较佳地，1.5-6U/ml，更佳地，2-5U/ml。
在本发明中，血小板裂解液与肝素的比例不受特别的限制，一种优选的比例为1ml：5-50U，较佳地，1ml：10-40U，更佳地，1ml：15-30U。
用本发明的培养基培养的视网膜色素上皮细胞，不仅形态上具有呈典型的六边形铺路石样，能传代到P3代以上，具有较强的分泌功能，能够大量表达视网膜色素上皮细胞特有的蛋白标记物，能够分泌色素，是优于胎牛血清的可以用于培养符合临床应用标准的视网膜色素上皮细胞的体外培养基。
培养基试剂盒
在本发明中，还提供了一种用于培养视网膜色素上皮细胞的培养基试剂盒，包括以下组分：
(i)基础培养基；
(ii)人血小板裂解液(HPL)；和
(iii)肝素。
在一优选实施方式中，所述试剂盒包括以下组分：
(i)第一混合物，所述第一混合物由人血小板裂解液(HPL)和基础培养基混合而成；和
(ii)肝素。
体外培养扩增方法
本发明还提供了一种体外的、在无血清条件下扩增视网膜色素上皮细胞的方法，包括：
在适合生长且无血清条件下，本发明所述的无血清的培养视网膜色素上皮细胞的培养基中，体外培养视网膜色素上皮细胞，从而获得经扩增的视网膜色素上皮细胞。
在本发明中，所述的无血清条件指：不添加任何的胎牛血清或其它家畜的胎血清，也不添加人血清。
通常，所述的培养温度为37℃±2℃，较佳地37℃±1℃。
通常，培养时间为1-30天，较佳地为2-25天，更佳地为3-20天，如7-20天，或7-14天，或10-15天。
扩增的视网膜色素上皮细胞及其制剂
用本发明的培养方法培养培养的视网膜色素上皮细胞，不仅形态上具有呈典型的六边形铺路石样，能传代到P3代以上，具有较强的分泌功能，能够大量表达视网膜色素上皮细胞特有的蛋白标记物，能够分泌色素，是优于采用胎牛血清所制备的视网膜色素上皮细胞。
用本发明的所制备或扩增的视网膜色素上皮细胞，可以与常规的药学上可接受的载体的进行混合，从而制得生物制剂或细胞制剂。通常，所述制剂中，经扩增的视网膜色素上皮细胞的浓度为1×104－1×106个/ml，较佳地5×104－5×105个/ml。
优选地，所述的生物制剂或细胞制剂为注射剂，尤其是适合眼内注射的注射剂。
本发明的优点主要包括：
1、本发明培养基和方法可高效扩增，在相同条件下所获得的视网膜色素上皮细胞数量为采用胎牛血清的培养基的约4倍。
2.用本发明培养基和方法所扩增的视网膜色素上皮细胞的形态好且质量稳定，其中，蛋白标记物RPE65呈阳性的细胞(即RPE65+视网膜色素上皮细胞)的比例高达94.5％，显著高于采用胎牛血清的培养基所扩增的细胞群中RPE65+视网膜色素上皮细胞的比例。
3.本发明的培养基中所用材料均为非动物源性、无血清成分的，极大提高了细胞在临床应用中的安全性。
4.由于不采用任何血清，因此提高了本发明制备的视网膜色素上皮细胞的质量稳定性(包括各批次间的稳定性)，有助于大规模制备符合临床应用标准的视网膜色素上皮细胞。
5、本发明培养基培养的人视网膜色素上皮细胞具有超过胎牛血清、血清替代物(KnockOut Serum Replacement)、人AB血清培养的极大的体外增殖能力，采用少量原料细胞(来源于一个眼球的细胞)就可以用于治疗数百名患者，有效解决了移植手术供体缺乏的问题。
6、用本发明的培养基培养的人视网膜色素上皮细胞呈典型的六边形铺路石样，能传代到P4代以上，具有较强的分泌功能，能够大量表达视网膜色素上皮细胞特有的蛋白标记物，能够分泌色素，是优于胎牛血清、血清替代物(KnockOut Serum Replacement)、人AB血清培养的可以用于培养符合临床应用标准的视网膜色素上皮细胞的体外培养基。
7、本发明成本低廉，人血小板裂解液(human platelet lysates)及培养基中的其他成分均为价格低廉的培养试剂，没有使用昂贵的细胞因子，避免了患者接受移植手术需要支付高昂的治疗费用，有利于大规模临床应用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
材料
MEM培养基(α-modification) 购自Sigma公司，货号M-4526
N1补充剂 购自Sigma公司,货号N6530
L-谷氨酸 购自Invitrogen公司，货号12360-038
青霉素-链霉素 购自Gibico公司，货号15140-122
非必需氨基酸 购自Sigma公司，货号M-7145
实施例1培养基NO.1
于45ml基础培养基内依次加入5ml的血小板裂解液和2000U/L(2U/ml)的肝素，得到本发明的人视网膜色素上皮细胞的培养基，于4℃可保存1个月，其中，肝素浓度为2U/ml，血小板裂解液的浓度(v/v)为10％，并且，血小板裂解液与肝素的浓度比为1ml：20U。
其中，基础培养基按如下配方进行配制：
实施例2培养基No.2
于45ml基础培养基内依次加入5ml的胎牛血清，得到本发明的人视网膜色素上皮细胞的培养基，于4℃可保存1个月。
其中，基础培养基按如下配方进行配制：
实施例3培养基No.3
于45ml基础培养基内依次加入5ml的人AB血清，得到本发明的人视网膜色素上皮细胞的培养基，于4℃可保存1个月。
其中，基础培养基按如下配方进行配制：
实施例4培养基No.4
于45ml基础培养基内依次加入7.5ml的血清替代物(KnockOut SerumReplacement)，得到本发明的人视网膜色素上皮细胞的培养基，于4℃可保存1个月。
其中，基础培养基按如下配方进行配制：
实施例5培养基No.5
于45ml基础培养基内加入5ml的血小板裂解液，得到本发明的人视网膜色素上皮细胞的培养基，于4℃可保存1个月，其中，血小板裂解液的浓度(v/v)为10％。
其中，基础培养基按如下配方进行配制：
实施例6
自愿捐赠眼球的患者无传染病、无视网膜色素变性和眼部肿瘤家族史。用高压灭菌的眼科手术剪，在PBS中剪去眼球壁周围的肌肉组织。用PBS清洗眼球2次，每次5分钟。沿角膜缘1-2mm处，切除角膜、虹膜，并将晶状体和玻璃体去除。挤压眼杯，轻轻将视网膜排出。用眼科手术剪将眼杯剪成花瓣状，铺平。从黑色的视网膜色素上皮的边缘开始，用眼科手术镊子将视网膜色素上皮一点点与脉络膜层分离。将撕下的视网膜色素上皮用移液枪吸取到15ml离心管中，并加入2ml 0.25％胰蛋白酶，37度培养箱中消化10分钟。反复吹打视网膜色素上皮组织，待其消化分离后加入4ml的培养基，以1000转/分钟离心5分钟，获得黑色的视网膜色素上皮细胞(图1)。离心后弃去上清液，并加入4ml的上述培养液重悬，获得用于接种的细胞悬液。用于实施例7-17。
实施例7采用实施例1的培养基No.1培养人的视网膜色素上皮细胞(RPE)
取实施例6制备的细胞悬液，接种在已用基质胶包备的六孔板中，每个孔含2ml培养液No.1(实施例1)，接种量3×105个/孔(1.5×105个/ml)。
接种后第二天换液，并每两天换液一次。待细胞长满后进行传代：在六孔板中每孔加入1ml0.25％胰蛋白酶消化，放入37度培养箱中消化3分钟。观察到细胞变圆并悬浮后，立刻加入2ml培养基中止消化。反复吹打培养板，帮助细胞悬浮，并将细胞吸入15ml离心管中，1000转/分钟离心5分钟。离心后弃去上清，加入培养基重悬细胞，并计数。以3×105个/孔(1.5×105个/ml)的浓度，将细胞接种在层粘连蛋白或基质胶包备好的六孔培养板上。
此后的培养方法和传代方法同上。
将P2代视网膜色素上皮细胞以血小板裂解液(human platelet lysates(HPL))和肝素培养2周后，进行观察和鉴定。
结果如图2-7所示，结果显示，血小板裂解液和肝素培养下的纤维化细胞较少，视网膜色素上皮细胞呈边缘清晰的六边形呈铺路石样(图2)。用ELISA法检测生长因子VEGF的分泌量，发现血小板裂解液和肝素培养下的细胞分泌量为约800pg/ml(图4)，传代时血小板裂解液培养下的细胞可以明显观察到色素(图5)。
P3代后，血小板裂解液和肝素培养下的细胞增殖良好(图3)。对P3代细胞以1×104个/孔接种在24孔板中，每孔含0.5ml培养液，每隔两天进行换液和细胞计数，并绘制生长曲线(图6)，结果发现，培养两周时，血小板裂解液和肝素培养后获得的细胞数高达4.5×105个/0.5ml(每个孔)。对P3代细胞流式细胞仪检测RPE细胞特有蛋白标记物RPE65，结果表明，血小板裂解液培养下所扩增获得的细胞群中，表达RPE65的细胞(即高质量的视网膜色素上皮细胞)比例高达94.5％(图7)。
综上，结果表明，适用本发明的无血清培养基，在体外培养下，人视网膜色素上皮细胞具有典型的六边形形态，具有极强的体外增殖能力，具有分泌功能，能够表达视网膜色素上皮细胞特有的蛋白标记，通过此培养方法培养的RPE细胞可以应用于临床。
实施例8采用实施例2的培养基培养人的视网膜色素上皮细胞
实验方法同实施例7，不同之处在于采用实施例2配制的培养基No.2。
结果显示，胎牛血清(FBS)培养下的纤维化细胞较少，视网膜色素上皮细胞呈边缘清晰的六边形呈铺路石样。用ELISA法检测生长因子VEGF的分泌量，发现血小板裂解液和肝素培养下的细胞分泌量为约800pg/ml(图4)，传代时胎牛血清培养下的细胞可以明显观察到色素(图5)。
P3代后，胎牛血清培养下的细胞增殖良好(图3)。对P3代细胞以1×104个/孔接种在24孔板中，每孔含0.5ml培养液，每隔两天进行换液和细胞计数，并绘制生长曲线(图6)，结果发现，培养两周时，胎牛血清培养下获得的细胞数为1.1×105个/0.5ml(每个孔)。对P3代细胞流式细胞仪检测RPE细胞特有蛋白标记物RPE65，结果表明，胎牛血清培养下，所扩增获得的细胞群中，表达RPE65的细胞比例为90.6％(图7)。
然而，胎牛血清是动物血清，血清制品成分不确定成分波动幅度大，胎牛来源有潜在的朊病毒感染风险且增加免疫排斥反应的风险，不能用于临床。
实施例9采用实施例3的培养基培养人的视网膜色素上皮细胞
实验方法同实施例7，不同之处在于采用实施例3配制的培养基No.3。
结果显示，人AB血清培养的视网膜色素上皮细胞边缘不清晰，出现较多纤维化细胞，用ELISA法检测生长因子VEGF的分泌量，发现人AB血清培养下的细胞分泌量最低，为673.2pg/ml(图4)，传代时人AB血清培养下的细胞色素分泌较少。
P3代后，人AB血清培养的细胞逐渐脱落(图3)。
结果表明，通过此培养方法培养的RPE细胞边缘不清晰，出现较多纤维化细胞，VEGF分泌量很低，细胞色素分泌少，传3代后细胞脱落，稳定性差，不能应用。
实施例10采用实施例4的培养基培养人的视网膜色素上皮细胞
实验方法同实施例7，不同之处在于采用实施例4配制的培养基No.4。
结果显示，血清替代物(KnockOut Serum Replacement)培养的视网膜色素上皮细胞出现大量纤维化细胞，用ELISA法检测生长因子VEGF的分泌量，发现人AB血清培养下的细胞分泌量为892.9pg/ml(图4)，传代时血清替代物(KnockOut Serum Replacement)培养下的细胞色素明显。
P3代后，血清替代物(KnockOut Serum Replacement)培养的细胞逐渐脱落(图3)。
结果表明，通过此培养方法培养的RPE出现大量纤维化细胞，传3代细胞逐渐脱落，稳定性差，不能应用。
实施例11采用实施例5的培养基培养人的视网膜色素上皮细胞
实验方法同实施例7，不同之处在于采用实施例5配制的培养基No.5。
结果显示，单独使用血小板裂解液不添加肝素培养的P3视网膜色素上皮细胞出现细胞变圆脱落(图8)。
结果表明，通过此培养方法培养的RPE出现细胞变圆脱落的现象，不能应用。
实施例12-17
重复实施例1和7，不同点在于，改变所述培养基中血小板裂解液与肝素的添加量和比例，从而制得50ml培养基No.12-No.17。
培养结果表明，采用上述培养基No.12至No.17，在P3代后，血小板裂解液和肝素培养下的细胞增殖良好。对P3代细胞以1×104个/孔接种在24孔板中，每孔含0.5ml培养液，每隔两天进行换液和细胞计数。培养两周时，血小板裂解液和肝素培养后获得的细胞数为3.0-6.0×105个/0.5ml(每个孔)。并且血小板裂解液和肝素培养下的纤维化细胞较少，视网膜色素上皮细胞呈边缘清晰的六边形呈铺路石样。
对P3代细胞流式细胞仪检测RPE细胞特有蛋白标记物RPE65，结果表明，RPE65+视网膜色素上皮细胞比例为93-95％。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种无血清的培养视网膜色素上皮细胞的培养基，其特征在于，所述培养基为含有基础培养基和添加物的培养液，其中，所述的添加物包括人血小板裂解液(HPL)和肝素，并且所述培养液不添加动物血清。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述无血清的培养视网膜色素上皮细胞的培养基具有选自下组的一个或多个特征：
(a)所述培养基中，所述血小板裂解液(HPL)的浓度(v/v)为5％-20％，较佳地，8-20％，更佳地，10-18％，更佳地，10-15％；
(b)所述培养基中，所述肝素的浓度为1-8U/ml，较佳地，1.5-6U/ml，更佳地，2-5U/ml；
(c)所述血小板裂解液(HPL)与所述肝素的比例为1ml：5-50U，较佳地，1ml：10-40U，更佳地，1ml：15-30U。
3.一种用于无血清培养视网膜色素上皮细胞的培养基试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
(i)基础培养基；
(ii)人血小板裂解液(HPL)；和
(iii)肝素。
4.一种权利要求1所述的无血清的培养视网膜色素上皮细胞的培养基的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(a)将基础培养基和添加物进行混合，从而形成培养液，即为权利要求1所述的含有基础培养基和添加物的培养液，其中，所述的添加物包括人血小板裂解液(HPL)和肝素，
并且所述的方法不包括添加血清的步骤。
5.一种体外扩增视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于，包括：
(a)在适合生长且无血清条件下，在权利要求1所述的无血清的培养视网膜色素上皮细胞的培养基中，体外培养视网膜色素上皮细胞，从而获得经扩增的视网膜色素上皮细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括(b)：对所述经扩增的视网膜色素上皮细胞进行鉴定。
7.权利要求1所述培养基或权利要求3所述试剂盒的用途，其特征在于，用于培养视网膜色素上皮细胞。
8.一种组合物或混合物的用途，所述组合物或混合物由血小板裂解液和肝素构成，其特征在于，用于制备权利要求1所述的无血清培养视网膜色素上皮细胞的培养基。
9.一种视网膜色素上皮细胞，其特征在于，所述视网膜色素上皮细胞是用权利要求5所述的方法获得的、经扩增的视网膜色素上皮细胞。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求9所述的视网膜色素上皮细胞和药学上可接受的载体，并且所述的药物组合物的剂型为注射剂。
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