CN107271598B - 中成药咽炎片标准特征图谱的构建方法与应用 - Google Patents
中成药咽炎片标准特征图谱的构建方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种中成药咽炎片标准特征图谱的构建方法与应用。取R,S‑告依春、芍药苷、哈巴俄苷对照品,咽炎片样品和按咽炎片处方比例及工艺制备的分别缺少玄参、板蓝根、天冬、麦冬、牡丹皮、制百部、青果、制款冬花、木蝴蝶、地黄、蝉蜕、薄荷油的12种阴性样品,分别制备对照品、供试品和阴性样品溶液,精密吸取上述溶液各1μL注入液相色谱仪中,按设定的色谱条件进行测定得到相应的色谱图,并以中药色谱指纹图谱相似度评价***进行计算后即生成咽炎片的标准特征图谱。本发明首次构建的咽炎片的标准特征图谱,其所包含的特征峰全面,定位准确,方法快速,可有效鉴别该中成药的真伪并评价其质量的优劣,有望成为咽炎片中成药质量控制的标准方法。
Description
技术领域
本发明涉及中药质量检测领域,具体涉及一种中成药咽炎片标准特征图谱的构建方法与应用。
背景技术
咽炎片是由玄参、板蓝根、天冬、麦冬、牡丹皮、制百部、青果、制款冬花、木蝴蝶、地黄、蝉蜕、薄荷油等十二味中药饮片组成的中药制剂,所含化学成分十分复杂。该制剂具有养阴润肺,清热解毒,清利咽喉,镇咳止痒之功效。用于慢性咽炎引起的咽干,咽痒,刺激性咳嗽等症。其制备方法是除薄荷油外,款冬花粉碎成细粉,过筛;其余玄参等十味加水煎煮二次,第一次3小时,第二次2小时,合并煎液,静置24小时,取上清液,浓缩成稠膏,与款冬花粉末混合,干燥,制成颗粒,喷加薄荷油,混匀,压制成1000片,包衣,即得。
已有特征图谱技术是一种可以应用于中药成分的综合的检测手段,是通过对共有特征峰的检测以达到对待检测样品的多种成分进行检测的目的,但是目前咽炎片中成药尚无整体性有效控制其质量的检测方法,如仅仅依靠薄层色谱法对咽炎片中成药的部分药味进行薄层色谱检测,或对咽炎片中成药中的某一种或多种成分采用高效液相色谱-紫外检测器法进行含量测定,片面的反映咽炎片中成药的质量有严重的缺陷,如秦香芹等(黑龙江医药.25(4):529-530)采用高效液相色谱-紫外检测器法测定咽炎片中芍药苷的含量,仅测定咽炎片中牡丹皮所含的1种成分的含量。付永慧等(药物分析杂志.29(12):2032-2035)测定咽炎片中5种指标成分的含量,仅能测定哈巴俄苷等可定性的5种成分的含量,而不能对咽炎片中至少6种无法定性的成分进行检测,因此只能片面的反映咽炎片的质量,不但不能全面有效地衡量咽炎片质量的优劣,而且不能准确快速的判断咽炎片的真伪。显然,检验效率高同时定性准确的检测方法,以满足中成药复杂的化学成分的质量可控的检测是非常必要的。因此只有构建咽炎片的标准特征图谱才能较为全面的、准确快速的反映咽炎片中复杂的化学成分及其质量的优劣,是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种中成药咽炎片标准特征图谱的构建方法与应用,以全面、快速地检测出中成药咽炎片中组方的10种药材的特征成分,达到鉴别该中成药的真伪,并评价其质量的优劣,弥补现有技术的不足。
本发明运用中医药理论,首先为建立咽炎片的标准特征图谱对其组方成分进行了研究分析:
首先,咽炎片组方中的君药是玄参,性甘、苦、咸、寒,具有清热养阴,解毒散结的功能;生地、麦冬、天冬、青果、板兰根、牡丹皮六味为臣药,君臣合伍有养阴调肺、清热解毒、清利咽喉之功;制百部、制款冬花、木蝴蝶、为佐药,有润肺止咳、化痰之功效。组成之成药全方以养阴,润肺着力,而取清热解毒、清利咽喉、疏风散热、镇咳化痰,利咽止痒之功,对素体阴虚,感受风热之邪,易从燥化之症甚宜,宜治急、慢性咽炎所致咽喉红肿、咽干、咽痒、口干、口渴、咳嗽、发热、恶风、汗出及刺激性咳嗽、音哑,失音等症。
玄参主要含有环烯醚萜类、苯丙素苷类成分,其中的哈巴俄苷为一种主要环烯醚萜苷成分,有较强的抗炎、神经保护、增强免疫等作用,为玄参的特征性有效成分。因此,本发明选择的玄参的特征成分为哈巴俄苷。
其次,板兰根、牡丹皮均为组方中的臣药。板兰根具有清热解毒、凉血利咽的功能。而衡量板蓝根药材质量优劣的指标性成分为板蓝根中的R,S-告依春,如《中国药典》2015年版一部板蓝根项下采用了高效液相色谱-紫外检测器法测定R,S-告依春的含量,因此以R,S-告依春的含量作为判定板蓝根药材质量优劣的指标;牡丹皮具有清热凉血,活血化瘀的功能。其中牡丹皮中的芍药苷具有保护脑神经细胞和心肌、抗局灶性脑缺血、提高造血机能、肿瘤抑制、免疫调节等生物活性,是牡丹皮的活性成分。因此,本发明选择的板蓝根的特征成分为R,S-告依春。选择的牡丹皮的特征成分为芍药苷;生地、麦冬、天冬、青果亦为方中之臣药,与板兰根、牡丹皮合用可增强君药作用。
再次,制百部、制款冬花、木蝴蝶为组方中的佐药,具有润肺止咳、化痰的功效。既可以加强君、臣药的治疗作用,亦可解除次要的兼证,制百部、制款冬花、木蝴蝶中的特征成分的检测也是不可缺少的。
因此,按照中药君、臣、佐、使组方原则,并依照药味作用主次而选择了R,S-告依春、芍药苷、哈巴俄苷共3种已定性的成分和6种不能定性的成分,实现这6种成分分别归属于1.地黄和百部;2.天冬、麦冬和青果;3.板蓝根和百部;4.木蝴蝶和牡丹皮;5.百部、木蝴蝶和玄参;6.百部和款冬花,共9种特征成分为指标构建了咽炎片的标准特征图谱,从而实现并达到了可以判断咽炎片的真伪并较全面的反映咽炎片成药的质量的优劣。
本发明的标准特征图谱的构建步骤如下:
(1)首先取①R,S-告依春、芍药苷、哈巴俄苷对照品,②12批咽炎片样品,③按《中华人民共和国***药品标准》中药成方制剂第二册收载的咽炎片处方比例及工艺制备的分别缺少玄参、板蓝根、天冬、麦冬、牡丹皮、制百部、青果、制款冬花、木蝴蝶、地黄、蝉蜕、薄荷油的12种阴性样品,即先后制备对照品溶液,供试品溶液和阴性样品溶液,分别精密吸取对照品溶液,供试品溶液和阴性样品溶液各1μL,注入液相色谱仪中,按照设定的色谱条件进行测定,检测并记录20分钟的色谱图,并以国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价软件***进行计算后即生成咽炎片的标准特征图谱;
(2)对照品溶液的制备:精密称取R,S-告依春对照品10.35mg、芍药苷对照品12.24mg、哈巴俄苷对照品10.08mg(精密至0.1mg),分别置于50mL量瓶中,加甲醇定容至50ml,制成对照品浓溶液。分别精密量取对照品浓溶液各5mL,置于25mL量瓶中,加甲醇定容至25mL,制成每1mL含R,S-告依春41.40μg、芍药苷47.20μg、哈巴俄苷38.71μg的混合溶液作为对照品溶液。
(3)供试品溶液的制备:取咽炎片样品10片,除去包衣,精密称定(精密至1mg),研细,精密称定粉末1g(精密至1mg),加入20%甲醇20mL,超声处理(功率300W,频率40KHz)30分钟,放冷,摇匀,滤过,取续滤液,制成供试品溶液。
(4)阴性样品溶液的制备:按《中华人民共和国***药品标准》中药成方制剂第二册收载的咽炎片处方比例及工艺制备的分别缺少玄参、板蓝根、天冬、麦冬、牡丹皮、制百部、青果、制款冬花、木蝴蝶、地黄、蝉蜕、薄荷油的阴性样品,按供试品溶液的制备方法制备12种阴性样品溶液。
其中的共有特征峰的标定是通过对照品溶液,供试品溶液和阴性样品溶液的色谱图中的色谱峰出峰时间和色谱峰是否存在进行比较,得出供试品溶液图谱中9个共有特征峰的归属:1号峰为未知成分峰,属于地黄;2号峰为未知成分峰,属于百部、天冬、麦冬、青果;3号峰为R,S-告依春峰,属于板蓝根;4号峰为未知成分峰,属于板蓝根、百部;5号峰为芍药苷峰,属于牡丹皮;6号峰为未知成分峰,属于木蝴蝶、牡丹皮;7号峰为未知成分峰,属于百部、木蝴蝶、玄参;8号峰为未知成分峰,属于百部、款冬花;9号峰为哈巴俄苷峰,属于玄参。
上述构建的咽炎片标准特征图谱应用于咽炎片的真伪鉴别和质量优劣的判定。
应用方法:只要分别精密吸取对照品溶液,供试品溶液各1μL,注入液相色谱仪中,按照上述设定的色谱条件进行测定,检测并记录20分钟的色谱图即可进行判定;
结果判定如下:首先待检测样品的供试品溶液图谱中应有9个特征峰,其中包括的R,S-告依春、芍药苷和哈巴俄苷3个峰应分别与相应的R,S-告依春、芍药苷和哈巴俄苷3个对照品峰的保留时间相同,即设定与R,S-告依春对照品保留时间相同的峰为S1峰,并分别计算检测样品的特征峰1~4号与S1峰的相对保留时间,规定值为:0.73、0.82、1.00、1.22,且检测样品的特征峰1~4号相对保留时间应在规定值的±5%之内;同样设定与芍药苷对照品保留时间相同的峰为S2峰,计算检测样品的特征峰5~9号与S2峰的相对保留时间,规定值为:1.00、1.04、1.14、1.23、1.39,检测样品的相对保留时间应在规定值的±5%之内,如待检测样品的供试品溶液图谱完全满足上述判定条件,则可判定检测样品为合格样品;否则可判定检测样品为不合格样品。
显然,本发明首次构建的咽炎片的标准特征图谱所包含的特征峰全面,定位准确,实现了有效鉴别该中成药的真伪,为评价其质量的优劣提供了快速标准检测方法,有望成为咽炎片中成药质量控制的标准方法。
附图说明
图1:本发明的咽炎片已定性3种成分的对照品溶液的UHPLC-UV色谱图。
图2:本发明的咽炎片供试品溶液的UHPLC-UV色谱图。
图3:本发明构建的咽炎片标准特征图谱。
具体实施方式
下面给出本发明的详细的实施例。
本发明采用:仪器与试药:Agilent 1290超高效液相色谱仪(美国,安捷伦);Sartoris BP211D电子天平;AUTO SCIENCE AS10200BT型超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。甲醇为色谱用试剂,其它试剂均为分析纯。R,S-告依春对照品(中国食品药品检定研究院,批号:111753-201505,含量为100%)、芍药苷对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110736-201539,含量为96.4%)、哈巴俄苷对照品(中国食品药品检定研究院,批号:111730-201508,含量为96.0%)。
色谱条件:色谱柱:Dikma Endevaorsil C18 2.1×100mm,1.8μm;以甲醇为流动相A,以水为流动相B,进行梯度洗脱0~4min,90%B→80%B,4~10min,80%B→40%B,10~14min,40%B,14~15min,40%B→80%B,15~18min,80%B→90%B,18~20min,90%B,流速为每分钟0.2ml;检测波长为278nm;柱温为30℃;理论板数按哈巴俄苷峰计算应不低于10000。
对照品溶液的制备:精密称取R,S-告依春对照品10.35mg、芍药苷对照品12.24mg、哈巴俄苷对照品10.08mg(精密至0.1mg),分别置于50mL量瓶中,加甲醇定容至50ml,制成对照品浓溶液。分别精密量取对照品浓溶液各5mL,置于25mL量瓶中,加甲醇定容至25mL,制成每1mL含R,S-告依春41.40μg、芍药苷47.20μg、哈巴俄苷38.71μg的混合溶液作为对照品溶液。
供试品溶液的制备:取咽炎片样品10片,除去包衣,精密称定(精密至1mg),研细,精密称定粉末1g(精密至1mg),加入20%甲醇20mL,超声处理(功率300W,频率40KHz)30分钟,放冷,摇匀,滤过,取续滤液,制成供试品溶液。
阴性样品溶液的制备:按《中华人民共和国***药品标准》中药成方制剂第二册收载的咽炎片处方比例及工艺制备的分别缺少玄参、板蓝根、天冬、麦冬、牡丹皮、制百部、青果、制款冬花、木蝴蝶、地黄、蝉蜕、薄荷油的阴性样品,按供试品溶液的制备方法制备12种阴性样品溶液。
标准特征图谱的构建:首先取①R,S-告依春、芍药苷、哈巴俄苷对照品;②12批咽炎片样品;③按《中华人民共和国***药品标准》中药成方制剂第二册收载的咽炎片处方比例及工艺制备的分别缺少玄参、板蓝根、天冬、麦冬、牡丹皮、制百部、青果、制款冬花、木蝴蝶、地黄、蝉蜕、薄荷油的阴性样品,先后制备对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液,按照设定的色谱条件进行测定,并以国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价***进行计算,生成咽炎片的标准特征图谱,其中选定共有特征峰为9个。
共有特征峰的标定:通过对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液的色谱图中色谱峰出峰时间和色谱峰是否存在进行比较,得出供试品溶液图谱中9个共有特征峰的归属。见表1。
表1共有特征峰的归属
具体应用方法:分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各1μL,注入液相色谱仪中,按照设定的色谱条件进行测定,检测并记录20分钟的色谱图进行结果判定。
结果判定:待检测样品的供试品溶液图谱中应有9个特征峰,其中包括的R,S-告依春、芍药苷和哈巴俄苷3个峰应分别与相应的R,S-告依春、芍药苷和哈巴俄苷3个对照品峰的保留时间相同,即设定与R,S-告依春对照品保留时间相同的峰为S1峰,并分别计算检测样品的特征峰1~4号与S1峰的相对保留时间,规定值为:0.73(1号峰)、0.82(2号峰)、1.00(3号峰)、1.22(4号峰),且检测样品的特征峰1~4号相对保留时间应在规定值的±5%之内;同样设定与芍药苷对照品保留时间相同的峰为S2峰,计算检测样品的特征峰5~9号与S2峰的相对保留时间,规定值为:1.00(5号峰)、1.04(6号峰)、1.14(7号峰)、1.23(8号峰)、1.39(9号峰),检测样品的相对保留时间应在规定值的±5%之内,如待检测样品的供试品溶液图谱完全满足上述判定条件,则可判定检测样品为合格样品;否则可判定检测样品为不合格样品。
精密度试验精密吸取同一供试品溶液1μl,连续进样6次,测定共有特征峰9个,峰1~4号以R,S-告依春峰为参照峰,峰5~9号以芍药苷峰为参照峰,各特征峰相对保留时间的相对标准偏差RSD(n=6)均小于1.5%,表明仪器精密度良好。
重复性试验取同一批咽炎片样品,按供试品溶液的制备方法平行制备6份供试品溶液,分别在上述色谱条件下进行测定,峰1~4号以R,S-告依春峰为参照峰,峰5~9号以芍药苷峰为参照峰,各特征峰相对保留时间的相对标准偏差RSD(n=6)均小于1.5%,表明该方法重复性良好。
稳定性试验精密吸取同一供试品溶液1μl,按上述色谱条件,分别于0、2、4、8、12、24小时进样1次,测定特征峰9个,峰1~4号以R,S-告依春峰为参照峰,峰5~9号以芍药苷峰为参照峰,各特征峰相对保留时间的相对标准偏差RSD(n=6)均小于1.5%,表明供试品溶液在24小时内稳定性良好。
相对保留时间的确定采用上述色谱条件分析6批次咽炎片样品,峰1~4号以R,S-告依春峰为参照峰,各共有特征峰相对保留时间平均值(n=6)分别为:0.73、0.82、1.00、1.22,RSD均为0%;峰5~9号以芍药苷峰为参照峰,各共有特征峰相对保留时间平均值(n=6)分别为:1.00、1.04、1.14、1.23、1.39,RSD均为0%;允许范围按±5%计算,各色谱峰相对保留时间均在规定范围内。
综上,本发明所建立的咽炎片的标准特征图谱可以较为全面的反映复方制剂中复杂的化学成分,具有操作简便,精密度好,重复性高的特点,有望成为咽炎片中成药质量控制的标准方法,以达到全面、有效地控制和监查中成药咽炎片的质量。
Claims (3)
1.一种中成药咽炎片标准特征图谱的构建方法,其特征在于包括对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液的制备,并分别精密吸取对照品溶液,供试品溶液和阴性样品溶液注入液相色谱仪中进行测定以生成咽炎片的标准特征图谱,具体步骤如下:
(1)上述对照品溶液的制备:精密称取R,S-告依春对照品10.35mg、芍药苷对照品12.24mg、哈巴俄苷对照品10.08mg,所述R,S-告依春对照品含量为100%、所述芍药苷对照品含量为96.4%、所述哈巴俄苷对照品含量为96.0%,分别置于50mL量瓶中,加甲醇定容至50ml,制成对照品浓溶液 ;分别精密量取对照品浓溶液各5mL,置于25mL量瓶中,加甲醇定容至25mL,制成每1mL含R,S-告依春41.40μg、芍药苷47.20μg、哈巴俄苷 38.71μg的混合溶液作为对照品溶液;
(2)上述供试品溶液的制备:咽炎片样品10片,除去包衣,精密称定,研细,精密称定粉末1g,加入20%甲醇20mL,超声处理30分钟,放冷,摇匀,滤过,取续滤液,制成供试品溶液;
(3)上述阴性样品溶液的制备:按《中华人民共和国***药品标准》中药成方制剂第二册收载的咽炎片处方比例及工艺制备的且分别缺少玄参、板蓝根、天冬、麦冬、牡丹皮、制百部、青果、制款冬花、木蝴蝶、地黄、蝉蜕、薄荷油的阴性样品,并按供试品溶液的制备方法制备12种阴性样品溶液;
之后分别精密吸取上述对照品溶液,供试品溶液和阴性样品溶液各1μL,分别注入液相色谱仪中,按照设定的色谱条件进行测定,检测并记录20分钟的色谱图,并以国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价软件***进行计算后即生成咽炎片的标准特征图谱,其中的9个共有特征峰的标定是通过对照品溶液,供试品溶液和阴性样品溶液的色谱图中的色谱峰出峰时间和色谱峰是否存在进行比较,即以此可得出供试品溶液图谱中9个共有特征峰的归属,并按照出峰时间选定并命名1~9号特征峰:其中1号峰为未知成分峰,属于地黄;2号峰为未知成分峰,属于百部、天冬、麦冬、青果;3号峰为R,S-告依春峰,属于板蓝根;4号峰为未知成分峰,属于板蓝根、百部;5号峰为芍药苷峰,属于牡丹皮;6号峰为未知成分峰,属于木蝴蝶、牡丹皮;7号峰为未知成分峰,属于百部、木蝴蝶、玄参;8号峰为未知成分峰,属于百部、款冬花;9号峰为哈巴俄苷峰,属于玄参;
上述液相色谱仪的设定条件:色谱柱:Dikma Endevaorsil C18 2.1×100mm,1.8μm;以甲醇为流动相A,以水为流动相B,进行梯度洗脱0~4 min,90%B→ 80%B,4~10 min,80%B→40%B,10~14 min,40%B,14~15 min,40%B→ 80%B,15~18 min,80%B→ 90%B,18~20min,90%B,流速为每分钟0.2ml;检测波长为278nm;柱温为30℃;理论板数按哈巴俄苷峰计算应不低于10000。
2.如权利要求1所述的咽炎片标准特征图谱的构建方法,其特征是上述的超声处理条件为功率300W,频率40KHz。
3.利用权利要求1的方法构建的咽炎片标准特征图谱进行咽炎片真伪鉴别和质量优劣判定的方法,其特征在于包括以下步骤:
首先待检测样品的供试品溶液图谱中应有9个特征峰,其中包括的R,S-告依春、芍药苷和哈巴俄苷3个峰应分别与相应的R,S-告依春、芍药苷和哈巴俄苷3个对照品峰的保留时间相同,设定与R,S-告依春对照品保留时间相同的峰为S1 峰,并分别计算检测样品的特征峰1~4 号与S1 峰的相对保留时间,规定值为:0.73、0.82、1.00、1.22,且检测样品的特征峰1~4 号相对保留时间应在规定值的±5%之内;同样设定与芍药苷对照品保留时间相同的峰为S2 峰,计算检测样品的特征峰5~9 号与S2 峰的相对保留时间,规定值为:1.00、1.04、1.14、1.23、1.39,同样检测样品的相对保留时间应在规定值的±5%之内,如待检测样品的供试品溶液图谱完全满足上述判定条件,则可判定检测样品为合格样品;否则可判定检测样品为不合格样品。
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