CN107266513B - 一种蛹虫草活性组分的分离纯化方法 - Google Patents

一种蛹虫草活性组分的分离纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开的是一种蛹虫草活性组分的分离纯化方法,具体包括以下步骤:将蛹虫草烘干粉碎,蛹虫草粉末用75%‑100%乙醇抽提,提取的上清液旋干得到固体,将固体用水溶解后与Oligo(dT)进行亲和,水浴加热,去除上清液,获得虫草素溶液,本发明通过酒精将蛹虫草中的核酸类物质去除,避免了后续过程中的核酸污染,通过亲和层析来分离纯化虫草素,吸附性强,特异性高,避免了有效损失,提高了有效成分的纯度,生产周期短,成本低,对设备要求低,操作简单,易于推广市场潜力大,分离纯化过程避开了有害溶剂的污染,提取物安全无毒,绿色环保。

Description

一种蛹虫草活性组分的分离纯化方法
技术领域
本发明涉及一种分离纯化方法,更具体一点说,涉及一种蛹虫草活性组分的分离纯化方法。
背景技术
蛹虫草为子囊菌门,肉座目,麦角菌科、虫草属的模式种,学名为Cordycepsmilitaris,又名北蛹虫草。蛹虫草中含有多种化学成分,具有多种药用功效,与冬虫夏草的药理功能和临床效果相似,但价格却远远低于冬虫夏草,因此蛹虫草逐渐成为冬虫夏草的替代品,具有极大的潜在市场。其主要活性成分包括腺苷、虫草素、虫草多糖等,目前研究最多应用最广的无疑是虫草素,鉴于虫草素抗肿瘤等活性,人们对虫草素的需求也越来越大。
目前获得虫草素的方式主要是通过分离提取获得,虫草素常规提取方法如水提法,水提醇沉法,醇提法等,提取过程单一,无法彻底提取蛹虫草中的有效成分,而辅助提取手段通常有微波、超声、酶法等,国内关于虫草素分离的技术手段主要为层析法,从总体上而言,这些提取方法在保留有效成分,弃除无效成分方面,仍存在提取不够充分,有效成分损失大,工序多,周期长,成本高等缺点。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术问题,提供具有分离简单、纯度高、周期短等技术特点的一种蛹虫草活性组分的分离纯化方法。
本发明是通过以下技术方案实现:
本发明一种蛹虫草活性组分的分离纯化方法,该方法采用如下步骤:
步骤1):将蛹虫草置于50-70℃条件下烘干至蛹虫草含水量在8%以下,超微粉碎5-15min,获得超微蛹虫草粉;
步骤2):将步骤1)获得的超微蛹虫草粉加入到浓度为75-100%的乙醇溶液中,充分搅拌溶解,超声30-60min,静置1-12h,置于转速为8000-10000rpm离心机内离心获取上清液,重复1-2次,合并上清液;
步骤3):将步骤2)合并的上清液旋干获得固体,将固体置于烧杯中,缓慢加入蒸馏水溶解,并充分搅拌,获得浓度为0.9-1.1mg/ml溶液,再将溶液置于转速为8000-10000rpm离心机内离心,获得初步提取液;
步骤4):按质量份数,将400-600份偶联了Oligo(dT)的磁珠用400-600份水洗涤两次,加入100-300份初步提取液,重置磁珠,置于室温条件下反应5-10min,用磁性分离器进行磁性分离,在磁性分离器上用移液器将上清液弃去;再加入100-300份水,混匀磁珠,用磁性分离器进行磁性分离,在磁性分离器上用移液器移取上清液弃去,重复两次;继续加入50-200份水,混匀磁珠,置于65-100℃水浴加热5-30min,快速置于磁性分离架上,进行磁性分离,快速收集上清液,获得虫草素溶液。
作为一种优选,步骤2)中所述微蛹虫草粉与浓度为70-100%乙醇质量比为1:5-20。
本发明一种蛹虫草活性组分的分离纯化方法,该方法采用如下步骤:
步骤1):将蛹虫草置于60℃条件下烘干至蛹虫草含水量在8%以下,超微粉碎8min,获得超微蛹虫草粉;
步骤2):将步骤1)获得的超微蛹虫草粉加入到浓度为85%的乙醇溶液中,充分搅拌溶解,超声45min,静置8h,置于转速为9000rpm离心机内离心获取上清液,重复1次,合并上清液;
步骤3):将步骤2)合并的上清液旋干获得固体,将固体置于烧杯中,缓慢加入蒸馏水溶解,并充分搅拌,获得浓度为1.0mg/ml溶液,再将溶液置于转速为9000rpm离心机内离心,获得初步提取液;
步骤4):按质量份数,将500份偶联了Oligo(dT)的磁珠用500份水洗涤两次,加入200份初步提取液,重置磁珠,置于室温条件下反应8min,用磁性分离器进行磁性分离,在磁性分离器上用移液器将上清液弃去,加入200份水,混匀磁珠,用磁性分离器上进行磁性分离,在磁性分离器上用移液器移取上清弃去,重复两次,加入125份水,混匀磁珠,置于80℃水浴加热18min,快速置于磁性分离架上,进行磁性分离,快速收集上清液,获得虫草素溶液。
作为一种优选,步骤2)中所述微蛹虫草粉与浓度为85%乙醇质量比为1:8。
本发明的有益效果:本发明开始通过酒精将蛹虫草中的核酸类物质去除,避免了后续过程中的核酸污染;通过亲和层析来分离纯虫草素,吸附性强,特异性高。避免了有效损失,提高了有效成分的纯度;生产周期短,成本低,对设备要求低,操作简单,易于推广市场潜力大;分离纯化过程避开了有害溶剂的污染,使最终所获得的提取物安全无毒,绿色环保;采用试剂仪器均为国产,成本低。
具体实施方式
以下通过具体的实施方式对本发明作进一步的说明,但本发明的实施方式并不受以下实施例的限制。
实施例1本发明一种蛹虫草活性组分的分离纯化方法,该方法采用如下步骤:
步骤1):将蛹虫草置于50℃条件下烘干至蛹虫草含水量在8%以下,超微粉碎5min,获得超微蛹虫草粉;
步骤2):将步骤1)获得的超微蛹虫草粉加入到浓度为75%的乙醇溶液中,充分搅拌溶解,超声30min,静置1h,置于转速为8000rpm离心机内离心获取上清液,重复1次,合并上清液,微蛹虫草粉与浓度为70%乙醇质量比为1:5;
步骤3):将步骤2)合并的上清液旋干获得固体,将固体置于烧杯中,缓慢加入蒸馏水溶解,并充分搅拌,获得浓度为0.9mg/ml溶液,再将溶液置于转速为8000rpm离心机内离心,获得初步提取液;
步骤4):按质量份数,将400份偶联了Oligo(dT)的磁珠用400份水洗涤两次,加入100份步骤3)获得的初步提取液,重置磁珠,置于室温条件下反应5min,用磁性分离器进行磁性分离,使得磁珠沉淀,固液分离,在磁性分离器上用移液器将上清液弃去;再加入100份水,混匀磁珠,用磁性分离器进行磁性分离,在磁性分离器上用移液器移取上清液弃去,重复两次;继续加入50份水,混匀磁珠,置于65℃水浴加热5min,快速置于磁性分离架上,进行磁性分离,快速用移液器移取上清液弃去,获得虫草素溶液,蒸干溶液,可以获得粉末状高纯度虫草素。
实施例2本发明一种蛹虫草活性组分的分离纯化方法,该方法采用如下步骤:
步骤1):将蛹虫草置于60℃条件下烘干至蛹虫草含水量在8%以下,超微粉碎10min,获得超微蛹虫草粉;
步骤2):将步骤1)获得的超微蛹虫草粉加入到浓度为85%的乙醇溶液中,充分搅拌溶解,超声45min,静置8h,置于转速为9000rpm离心机内离心获取上清液,重复1次,合并上清液,所述微蛹虫草粉与浓度为85%乙醇质量比为1:8;
步骤3):将步骤2)合并的上清液旋干获得固体,将固体置于烧杯中,缓慢加入蒸馏水溶解,并充分搅拌,获得浓度为1.0mg/ml溶液,再将溶液置于转速为9000rpm离心机内离心,获得初步提取液;
步骤4):按质量份数,将500份偶联了Oligo(dT)的磁珠用500份水洗涤两次,加入200份步骤3)获得的初步提取液,重置磁珠,置于室温条件下反应8min,用磁性分离器进行磁性分离,使得磁珠沉淀,固液分离,在磁性分离器上用移液器将上清液弃去;再加入200份水,混匀磁珠,用磁性分离器进行磁性分离,在磁性分离器上用移液器移取上清液弃去,重复两次;继续加入125份水,混匀磁珠,置于80℃水浴加热18min,快速置于磁性分离架上,进行磁性分离,快速用移液器移取上清液弃去,获得虫草素溶液,蒸干溶液,可以获得粉末状高纯度虫草素。
实施例3本发明一种蛹虫草活性组分的分离纯化方法,该方法采用如下步骤:
步骤1):将蛹虫草置于70℃条件下烘干至蛹虫草含水量在8%以下,超微粉碎15min,获得超微蛹虫草粉;
步骤2):将步骤1)获得的超微蛹虫草粉加入到浓度为100%的乙醇溶液中,充分搅拌溶解,超声60min,静置12h,置于转速为10000rpm离心机内离心获取上清液,重复2次,合并上清液,所述微蛹虫草粉与浓度为100%乙醇质量比为1:20;
步骤3):将步骤2)合并的上清液旋干获得固体,将固体置于烧杯中,缓慢加入蒸馏水溶解,并充分搅拌,获得浓度为1.1mg/ml溶液,再将溶液置于转速为10000rpm离心机内离心,获得初步提取液;
步骤4):按质量份数,将600份偶联了Oligo(dT)的磁珠用600份水洗涤两次,加入300份步骤3)获得的初步提取液,重置磁珠,置于室温条件下反应10min,用磁性分离器进行磁性分离,使得磁珠沉淀,固液分离,在磁性分离器上用移液器将上清液弃去;再加入300份水,混匀磁珠,用磁性分离器进行磁性分离,在磁性分离器上用移液器移取上清液弃去,重复两次;继续加入200份水,混匀磁珠,置于100℃水浴加热30min,快速置于磁性分离架上,进行磁性分离,快速用移液器移取上清液弃去,获得虫草素溶液,蒸干溶液,可以获得粉末状高纯度虫草素。
最后,需要注意的是,本发明不限于以上实施例,还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种蛹虫草活性组分的分离纯化方法,其特征在于,该方法采用如下步骤:
步骤1):将蛹虫草置于50-70℃条件下烘干至蛹虫草含水量在8%以下,超微粉碎5-15min,获得超微蛹虫草粉;
步骤2):将步骤1)获得的超微蛹虫草粉加入到浓度为75-100%的乙醇溶液中,充分搅拌溶解,超声30-60min,静置1-12h,置于转速为8000-10000rpm离心机内离心获取上清液,重复1-2次,合并上清液;步骤2)中所述超微蛹虫草粉与浓度为75-100%的乙醇质量比为1:5-20;
步骤3):将步骤2)合并的上清液旋干获得固体,将固体置于烧杯中,缓慢加入蒸馏水溶解,并充分搅拌,获得浓度为0.9-1.1mg/ml溶液,再将溶液置于转速为8000-10000rpm离心机内离心,获得初步提取液;
步骤4):按质量份数,将400-600份偶联了Oligo(dT)的磁珠用400-600份水洗涤两次,加入100-300份初步提取液,重置磁珠,置于室温条件下反应5-10min,用磁性分离器进行磁性分离,在磁性分离器上用移液器将上清液弃去;再加入100-300份水,混匀磁珠,用磁性分离器进行磁性分离,在磁性分离器上用移液器移取上清液弃去,重复两次;继续加入50-200份水,混匀磁珠,置于65-100℃水浴加热5-30min,快速置于磁性分离架上,进行磁性分离,快速用移液器移取上清液弃去,获得虫草素溶液。
2.一种蛹虫草活性组分的分离纯化方法,其特征在于,该方法采用如下步骤:
步骤1):将蛹虫草置于60℃条件下烘干至蛹虫草含水量在8%以下,超微粉碎10min,获得超微蛹虫草粉;
步骤2):将步骤1)获得的超微蛹虫草粉加入到浓度为85%的乙醇溶液中,充分搅拌溶解,超声45min,静置8h,置于转速为9000rpm离心机内离心获取上清液,重复1次,合并上清液;
步骤3):将步骤2)合并的上清液旋干获得固体,将固体置于烧杯中,缓慢加入蒸馏水溶解,并充分搅拌,获得浓度为1.0mg/ml溶液,再将溶液置于转速为9000rpm离心机内离心,获得初步提取液;
步骤4):按质量份数,将500份偶联了Oligo(dT)的磁珠用500份水洗涤两次,加入200份初步提取液,重置磁珠,置于室温条件下反应8min,用磁性分离器进行磁性分离,在磁性分离器上用移液器将上清液弃去,加入200份水,混匀磁珠,用磁性分离器上进行磁性分离,在磁性分离器上用移液器移取上清弃去,重复两次,加入125份水,混匀磁珠,置于80℃水浴加热18min,快速置于磁性分离架上,进行磁性分离,快速用移液器移取上清液弃去,获得虫草素溶液。
3.根据权利要求2所述的一种蛹虫草活性组分的分离纯化方法,其特征在于:步骤2)中所述超微蛹虫草粉与浓度为85%的乙醇质量比为1:8。
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