CN107258790A - 用于增强植物生长的壳寡糖和方法 - Google Patents

用于增强植物生长的壳寡糖和方法 Download PDF

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Abstract

公开了增强植物生长的方法，其包括用有效量的至少一种壳寡糖处理植物种子或由种子萌发的植物，其中，与未经处理的植物或者从未经处理的种子收获的植物相比较，在收获时上述植物表现出按蒲式耳/英亩测得的植物产量的增加、根数目增加、根长度增加、根质量增加、根体积增加和叶面积增加中的至少一种。

Description

用于增强植物生长的壳寡糖和方法
本申请是申请号为201280057455.6、申请日为2012年9月24日、名称为“用于增强植物生长的壳寡糖和方法”的发明专利申请的分案申请。
背景技术
革兰氏阴性土壤菌根瘤菌科(Rhizobiaceae)和慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)与豆科植物例如大豆之间的共生有较多文献记载。这些关系的生化基础包括分子信号传导的交换，其中，植物对细菌的信号化合物包括黄酮、异黄酮和黄烷酮类，而细菌对植物的信号化合物包括慢生根瘤菌和根瘤菌nod基因表达的终产物，称为脂壳寡糖(LCO)。这些细菌与豆科植物之间的共生使得豆科植物能够固定大气中的氮以用于植物生长，由此免去对氮肥的需求。由于氮肥会显著增加作物的成本，并且与许多污染效应相关，农产业继续努力运用这种生物关系并开发新的用于提高植物产量而不增加氮类肥料的使用的试剂和方法。
美国专利第6,979,664号教导了增强植物作物的种子萌发或出苗的方法，包括以下步骤：提供包括有效量的至少一种脂壳寡糖和农业上合适的载体的组合物，以及在种子或幼苗的紧邻处以相较于未经处理的种子或幼苗能增强种子萌发或出苗的有效量施用该组合物。
关于该概念的进一步拓展在WO 2005/062899中有过教导，其涉及至少一种植物诱导剂(即LCO)与杀真菌剂、杀虫剂或其组合的结合，以增强植物特性如植物挺立(plantstand)、生长、活力(vigor)和/或产量。教导称这些组合物和方法适用于豆科植物和非豆科植物，并且可以用于处理种子(临种植前)、幼苗、根或植物。
相似地，WO 2008/085958教导了用于在豆科植物和非豆科植物中增强植物生长和作物产量的组合物，其包含LCO与另一种活性剂如几丁质或壳聚糖、类黄酮化合物、或除草剂的组合，其可以同时或相继地施用于种子和/或植物。与在'899公开中的情况一样，'958公开教导了在临种植前对种子进行处理。
最近，Halford，“Smoke Signals”，Chem.Eng.News(2010年4月12日)第37～38页报道，在森林起火后，烟中所含的卡里金(karrikins)或丁烯羟酸内酯起到生长刺激剂的作用并促使种子萌发，并且能滋补已储存的种子如玉米、蕃茄、莴苣和洋葱。这些分子是美国专利第7,576,213号的主题。
然而，对于改进或增强植物生长的体系仍存在需求。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种增强植物生长的方法，其包括a)用有效量的至少一种壳寡糖(CO)来处理(例如，施用于)植物种子或由种子萌发的植物，其中，与未经处理的植物或者从未经处理的种子收获的植物相比较，在收获时上述植物表现出按蒲式耳/英亩测量的植物产量增加、根数目增加、根长度增加、根质量增加、根体积增加和叶面积增加中的至少一种。
在一些实施方式中，使用至少两种CO。在一些实施方式中，对种子的处理包括将至少一种CO直接施用于种子，然后可以将其进行种植或者在种植之前储存一段时间。对种子的处理还可以包括间接处理，例如，通过将至少一种CO引入至土壤中(在本领域中称为犁沟内施用(in-furrow application))。在再其他的实施方式中，例如，经由叶喷，可以将至少一种CO施用于由种子萌发的植物。该方法还可以包括使用其他的农艺学有益的试剂，例如，微量营养物；脂肪酸及其衍生物；(CO以外的)植物信号分子，例如脂壳寡糖、(CO以外的)几丁质化合物、类黄酮、茉莉酸及其衍生物、亚油酸及其衍生物、亚麻酸及其衍生物和卡里金(karrikins))；除草剂、杀真菌剂和杀虫剂；以及解磷微生物、固氮细菌(根瘤菌接种物)和/或菌根真菌。
本发明的方法同样适用于豆科植物和非豆科植物。在一些实施方式中，豆科种子是大豆种子。在一些其它实施方式中，经处理的种子是非豆科种子，例如大田作物种子，例如，谷类如玉米，或者蔬菜作物种子，例如马铃薯。
如工作实施例所说明，其总结了温室中和田地中进行的实验，本发明的方法所取得的结果显示，将至少一种CO施用于种子或由种子萌发的植物，导致植物生长的增强。这些结果据信是出人意料的，特别是就以下观点而言：已知CO参与***获得性抗性(SAR)，但并非必要地参与植物生长的直接增强。本文所述的结果表明，在一些情形中，本发明的方法实现了与LCO所实现的植物生长增强基本上相等的效果，或者在一些情形中，胜过LCO所实现的植物生长增强。获自温室实验的结果在这一方面特别显著，在于其在基本上没有疾病的条件下进行。
附图说明
图1a和2a显示了可用于实施本发明的壳寡糖化合物(CO)的化学结构。
图1b和2b显示了与图1a和2a中的CO相应且也可用于实施本发明的脂壳寡糖化合物(LCO)的化学结构。
图3a和4a显示了可用于实施本发明的其他CO的化学结构。
图3b和4b显示了与图3a和3b中的CO相应且也可用于实施本发明的Myc-因子的化学结构。
图5中的柱状图显示了本发明的CO(图2a所示)与两种不同来源的图1b所示的LCO以及对照相比较在三种不同的浓度(10-7、10-8和10-9M)下处理蕃茄种子的效果，其以幼苗平均根长度表示。
图6中的柱状图显示了本发明的CO(图2a所示)与两种不同来源的图1b所示的LCO以及对照相比较在三种不同的浓度(10-7、10-8和10-9M)下处理蕃茄种子的效果，其以幼苗平均根鲜重表示。
图7中的柱状图显示了本发明的CO(图2a所示)与两种不同来源的图1b所示的LCO相比较在(三种浓度的)平均浓度下处理蕃茄种子的效果，其以幼苗平均根长度表示。
图8中的柱状图显示了本发明的CO(图2a所示)与两种不同来源的图1b所示的LCO相比较在(三种浓度的)平均浓度下处理蕃茄植物的效果，其以幼苗平均根鲜重表示。
图9中的柱状图显示了本发明的CO(图2a所示)与图2b所示的LCO以及对照相比较处理棉花植物的效果，其以每个幼苗的平均干重/处理剂表示。
图10(试验1)和图11(试验2)中的柱状图显示了图2a所示的CO与图2b所示的LCO以及由几丁质酶产生的(非本发明的)几丁质化合物的混合物相比较处理玉米种子的效果，其以地上部(shoot)、根部的平均干重和总干重(地上部和根部的组合干重)表示。
图12中的柱状图显示了图2a所示的CO与图2b所示的LCO、由几丁质酶产生的CO的混合物、异黄酮以及对照相比较处理大豆种子的效果，其以叶表面积表示。
图13中的柱状图显示了图2a所示的CO、图1b所示的LCO、异黄酮以及(经由酶促方法由壳聚糖得到的)非本发明的几丁质化合物的混合物处理大豆种子的效果，其以大豆植物的平均干重表示。
图14中的柱状图显示了图2a所示的CO单独或者与一种或两种脂肪酸组合与图2b所示的LCO以及水相比较对色拉豆根毛变形的效果，其以百分比表示。
图15中的图显示了图2a所示的CO单独或者与一种或两种脂肪酸组合与图2b所示的LCO以及水相比较处理油菜种子的效果，其以种子萌发的百分比表示。
图16中的图显示了图2a所示的CO单独或者与一种或两种脂肪酸组合与图2b所示的LCO以及水相比较处理小麦种子的效果，其以种子萌发的百分比表示。
图17中的图显示了图2a所示的CO单独或者与一种或两种脂肪酸组合与图2b所示的LCO以及水相比较处理苜蓿种子的效果，其以种子萌发的百分比表示。
图18中的饼状图显示了图2a所示的CO单独或者与一种或两种不同脂肪酸组合与图2b所示的LCO以及水相比较处理玉米种子的效果，其以种子萌发的百分比表示。
图19中的图显示了图2a所示的CO单独或者与两种不同脂肪酸之一组合与图2b所示的LCO、每种单独的脂肪酸以及对照相比较处理玉米种子的效果，其以种子萌发的百分比表示。
图20中的图显示了图2a所示的CO单独或者与两种不同脂肪酸之一组合、CO加两种脂肪酸与图2b所示的LCO以及对照相比较处理小麦种子的效果，其以种子萌发的百分比表示。
图21中的柱状图显示了图2a所示的CO单独或者与四种不同脂肪酸之一组合与图2b所示的LCO以及水相比较处理箭舌豌豆(vicia sativa)种子的效果，其以种子萌发的百分比表示。
图22中的柱状图显示了图2a所示的CO单独或者与两种不同脂肪酸之一组合与图2b所示的LCO以及对照相比较处理箭舌豌豆根部的效果，其以平均根长度表示。
图23中的柱状图显示了图2a所示的CO单独或者与两种不同脂肪酸之一组合与图2b所示的LCO以及水相比较处理绿豆、扁豆、红扁豆和红三叶草种子的效果，其以种子萌发的百分比表示。
图24中的柱状图显示了图2a所示的CO单独或者与两种不同脂肪酸之一组合与图2b所示的LCO以及水相比较对蕃茄幼苗生长的效果，其以平均根长度表示。
图25中的柱状图显示了图2a所示的CO单独或者与两种不同脂肪酸之一组合与图1b所示的LCO相比较对大豆种子的效果，其以平均胚根长度表示。
图26中的柱状图显示了图2a所示的CO与图2b所示的LCO以及水相比较处理棉花种子的效果，其以平均植物干重表示。
图27中的柱状图显示了图2a所示的CO与图1b所示的LCO以及由几丁质酶产生的CO混合物相比较处理大豆植物的效果，其以平均植物干生物质表示。
图28中的柱状图显示了图2a所示的CO单独或者与图2b所示的LCO组合与图2b所示的LCO以及水相比较处理玉米种子的效果，其以平均植物干重表示。
图29中的柱状图显示了图2a所示的CO单独或者与图2b所示的LCO组合与图2b所示的LCO以及水相比较处理高粱种子的效果，其以平均幼苗根长度表示。
图30中的柱状图显示了图2a所示的CO单独或者与微量营养物组合与水相比较处理棉花植物的效果，其以平均叶绿素含量表示。
图31中的柱状图显示了图2a所示的CO单独或者与微量营养物组合与水相比较处理棉花植物的效果，其以平均植物干重表示。
具体实施方式
壳寡糖
本领域已知CO是β-1-4连接的N-乙酰基葡糖胺结构，其识别为几丁质寡聚体，也识别为N-乙酰基壳寡糖。CO具有独特且不同的侧链修饰，这使得它们与几丁质分子[(C8H13NO5)n，CAS No.1398-61-4]和壳聚糖分子[(C5H11NO4)n，CAS No.9012-76-4]不同。参见，例如，Hamel等人,Planta 232:787-806(2010)(例如，图1显示了几丁质、壳聚糖、Nod因子(LCO)和相应的CO(其缺少18C、16C或20C酰基)的结构)。本发明的CO与几丁质和壳聚糖相比较也是相对溶于水的，且在一些实施方式中，如下文所述，是五聚的。描述可适用于本发明的CO的结构和制造的代表性文献如下：Muller等人,Plant Physiol.124:733-9(2000)(例如，本文图1)；Van der Holst等人,Current Opinion in Structural Biology,11:608-616(2001)(例如，本文图1)；Robina等人,Tetrahedron58:521-530(2002)；D'Haeze等人,Glycobiol.12(6):79R-105R(2002)；Rouge等人,Chapter 27,"The MolecularImmunology of Complex Carbohydrates"in Advances in Experimental Medicine andBiology,Springer Science；Wan等人,Plant Cell 21:1053-69(2009)；PCT/F100/00803(9/21/2000)；和Demont-Caulet等人,Plant Physiol.120(1):83-92(1999)。
就结构而言CO与LCO的不同之处主要在于其缺少脂肪酸侧链。源自根瘤菌的CO及其非天然出现的合成衍生物可以用于实施本发明，其可以由下式表示：
其中R1和R2各自独立地表示氢或甲基；R3表示氢、乙酰基或氨甲酰基；R4表示氢、乙酰基或氨甲酰基；R5表示氢、乙酰基或氨甲酰基；R6表示氢、阿糖基、岩藻糖基、乙酰基、硫酸酯、3-0-S-2-0-MeFuc、2-0-MeFuc和4-0-AcFuc；R7表示氢、甘露糖基或甘油；R8表示氢、甲基或-CH2OH；R9表示氢、阿糖基或岩藻糖基；R10表示氢、乙酰基或岩藻糖基；并且n表示0、1、2或3。相应的根瘤菌LCO的结构描述于以下文件中：D'Haeze等人,见上。
图1a和2a中显示了两种适用于本发明的CO。它们分别相应于慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)和豌豆根瘤菌蚕豆生物变异型(Rhizobium leguminosarumbiovar viciae)产生的与大豆和豌豆共生相互作用的LCO，但缺少脂肪酸链。图1b和2b中显示了这些根瘤菌产生的相应LCO(其也可用于实施本发明)。
可适用于实施本发明的再其他的CO的结构很容易由获得(即分离和/或纯化)自菌根真菌，例如Glomerocycota种群的真菌如根内球囊菌(Glomus intraradices)的LCO得到。参见，例如WO 2010/049751和Maillet等人,Nature 469:58-63(2011)(本文所述的LCO也称作“Myc因子”)。代表性的源自菌根真菌的CO由以下结构表示：
其中n＝1或2；R1表示氢或甲基；并且R2表示氢或SO3H。图3a和4a分别显示了两种适用于本发明的其他CO，一种是硫酸化的，另一种是非硫酸化的。它们相应于由菌根真菌Glomas intraradices产生的两种不同LCO，其显示于图3b和4b中(并且也可用于实施本发明)。
CO可以是合成的或重组的。合成CO的制备方法描述于，例如以下文献中：Robina,见上。例如使用大肠杆菌(E.coli)作为宿主制造重组CO的方法是本领域已知的。参见，例如，Dumon等人,ChemBioChem 7:359-65(2006)；Samain等人,Carbohydrate Res.302:35-42(1997)；Cottaz等人,Meth.Eng.7(4):311-7(2005)；和Samain等人,J.Biotechnol.72:33-47(1999)(例如，本文图1中显示了可以在带有基因nodBCHL的不同组合的大肠杆菌中重组制备的CO的结构)。出于本发明的目的，至少一种CO与几丁质、壳聚糖和其它使用几丁质作为起始原料酶促制备的壳寡糖在结构上是不同的。
出于本发明的目的，至少一种重组CO为至少60％纯，例如，至少60％纯，至少65％纯，至少70％纯，至少75％纯，至少80％纯，至少85％纯，至少90％纯，至少91％纯，至少92％纯，至少93％纯，至少94％纯，至少95％纯，至少96％纯，至少97％纯，至少98％纯，至少99％纯，直至100％纯。
可以将种子用至少一种CO以若干种方式例如喷射或滴液处理。喷射和滴液处理可以通过以下方法进行：在通常性质为水性的农业可接受的载体中配制有效量的至少一种CO，并经由连续处理***(其校正为以与种子的连续流成比例的预定速率施用处理)例如鼓式(drum-type)处理机将组合物喷射或滴在种子上。这些方法有利地采用相对少量的载体，以使得处理过的种子相对快速地干燥。以该方式，可以有效地处理大量的种子。也可以采用批次***，其中将预定批量大小的种子和信号分子组合物输送至混合器中。进行这些方法的***和装置可购于许多供应商，例如，Bayer CropScience(Gustafson)。
在另一实施方式中，处理需要将种子用至少一种CO涂覆。一种这样的方法涉及以下步骤：将圆形容器的内壁用组合物涂覆，加入种子，然后转动容器，以使种子与壁和组合物接触，该方法在本领域中称作“容器涂覆”。可以通过涂覆方法的组合对种子进行涂覆。浸泡通常需要使用含有植物生长增强剂的水溶液。例如，可以将种子浸泡大约1分钟至大约24小时(例如，至少1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、40分钟、80分钟、3小时、6小时、12小时、24小时)。一些类型的种子(例如，大豆种子)倾向于对湿气敏感。因此，将这些种子长时间浸泡可能是不合意的，在该情况下浸泡通常进行大约1分钟至大约20分钟。
在施用至少一种CO之后需要将种子储存的实施方式中，在储存期间的任意部分时间内，CO对种子的附着并不是关键性的。无意拘泥于任何具体的操作理论，申请人认为，即使是处理不会导致在处理之后以及在任意部分的储存期间植物信号分子与种子表面保持接触的程度，CO也可以通过称作种子记忆或种子感知的现象实现其预期的效果。参见，Macchiavelli等人,J.Exp.Bot.55(408):1635-40(2004)。申请人还认为，处理之后CO朝着发育中的幼根扩散，并使共生和发育基因活化，这导致植物根结构的变化。尽管至合意的程度，含有CO的组合物还可以含有粘着剂或涂覆剂。出于美学目的，组合物还可以含有涂覆聚合物和/或着色剂。
至少一种CO的量对于增强生长是有效的，使得与未经处理的植物或者从未经处理的种子收获的植物(任一是活性的)相比较，在收获时植物表现出按蒲式耳/英亩测得的植物产量的增加、根数目增加、根长度增加、根质量增加、根体积增加和叶面积增加中的至少一种。用于处理种子的至少一种CO的有效量以浓度单位表示，其范围通常为大约10-5至大约10-14M(摩尔浓度)，且在一些实施方式中，为大约10-5至大约10-11M，且在一些其他的实施方式中，为大约10-7至大约10-8M。以重量单位表示时，有效量的范围通常为大约1至大约400μg/英担(cwt)种子，且在一些实施方式中，为大约2至大约70μg/cwt，且在一些其他的实施方式中，为大约2.5至大约3.0μg/cwt种子。
出于直接处理种子即犁沟内处理的目的，至少一种CO的有效量范围通常为大约1μg/英亩至大约70μg/英亩，且在一些实施方式中，为大约50μg/英亩至大约60μg/英亩。出于施用于植物的目的，CO的有效量范围通常为大约1μg/英亩至大约30μg/英亩，且在一些实施方式中，为大约11μg/英亩至大约20μg/英亩。
种子可以在临种植之前或者在种植时用至少一种CO加以处理。种植时的处理可以包括如上所述直接施用于种子，或者在一些其他的实施方式中，通过将活性物质引入到土壤中进行，其在本领域中称作犁沟内处理。在需要在处理种子之后储存的实施方式中，然后可以根据标准技术将种子包装在，例如，50-lb或100-lb的袋子或散装袋或容器中。在本领域已知的适当储存条件下，种子可以储存至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，甚至更久，例如，13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36个月，或者更久。尽管大豆种子可能必须在下一季种植，玉米种子可以储存长得多的时间，包括3年以上。
其他农艺学有益的试剂
本发明还可以包括将种子或由种子萌发的植物用至少一种农业/农艺学有益的试剂处理。如本文所用，在本领域中，术语“农业或农业学有益的”是指当试剂施用于种子或植物时，导致与未经处理的种子或植物相比较，例如植物挺立、生长(例如，如关于CO所定义)或活力的植物特性的增强(其在统计学上可以是显著的)。可以将这些试剂与至少一种CO配置在一起，或者经由单独的制剂施用于种子或植物。可用于实施本发明的这类试剂的代表性例子包括微量营养物(例如，维生素和痕量矿物质)、脂肪酸及其衍生物、(CO以外的)植物信号分子、除草剂、杀真菌剂和杀虫剂、解磷微生物、固氮生物(根瘤菌接种物)和/或菌根真菌。
微量营养物
可用于实施本发明的代表性的维生素包括泛酸钙、叶酸、生物素和维生素C。可用于实施本发明的痕量矿物质的代表性例子包括硼、氯、锰、铁、锌、铜、钼、镍、硒和钠。
用于处理种子的至少一种微量营养物的量以浓度单位表示时，范围通常为10ppm至100ppm，且在一些实施方式中，为大约2ppm至大约100ppm。以重量单位表示时，有效量范围通常在一个实施方式中为大约180μg至大约9mg/英担(cwt)种子，且在一些实施方式中，当施用于叶子时，为大约4μg至大约200μg/植物。换言之，出于处理种子的目的，至少一种微量营养物的有效量范围通常为30μg/英亩至大约1.5mg/英亩，且在一些实施方式中，当在叶子上施用时，为大约120mg/英亩至大约6g/英亩。
脂肪酸
可用于实施本发明的代表性的脂肪酸包括作为天然出现的LCO上的取代基的脂肪酸，例如硬脂酸和棕榈酸。其他可以使用的脂肪酸包括饱和C12-18脂肪酸，其(除棕榈酸和硬脂酸以外)包括月桂酸和肉豆蔻酸，以及不饱和C12-18脂肪酸，例如肉豆蔻油酸、棕榈油酸、sapienic acid、油酸、反油酸、异油酸(vaccenic acid)、亚油酸、亚麻酸和反亚油酸(linoelaidic acid)。亚油酸和亚麻酸在茉莉酸(其如下文中所述，也是出于本发明目的的农艺学有益的试剂)的生物合成过程中产生。亚油酸和亚麻酸(及其衍生物)据报道是nod基因表达或根瘤菌产生LCO的诱导物。参见，例如，Mabood,Fazli,"Linoleic and linolenicacid induce the expression of nod genes in Bradyrhizobium japonicum,"USDA3,2001年5月17日。
可用于实施本发明的可以使用的脂肪酸衍生物包括酯、酰胺、糖苷和盐。代表性的酯是其中脂肪酸例如亚油酸和亚麻酸的羧基已被-COR基团取代的化合物，其中R是-OR1基团，其中R1为：烷基，例如C1-C8直链或支链烷基，例如甲基、乙基或丙基；烯基，例如C2-C8直链或支链烯基；炔基，例如C2-C8直链或支链炔基；具有例如6-10个碳原子的芳基；或具有例如4-9个碳原子的杂芳基，其中杂芳基中的杂原子可以是，例如，N、O、P或S。代表性的酰胺是其中脂肪酸例如亚油酸和亚麻酸的羧基已被-COR基团取代的化合物，其中R是NR2R3基团，其中R2和R3独立地为：氢；烷基，例如C1-C8直链或支链烷基，例如甲基、乙基或丙基；烯基，例如C2-C8直链或支链烯基；炔基，例如C2-C8直链或支链炔基；具有例如6-10个碳原子的芳基；或具有例如4-9个碳原子的杂芳基，其中杂芳基中的杂原子可以是，例如，N、O、P或S。酯可以通过已知的方法制备，例如酸催化的亲和加成，其中在催化量无机酸的存在下使羧酸与醇反应。酰胺也可以通过已知的方法制备，例如，通过在中性条件下在偶联剂例如二环己基碳二亚胺(DCC)的存在下使羧酸与适当的胺反应。适当的脂肪酸例如亚油酸和亚麻酸的盐包括，例如，碱加成盐。可以用作制备这些化合物的代谢可接受碱盐的碱包括源自阳离子例如碱金属阳离子(例如钾和钠)和碱土金属阳离子(例如钙和镁)的那些碱。这些盐可以很容易地通过将脂肪酸溶液与碱溶液混合在一起制备。盐可以从溶液中沉淀出来，并通过过滤收集，或者可以通过其他方式例如蒸发溶剂来回收。
脂肪酸或其衍生物的量通常为至少一种CO的量的大约10％至大约30％，且在一些实施方式中为大约25％。
植物信号分子
本发明还可以包括将种子或植物用CO以外的植物信号分子处理。出于本发明的目的，术语“植物信号分子”可以与“植物生长增强剂”互换地使用，其泛泛地指任何植物或微生物中天然出现的或合成的(其可以是非天然出现的)直接或间接活化植物生化途径的试剂，与未经处理的植物或从未经处理的种子收获的植物相比较，其导致植物生长增加，其至少在以下方面中的至少一种是可测量的：按蒲式耳/英亩测得的产量增加、根数目增加、根长度增加、根质量增加、根体积增加和叶面积增加。可用于实施本发明的植物信号分子的代表性例子包括脂壳寡糖、(CO以外的)几丁质化合物、类黄酮、茉莉酸、亚油酸和亚麻酸及其衍生物(同上)、和卡里金。
脂壳寡糖化合物(LCO)在本领域也称作共生Nod信号或Nod因子，其由在非还原端处缩合有N-连接的脂肪酰链的β-l,4-连接的N-乙酰基-D-葡糖胺(“GIcNAc”)残基的寡糖骨架组成。LCO的不同在于骨架中GIcNAc残基的数目，在于脂肪酰链的长度和饱和度，以及在于还原和非还原糖残基的取代。参见，例如，Denarie等人,Ann.Rev.Biochem.65:503-35(1996)；Hamel等人,同上；Prome等人,Pure&Appl.Chem.70(1):55-60(1998)。LCO的例子如以下式I所示：
其中：
G是己糖胺，其可以是取代的，例如，在氮上被乙酰基取代，在氧上被硫酸基、乙酰基和/或醚基取代，
R1、R2、R3、R5、R6和R7可以相同或不同，其表示H、CH3CO-、CxHyCO-(其中x是0-17的整数且y是1-35的整数)、或者任何其他酰基，例如，如氨甲酰基，
R4表示含有至少12个碳原子的单-、二-或三不饱和脂族链，且n是1-4的整数。
LCO可以获得(分离和/或纯化)自细菌，例如根瘤菌，如根瘤菌(Rhizobium sp.)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)、中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)和固氮根瘤菌(Azorhizobium sp.)。LCO结构对于每种这样的细菌物种来说是特征性的，并且每种菌株均可以产生具有不同结构的多种LCO。例如，来自草木樨中华根瘤菌(S.meliloti)的特定LCO也已描述于美国专利5,549,718，其具有式II：
其中R表示H或CH3CO-，且n等于2或3。
再更多具体的LCO包括NodRM、NodRM-1和NodRM-3。当乙酰化时(R＝CH3CO-)，其分别变成AcNodRM-1和AcNodRM-3(美国专利5,545,718)。
来自慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)的LCO描述于美国专利5,175,149和5,321,011中。泛泛地，其为包括甲基岩藻糖的戊糖类植物激素。描述了若干种这类源自慢生型大豆根瘤菌的LCO：BjNod-V(C18:1)；BjNod-V(AC，C18:1)；BjNod-V(C16:1)；和BjNod-V(AC，C16:0)，“V”表示存在有5个N-乙酰基葡糖胺；“Ac”表示乙酰化；“C”后面的数字表示脂肪酸侧链中的碳的数目；且“:”后面的数字表示双键的数目。
本发明的实施方式中使用的LCO可以获得(即分离和/或纯化)自产生LCO的细菌菌株，例如固氮根瘤菌、慢生型根瘤菌(包括慢生型大豆根瘤菌)、中慢生根瘤菌(Mesorhizobium)、根瘤菌(包括豌豆根瘤菌(R.leguminosarum))、中华根瘤菌(包括草木樨中华根瘤菌)的菌株，以及基因工程改造成产生LCO的菌株。
LCO是豆科植物共生中宿主特异性的主要决定因素(Diaz等人,Mol.Plant-Microbe Interactions 13:268-276(2000))。因此，在豆科家族内，特定属和物种的根瘤菌与特定的豆科宿主发展出共生的固氮关系。这些植物-宿主/细菌组合描述于Hungria等人,Soil Biol.Biochem.29:819-830(1997)中，这些细菌/豆科植物共生伙伴关系的例子包括草木樨中华根瘤菌/苜蓿和草木樨；豌豆根瘤菌蚕豆生物变异型(R.leguminosarum biovarviciae)/豌豆和小扁豆；豌豆根瘤菌菜豆生物变异型(R.leguminosarum biovarphaseoli)/菜豆；大豆慢生根瘤菌/大豆；以及豌豆根瘤菌三叶草生物变异型(R.leguminosarum biovar trifolii)/红三叶草。Hungria还列出了根瘤菌物种的有效类黄酮Nod基因诱导物，以及由不同根瘤菌物种产生的特定的LCO结构。然而，LCO特异性仅需用来在豆科植物中建立结瘤。在实施本发明时，给定LCO的使用不限于对其共生豆科植物伙伴的种子进行处理，以便与从未经处理的种子收获的植物相比较，或者与从临种植之前或在种植一周或更短时间内用信号分子处理的种子收获的植物相比较，实现按蒲式耳/英亩测得的植物产量的增加、根数目增加、根长度增加、根质量增加、根体积增加和叶面积增加。
因此，通过进一步的例子，可用于实施本发明的LCO及其非天然出现的衍生物由下式表示：
其中R1表示C14:0、3OH-C14:0、iso-C15:0、C16:0、3-OH-C16:0、iso-C15:0、C16:1、C16:2、C16:3、iso-C17:0、iso-C17:1、C18:0、3OH-C18:0、C18:0/3-OH、C18:1、OH-C18:1、C18:2、C18:3、C18:4、C19:1氨甲酰基、C20:0、C20:1、3-OH-C20:1、C20:1/3-OH、C20:2、C20:3、C22:1和C18-26(ω-1)-OH(根据D'Haeze等人，同上，其包括C18、C20、C22、C24和C26羟基化物种以及C16:1Δ9、C16:2(Δ2,9)和C16:3(Δ2,4,9))；R2表示氢或甲基；R3表示氢、乙酰基或氨甲酰基；R4表示氢、乙酰基或氨甲酰基；R5表示氢、乙酰基或氨甲酰基；R6表示氢、阿糖基、岩藻糖基、乙酰基、硫酸酯、3-0-S-2-0-MeFuc、2-0-MeFuc和4-0-AcFuc；R7表示氢、甘露糖基或甘油；R8表示氢、甲基或-CH2OH；R9表示氢、阿糖基或岩藻糖基；R10表示氢、乙酰基或岩藻糖基；并且n表示0、1、2或3。该结构所包括的天然出现的根瘤菌LCO的结构描述于以下文献中：D'Haeze等人，同上。
通过再进一步其他的例子，图1b所示的获自慢生型大豆根瘤菌的LCO可以用于处理大豆以外的豆科种子以及非豆科种子，例如玉米。作为另一个例子，图2b所示的可获自豌豆根瘤菌的LCO(指定为LCO-V(C18:1)，SP104)也可以用于处理豌豆以外的豆科种子和非豆科植物。
本发明还包括获得(即分离和/或纯化)自菌根真菌例如球囊菌(Glomerocycota)种群的真菌(例如根内球囊霉(Glomus intraradicus))的LCO的应用。获自这些真菌的代表性LCO的结构描述于WO 2010/049751和WO 2010/049751(在此所述的LCO也称作“Myc因子”)。代表性的源自菌根真菌的CO及其非天然出现的衍生物由以下结构表示：
其中n＝1或2；R1表示C16、C16:0、C16:1、C16:2、C18:0、C18:1Δ9Z或C18:1Δ11Z；并且R2表示氢或SO3H。在一些实施方式中，LCO由菌根真菌产生，示于图3b和4b中。
本发明还包括合成LCO化合物例如WO 2005/063784中所述者以及通过基因工程产生的重组LCO的应用。基本的天然出现的LCO结构可以含有天然出现的LCO中发现的修饰或取代，例如以下文献中所述的那些：Spaink,Crit.Rev.Plant Sci.54:257-288(2000)；和D'Haeze等人,Glycobiology 12:79R-105R(2002)。用于构建LCO的前体寡糖分子(CO，如下文所述，在本发明中也可用作植物信号分子)也可以通过基因工程改造的有机体合成，例如，如以下文献中所述：Samain等人,Carbohydrate Res.302:35-42(1997)；Cottaz等人,Meth.Eng.7(4):311-7(2005)；和Samain等人,J.Biotechnol.72:33-47(1999)(例如，本文图1显示了可以在带有基因nodBCHL的不同组合的大肠杆菌中重组制备的LCO的结构)。
LCO可以以各种形式的纯度使用，并且可以单独使用或者以产生LCO的细菌或真菌的培养物的形式使用。例如，(可购自Novozymes BioAg Limited)含有产生图1b所示的LCO(LCO-V(C18:1，MeFuc)，MOR116)的慢生型大豆根瘤菌的培养物。提供基本上纯的LCO的方法包括简单地从LCO和微生物的混合物中除去微生物细胞，或者通过LCO溶剂相分离，然后是HPLC色谱，继续分离和纯化LCO分子，例如，如美国专利5,549,718中所述。纯化可以通过重复HPLC增强，并且纯化的LCO分子可以进行冷冻干燥，用以长期储存。可以使用如上所述的壳寡糖(CO)作为产生合成LCO的起始原料。出于本发明的目的，重组LCO为至少60％纯，例如，至少60％纯，至少65％纯，至少70％纯，至少75％纯，至少80％纯，至少85％纯，至少90％纯，至少91％纯，至少92％纯，至少93％纯，至少94％纯，至少95％纯，至少96％纯，至少97％纯，至少98％纯，至少99％纯，直至100％纯。
几丁质和壳聚糖是真菌细胞壁以及昆虫和甲壳纲动物外骨骼的主要组分，其也是由GIcNAc残基组成。几丁质化合物包括几丁质，(IUPAC：N-[5-[[3-乙酰基氨基-4,5-二羟基-6-(羟甲基)环氧乙烷-2-基]甲氧基甲基]-2-[[5-乙酰基氨基-4,6-二羟基-2-(羟甲基)环氧乙烷-3-基]甲氧基甲基]-4-羟基-6-(羟甲基)环氧乙烷-3-基]乙酰胺)，以及壳聚糖，(IUPAC：5-氨基-6-[5-氨基-6-[5-氨基-4,6-二羟基-2(羟甲基)环氧乙烷-3-基]氧基-4-羟基-2-(羟甲基)环氧乙烷-3-基]氧代-2-(羟甲基)环氧乙烷-3,4-二醇)。这些化合物可以购自，例如，Sigma-Aldrich，或者由昆虫、甲壳纲动物的壳或真菌细胞壁制备。几丁质和壳聚糖的制备方法是本领域已知的，且已经描述于以下文献中：例如，美国专利4,536,207(由甲壳纲动物的壳制备)；Pochanavanich等人,Lett.Appl.Microbiol.35:17-21(2002)(由真菌细胞壁制备)；和美国专利5,965,545(由蟹壳和市售壳聚糖的水解制备)。另外，参见，Jung等人,Carbohydrate Polymers 67:256-59(2007)；Khan等人,Photosynthetica 40(4):621-4(2002)。可以得到小于35％至大于90％去乙酰化的去乙酰化几丁质和壳聚糖，并且其涵盖很宽的分子量谱，例如，小于15kD的低分子量壳聚糖寡聚体和0.5-2kD的几丁质寡聚体；分子量为大约15OkD的“实用级”壳聚糖；和高达70OkD的高分子量壳聚糖。配制用于种子处理的几丁质和壳聚糖组合物也是市售的。市售产品包括，例如，(PlantDefense Boosters,Inc.)和BEYONDTM(Agrihouse,Inc.)。
类黄酮是具有通过三碳桥连接的两个芳香环通用结构的酚类化合物。类黄酮由植物产生，且具有许多功能，例如，作为有益的信号传导分子，以及作为针对昆虫、动物、真菌和细菌的保护。类黄酮的分类包括查耳酮、花青素、香豆素、黄酮、黄烷醇、黄酮醇、黄烷酮和异黄酮。参见，Jain等人,J.Plant Biochem.&Biotechnol.11:1-10(2002)；Shaw等人,Environmental Microbiol.11:1867-80(2006)。
可用于实施本发明的代表性的类黄酮包括染料木黄酮(genistein)、大豆甙元(daidzein)、芒柄花黄素(formononetin)、柚皮素、橙皮素、木樨草素(luteolin)和芹菜素(apigenin)。类黄酮化合物是市售的，例如，可购自Natland International Corp.,Research Triangle Park,NC；MP Biomedicals,Irvine,CA；LC Laboratories,Woburn MA。类黄酮化合物可以分离自植物或种子，例如，如美国专利5,702,752；5,990,291；和6,146,668中所述。类黄酮化合物还可以通过基因工程改造的有机体例如酵母产生，如以下文献中所述：Ralston等人,Plant Physiology137:1375-88(2005)。
茉莉酸(JA，[1R-[1α,2β(Z)]]-3-氧代-2-(戊烯基)环戊烷乙酸)及其衍生物(其包括亚油酸和亚麻酸(如上关于脂肪酸及其衍生物所述)，可以用于实施本发明。茉莉酸及其甲酯茉莉酸甲酯(MeJA)统称为茉莉酸酯，是在植物中天然出现的十八碳酸类(octadecanoid-based)化合物。茉莉酸由小麦幼苗的根部产生，并由真菌微生物例如可可球二孢菌(Botryodiplodia theobromae)和藤仓赤霉(Gibbrella fujikuroi)、酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))以及大肠杆菌(Escherichia coli)的致病性菌株和非致病性菌株产生。亚油酸和亚麻酸在茉莉酸的生物合成过程中产生。类似于亚油酸和亚麻酸，茉莉酸酯(及其衍生物)据报道是nod基因表达或根瘤菌产生LCO的诱导物。参见，例如，Mabood,Fazli,Jasmonates induce the expression of nod genes in Bradyrhizobiumjaponicum,2001年5月17日。
可用于实施本发明的可用的茉莉酸衍生物包括酯、酰胺、糖苷和盐。代表性的酯是其中茉莉酸的羧基已被-COR基团取代的化合物，其中R是-OR1基团，其中R1为：烷基，例如C1-C8直链或支链烷基，例如甲基、乙基或丙基；烯基，例如C2-C8直链或支链烯基；炔基，例如C2-C8直链或支链炔基；具有例如6-10个碳原子的芳基；或具有例如4-9个碳原子的杂芳基，其中杂芳基中的杂原子可以是，例如，N、O、P或S。代表性的酰胺是其中茉莉酸的羧基已被-COR基团取代的化合物，其中R是NR2R3基团，其中R2和R3独立地为：氢；烷基，例如C1-C8直链或支链烷基，例如甲基、乙基或丙基；烯基，例如C2-C8直链或支链烯基；炔基，例如C2-C8直链或支链炔基；具有例如6-10个碳原子的芳基；或具有例如4-9个碳原子的杂芳基，其中杂芳基中的杂原子可以是，例如，N、O、P或S。酯可以通过已知的方法制备，例如酸催化的亲和加成，其中在催化量无机酸的存在下使羧酸与醇反应。酰胺也可以通过已知的方法制备，例如，通过在中性条件下在偶联剂例如二环己基碳二亚胺(DCC)的存在下使羧酸与适当的胺反应。适当的茉莉酸的盐包括，例如，碱加成盐。可以用作制备这些化合物的代谢可接受碱盐的试剂的碱包括源自阳离子例如碱金属阳离子(例如钾和钠)和碱土金属阳离子(例如钙和镁)的那些碱。这些盐可以很容易地通过将亚油酸、亚麻酸或茉莉酸的溶液与碱溶液混合在一起制备。盐可以从溶液中沉淀出来，并通过过滤收集，或者可以通过其他方式例如蒸发溶剂来回收。
卡里金是插烯4H-吡喃酮，例如2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮，包括其衍生物和类似物。这些化合物的例子由以下结构表示：
其中，Z为O、S或NR5；R1、R2、R3和R4各自独立地为H、烷基、烯基、炔基、苯基、苄基、羟基、羟基烷基、烷氧基、苯氧基、苄氧基、CN、COR6、COOR＝、卤素、NR6R7或NO2；且R5、R6和R7各自独立地为H、烷基或烯基，或者其生物学可接受的盐。这些化合物的生物学可接受的盐的例子可以包括与生物学可接受的酸形成的酸加成盐，其例子包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐或硫酸氢盐、磷酸盐或磷酸氢盐、乙酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、葡糖酸盐；甲磺酸盐、苯磺酸盐和对甲苯磺酸。其它生物学可接受的金属盐可以包括与碱形成的碱金属盐，其例子包括钠盐和钾盐。该结构所包括的且可以适用于本发明的化合物的例子包括以下：3-甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R1＝CH3，R2、R3、R4＝H)、2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R1、R2、R3、R4＝H)、7-甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R1、R2、R4＝H，R3＝CH3)、5-甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R1、R2、R3＝H，R4＝CH3)、3,7-二甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R1、R3＝CH3，R2、R4＝H)、3,5-二甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R1、R4＝CH3，R2、R3＝H)、3,5,7-三甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R1、R3、R4＝CH3，R2＝H)、5-甲氧基甲基-3-甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R1＝CH3，R2、R3＝H，R4＝CH2OCH3)、4-溴-3,7-二甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R1、R3＝CH3，R2＝Br，R4＝H)、3-甲基呋喃并[2,3-c]吡啶-2(3H)-酮(其中Z＝NH，R1＝CH3，R2、R3、R4＝H)、3,6-二甲基呋喃并[2,3-c]吡啶-2(6H)-酮(其中Z＝N-CH3，R1＝CH3，R2、R3、R4＝H)。参见，美国专利7,576,213。这些分子也称为卡里金。参见，Halford，同上。
用于处理种子的至少一种植物信号分子的量以浓度单位表示时，其范围通常为大约10-5至大约10-14M(摩尔浓度)，且在一些实施方式中，为大约10-5至大约10-11M，且在一些其他的实施方式中，为大约10-7至大约10-8M。以重量单位表示时，有效量的范围通常为大约1至大约400μg/英担(cwt)种子，且在一些实施方式中，为大约2至大约70μg/cwt，且在一些其他的实施方式中，为大约2.5至大约3.0μg/cwt种子。
出于直接处理种子即犁沟内处理的目的，至少一种植物信号分子的有效量范围通常为大约1μg/英亩至大约70μg/英亩，且在一些实施方式中，为大约50μg/英亩至大约60μg/英亩。出于施用于植物的目的，至少一种植物信号分子的有效量范围通常为1μg/英亩至大约30μg/英亩，且在一些实施方式中，为大约11μg/英亩至大约20μg/英亩。
除草剂、杀真菌剂和杀虫剂
适当的除草剂包括苯达松(bentazon)、氟锁草醚(acifluorfen)、氯嘧磺隆(chlorimuron)、乳氟禾草灵(lactofen)、广灭灵(clomazone)、吡氟禾草灵(fluazifop)、草铵膦(glufosinate)、草甘膦(glyphosate)、稀禾定(sethoxydim)、咪唑乙烟酸(imazethapyr)、甲氧咪草烟(imazamox)、氟磺胺草醚(fomesafe)、氟烯草酸(flumiclorac)、灭草喹(imazaquin)和烯草酮(clethodim)。含有各种这些化合物的市售产品是很容易得到的。组合物中除草剂的浓度将通常与所标记的对于特定除草剂的使用比率相对应。
本文和本领域所用的“杀真菌剂”是杀灭或抑制真菌生长的试剂。如果相对于未经处理的群，使用杀真菌剂的处理引起(例如，土壤中的)真菌群的杀灭或真菌群的生长抑制，则本文所用的杀真菌剂针对特定真菌菌种“表现出活性”。根据本发明的有效杀真菌剂将适当地针对较广范围的病原体表现出活性，病原体包括但不限于疫霉属(Phytophthora)、丝核菌属(Rhizoctonia)、镰孢菌属(Fusarium)、腐霉菌属(Pythium)、拟茎点霉属(Phomopsis)或核盘菌属(Selerotinia)和层锈菌属(Phakopsora)及其组合。
市售杀真菌剂可适用于本发明。适当的市售杀真菌剂包括RIVAL或ALLEGIANCE FL或LS(Gustafson,Plano,TX)、WARDEN RTA(Agrilance,St.Paul,MN)、APRONXL、APRON MAXX RTA或RFC、MAXIM 4FS或XL(Syngenta,Wilmington,DE)、CAPTAN(Arvesta,Guelph,Ontario)和PROTREAT(Nitragin Argentina,Buenos Ares,Argentina)。这些和其他市售杀真菌剂中的活性成分包括，但不限于，咯菌腈(fludioxonil)、精甲霜灵(mefenoxam)、嘧菌酯(azoxystrobin)和甲霜灵(metalaxyl)。市售杀真菌剂最适合根据制造商的说明以推荐的浓度进行使用。
如果相对于未经处理的群，使用杀虫剂的处理引起昆虫群的杀灭或昆虫群的抑制，则本文所用的杀虫剂针对特定昆虫物种“表现出活性”。根据本发明的有效杀虫剂将适当地针对较广范围的昆虫表现出活性，昆虫包括但不限于，线虫、切根虫、蛴螬、玉米根虫、种蝇、跳甲、麦长蝽(chinch bugs)、蚜虫、叶甲、和椿象。
市售杀虫剂可适用于本发明。合适的市售杀虫剂包括CRUISER(Syngenta,Wilmington,DE)、GAUCHO和PONCHO(Gustafson,Plano,TX)。这些和其他市售杀虫剂中的活性成分包括噻虫嗪(thiamethoxam)、噻虫胺(clothianidin)和吡虫啉(imidacloprid)。市售杀虫剂最适合根据制造商的说明以推荐的浓度进行使用。
解磷微生物、固氮生物(根瘤菌接种物)和/或菌根真菌
本发明还可以包括将种子用解磷微生物处理。本文所使用的“解磷微生物”是能够增加植物可利用的磷量的微生物。解磷微生物包括真菌菌株和细菌菌株。在实施方式中，解磷微生物是形成孢子的微生物。
解磷微生物的非限制性例子包括选自不动杆菌属(Acinetobacter)、节杆菌属(Arthrobacter)、节丛孢属(Arthrobotrys)、曲霉属(Aspergillus)、固氮螺菌属(Azospirillum)、芽孢杆菌属(Bacillus)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、假丝酵母属(Candida)、金色单胞菌属(Chryseomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、正青霉属(Eupenicillium)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、克吕沃尔菌属(Kluyvera)、微杆菌属(Microbacterium)、毛霉属(Mucor)、拟青霉属(Paecilomyces)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、青霉属(Penicillium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、链孢囊菌属(Streptosporangium)、Swaminathania属、硫杆菌属(Thiobacillus)、孢圆酵母属(Torulospora)、弧菌属(Vibrio)、黄色杆菌属(Xanthobacter)和黄单胞菌属(Xanthomonas)的菌种。
解磷微生物的非限制性实例选自乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)、节杆菌(Arthrobacter sp.)、少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)、黑曲霉(Aspergillus niger)、曲霉菌(Aspergillussp.)、Azospirillum halopraeferans、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、越南伯克霍尔德菌(Burkholderia vietnamiensis)、克瑞斯假丝酵母(Candida krissii)、浅黄金色单胞菌(Chryseomonas luteola)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)、肠杆菌(Enterobacter sp.)、泰洛肠杆菌(Enterobacter taylorae)、微细正青霉(Eupenicilliumparvum)、微小杆菌(Exiguobacterium sp.)、克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)、栖冷克吕沃尔菌(Kluyvera cryocrescens)、微杆菌(Microbacterium sp.)、多枝毛霉(Mucorramosissimus)、蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepialid)、马昆德拟青霉(Paecilomycesmarquandii)、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)、胶质类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)、成团泛菌(Pantoea aglomerans)、扩展青霉(Penicillium expansum)、Pseudomonas corrugate、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、Pseudomonas lutea、草假单胞菌(Pseudomonas poae)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、平凡假单胞菌(Pseudomonas trivialis)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、链霉菌(Streptomyces sp.)、链孢囊菌(Streptosporangium sp.)、Swaminathania salitolerans、氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)、球有孢圆酵母(Torulospora globosa)、解蛋白弧菌(Vibrio proteolyticus)、敏捷黄色杆菌(Xanthobacter agilis)和野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)。
在具体实施方式中，解磷微生物是青霉属真菌的菌株。可用于实施本发明的青霉属真菌的菌株包括拜赖青霉(P.bilaiae，早先称为P.bilaii)、微白青霉(P.albidum)、桔灰青霉(P.aurantiogriseum)、产黄青霉(P.chrysogenum)、黄暗青霉(P.citreonigrum)、桔青霉(P.citrinum)、指状青霉(P.digitatum)、常现青霉(P.frequentas)、褐青霉(P.fuscum)、P.gaestrivorus、光孢青霉(P.glabrum)、灰黄青霉(P.griseofulvum)、纠缠青霉(P.implicatum)、微紫青霉(P.janthinellum)、淡紫青霉(P.lilacinum)、微黄青霉(P.minioluteum)、蒙大拿青霉(P.montanense)、黑青霉(P.nigricans)、草酸青霉(P.oxalicum)、P.pinetorum、嗜松青霉(P.pinophilum)、产紫青霉(P.purpurogenum)、P.radicans、放射青霉(P.radicum)、雷斯青霉(P.raistrickii)、皱褶青霉(P.rugulosum)、简青霉(P.simplicissimum)、离生青霉(P.solitum)、变幻青霉(P.variabile)、毡毛青霉(P.velutinum)、鲜绿青霉(P.viridicatum)、灰绿青霉(P.glaucum)、P.fussiporus和扩展青霉(P.expansum)。
在一个具体的实施方式中，青霉属菌种为拜赖青霉。在另一具体的实施方式中，拜赖青霉菌株选自ATCC 20851、NRRL 50169、ATCC22348、ATCC 18309、NRRL 50162(Wakelin等人,2004.Biol Fertil Soils40:36-43)。在另一具体的实施方式中，青霉菌种为P.gaestrivorus，例如，NRRL 50170(参见，Wakelin，同上)。
在一些实施方式中，使用多于一种的解磷微生物，例如，至少两种，至少三种，至少四种，至少五种，至少六种，其包括包括不动杆菌属、节杆菌属、节丛孢属、曲霉属、固氮螺菌属、芽孢杆菌属、伯克霍尔德氏菌属、假丝酵母属、金色单胞菌属、肠杆菌属、正青霉属、微小杆菌属、克雷伯氏菌属、克吕沃尔菌属、微杆菌属、毛霉属、拟青霉属、类芽孢杆菌属、青霉属、假单胞菌属、沙雷氏菌属、寡养单胞菌属、链霉菌属、链孢囊菌属、Swaminathania属、硫杆菌属、孢圆酵母属、弧菌属、黄色杆菌属和黄单胞菌属的任意组合，包括选自乙酸钙不动杆菌、不动杆菌、节杆菌、少孢节丛孢菌、黑曲霉、曲霉菌、Azospirillum halopraeferans、解淀粉芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、越南伯克霍尔德菌、克瑞斯假丝酵母、浅黄金色单胞菌、产气肠杆菌、阿氏肠杆菌、肠杆菌、泰洛肠杆菌、微细正青霉、微小杆菌、克雷伯氏菌、栖冷克吕沃尔菌、微杆菌、多枝毛霉、蝙蝠蛾拟青霉、马昆德拟青霉、浸麻类芽孢杆菌、胶质类芽孢杆菌、成团泛菌、扩展青霉、Pseudomonas corrugate、荧光假单胞菌、Pseudomonas lutea、草假单胞菌、恶臭假单胞菌、斯氏假单胞菌、平凡假单胞菌、粘质沙雷氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、链霉菌、链孢囊菌、Swaminathania salitolerans、氧化亚铁硫杆菌、球有孢圆酵母、解蛋白弧菌、敏捷黄色杆菌和野油菜黄单胞菌的一种菌种。
在一些实施方式中，相同菌种的两个不同菌株也可以组合，例如，使用青霉属的至少两个不同菌株。至少两个不同的青霉属菌株的组合使用具有以下优点。当施用于已经含有不溶性(或难溶性)磷酸盐的土壤时，与仅使用一个青霉属菌株相比，组合真菌菌株的使用将引起植物可摄取的磷的量的增加。与单独使用单个菌株相比，这进而可以引起磷酸盐摄取的增加和/或土壤中生长的植物的产量的增加。菌株的组合还使不溶性磷酸岩能够用作可利用磷量不足的土壤中的有效肥料。因此，在一些实施方式中，使用拜赖青霉的一个株菌和P.gaestrivorus的一个菌株。在其他实施方式中，两个菌株为NRRL 50169和NRRL50162。在另外的实施方式中，至少两个菌株为NRRL 50169和NRRL 50170。在另外的实施方式中，至少两个菌株为NRRL 50162和NRRL 50170
解磷微生物可以使用本领域技术人员已知的任何适当的方法制备，例如，使用合适的碳源进行固态或液体发酵。解磷微生物优选地以稳定孢子的形式制备。
在实施方式中，解磷微生物是青霉属真菌。根据本发明的青霉属真菌可以使用固态或液体发酵和合适的碳源而生长。青霉属分离物可以使用本领域技术人员已知的任何合适方法而生长。例如，真菌可以在例如马铃薯右旋糖琼脂或麦芽汁琼脂的固体生长介质上、或在含有合适的液体介质例如Czapek-Dox培养基或马铃薯右旋糖肉汤的烧瓶中进行培养。这些培养方法可以用于制备青霉菌接种物，该接种物用于处理(例如，涂覆)种子和/或施用于将要施用至土壤的农艺学可接受的载体。本说明书中使用的术语“接种物”意在指代任意形式的解磷微生物(真菌细胞、菌丝体或孢子，细菌细胞或细菌孢子)，其能够在温度、湿度等条件有利于真菌生长时在土壤上或土壤中增殖。
青霉属孢子的固态产生可以通过接种固体介质例如泥炭或蛭石类基质或谷物而实现，谷物包括但不限于燕麦、小麦、大麦或稻。对灭菌的介质(通过高压灭菌或辐照而实现)接种适当青霉菌的孢子混悬液(1x102～1x107cfu/ml)，并根据基质将湿度调节至20～50％。将材料在室温下孵育2～8周。孢子也可以通过液体发酵而产生(Cunningham等人,1990.Can J Bot.68:2270-2274)。液体产生可以通过在可以根据本领域标准步骤而确定的适当pH和温度条件下在任何合适的介质例如马铃薯右旋糖肉汤或蔗糖酵母提取物介质中培养真菌而实现。
可以直接使用所得材料，或者可以收获孢子，经离心浓缩，配制然后使用空气干燥、冷冻干燥、或流化床干燥技术进行干燥(Friesen等人,2005,Appl.Microbiol.Biotechnol.68:397-404)，以产生可润湿的粉末。然后将可润湿的粉末混悬于水中，施用于种子的表面，并使其在临种植前干燥。可润湿的粉末可以与其他种子处理(例如但不限于，化学种子处理)、载体(例如，滑石、粘土、高岭土、硅胶、高岭石)或聚合物(例如，甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮)结合使用。或者，合适的青霉菌的孢子混悬液可以施用于合适的与土壤相容的载体(例如，泥炭类粉末或颗粒)，达到适当的最终含水量。材料可以在使用前在室温下孵育，通常为大约1天至大约8周。
除用于培养解磷微生物的成分(包括例如以上在青霉属培养中提及的成分)外，解磷微生物可以使用其他农艺学可接受的载体进行配制。在本文中与“载体”关联使用的术语“农艺学可接受的”是指，任何可以用于将活性物输送至种子、土壤或植物的材料，并且优选载体能够添加(至种子、土壤或植物)而对植物生长、土壤结构、土壤排水等没有不利影响。合适的载体包括但不限于，小麦壳、糠、研磨的麦秸、泥炭类粉末或颗粒、石膏类颗粒和粘土(例如，高岭土、膨润土、蒙脱石)。当将孢子加至土壤时，颗粒制剂将是优选的。作为液体、泥炭或可润湿粉末的制剂将适用于涂覆种子。当用于涂覆种子时，材料可以与水混合，施用于种子并使其干燥。其他载体的例子包括湿化糠，将其干燥、过筛并施用至事先涂覆有粘合剂如***树胶的种子。在需要单一组合物形式的活性物质制剂的实施方式中，农艺学可接受的载体可以是水性的。
至少一种解磷微生物的量取决于种子或土壤的类型、作物植物的类型、磷源的量和/或土壤中存在的或向其添加的微量营养物的量等而变化。对于每个具体的情形，合适的量可以通过简单的试错法实验发现。通常，对于青霉属，例如，施用的量落入以下范围内：0.001-1.0Kg真菌孢子和菌丝体(鲜重)/公顷，或102-106集落形成单位(cfu)/种子(当使用涂覆的种子时)，或者在颗粒载体上施用1x106至1x1011集落形成单位/公顷。例如孢子形式的真菌细胞和载体可以添加到根水平处土壤的种子列中，或者可以在种植之前用于涂覆种子。
在例如需要使用解磷微生物的至少两个菌株，例如，两个青霉属菌株的实施方式中，可以将市售的肥料代替天然的磷酸岩(或者甚至与其一起)添加至土壤。磷源可以含有原产自土壤的磷源。在其他实施方式中，可以将磷源添加至土壤。在一个实施方式中，磷源是磷酸岩。在另一实施方式中，磷源是制成的肥料。市售的制成的磷酸盐肥料有许多种类型。一些常见的类型含有磷酸一铵(MAP)、三过磷酸钙(triple super phosphate，TSP)、磷酸氢二铵、普通过磷酸钙和多磷酸铵。所有这些肥料均通过在大规模肥料制造设施中对不溶性天然磷酸岩进行化学处理而制造，且产品昂贵。通过本发明，可以在仍保持自土壤摄取相同量磷的同时降低施用于土壤的这些肥料的量。
在进一步的实施方式中，磷源是有机的。有机肥料是指至少保证最小百分比的氮、磷酸盐和钾碱的源自天然来源的土壤改良剂。例子包括植物和动物副产品、岩石粉末、海草、接种物和调节剂。代表性的具体例子包括骨粉、肉粉、畜肥、堆肥、污泥或鸟粪。
当然也可以将其他肥料，例如氮源或其他的土壤改良剂与解磷微生物大约同时或者在其他时间添加至土壤，只要这些其他材料对真菌没有毒性即可。
固氮生物是将大气氮气固定成更可用的形式例如氨的细菌和古生菌。固氮生物的实例包括来自根瘤菌属(例如解纤维素根瘤菌(R.cellulosilyticum)、大田市根瘤菌(R.daejeonense)、菜豆根瘤菌(R.etli)、山羊豆根瘤菌(R.galegae)、高卢根瘤菌(R.gallicum)、贾氏根瘤菌(R.giardinii)、海南根瘤菌(R.hainanense)、洪特拉根瘤菌(R.huautlense)、木兰根瘤菌(R.indigoferae)、豌豆根瘤菌(R.leguminosarum)、黄土根瘤菌(R.loessense)、羽扇豆根瘤菌(R.lupini)、R.lusitanum、草木樨根瘤菌(R.meliloti)、蒙古根瘤菌(R.mongolense)、R.miluonense、岩黄芪根瘤菌(R.sullae)、热带根瘤菌(R.tropici)、居水根瘤菌(R.undicola)和/或杨凌根瘤菌(R.yanglingense))、慢生根瘤菌属(例如B.bete、B.canariense、埃氏慢生根瘤菌(B.elkanii)、B.iriomotense、大豆慢生根瘤菌(B.japonicum)、B.jicamae、辽宁慢生根瘤菌(B.liaoningense)、B.pachyrhizi和/或圆明慢生根瘤菌(B.yuanmingense))、固氮根瘤菌属(例如茎瘤固氮根瘤菌(A.caulinodans)和/或德贝莱纳固氮根瘤菌(A.doebereinerae))、中华根瘤菌属(例如S.abri、粘着中华根瘤菌(S.adhaerens)、美洲中华根瘤菌(S.americanum)、木本树中华根瘤菌(S.aboris)、费氏中华根瘤菌(S.fredii)、S.indiaense、柯斯帝中华根瘤菌(S.kostiense)、鸡眼草中华根瘤菌(S.kummerowiae)、苜蓿中华根瘤菌(S.medicae)、草木樨中华根瘤菌(S.meliloti)、墨西哥中华根瘤菌(S.mexicanus)、莫雷兰中华根瘤菌(S.morelense)、萨赫勒中华根瘤菌(S.saheli)、多宿主中华根瘤菌(S.terangae)和/或新疆中华根瘤菌(S.xinjiangense))、中慢生根瘤菌属(合欢中慢生根瘤菌(M.albiziae)、紫穗槐中慢生根瘤菌(M.amorphae)、查克中慢生根瘤菌(M.chacoense)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(M.ciceri)、华癸中慢生根瘤菌(M.huakuii)、百脉根中慢生根瘤菌(M.loti)、地中海中慢生根瘤菌(M.mediterraneum)、M.pluifarium、北方中慢生根瘤菌(M.septentrionale)、温带中慢生根瘤菌(M.temperatum)和/或天山中慢生根瘤菌(M.tianshanense))的细菌及其组合。在具体实施方式中，固氮生物选自大豆慢生根瘤菌、豌豆根瘤菌、草木樨根瘤菌、草木樨中华根瘤菌及其组合。在另一实施方式中，固氮生物是大豆慢生根瘤菌。在另一实施方式中，固氮生物是豌豆根瘤菌。在另一实施方式中，固氮生物是草木樨根瘤菌。在另一实施方式中，固氮生物是草木樨中华根瘤菌。
菌根真菌与维管植物的根形成共生关系，并因菌丝体相对较大的表面积提供例如对水和矿质营养的吸收能力。菌根真菌包括内生菌根真菌(也称作泡囊丛枝菌根(vesicular arbuscular mycorrhizae)、VAM、丛枝菌根(arbuscular mycorrhizae)、或AM)、外生菌根真菌或其组合。在一个实施方式中，菌根真菌是球囊菌门以及球囊霉(Glomus)属和巨孢囊霉(Gigaspora)属的内生菌根。在又一实施方式中，内生菌根是聚丛球囊霉(Glomus aggregatum)、Glomus brasilianum、明球囊霉(Glomus clarum)、沙漠球囊霉(Glomus deserticola)、幼套球囊霉(Glomus etunicatum)、集球囊霉(Glomusfasciculatum)、根内球囊霉(Glomus intraradices)、单孢球囊霉(Glomus monosporum)、或摩西球囊霉(Glomus mosseae)、珠状巨孢囊霉(Gigaspora margarita)的菌株或其组合。
菌根真菌的例子包括包括担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)和接合菌门(Zygomycota)的外生菌根。其它例子包括双色蜡蘑(Laccaria bicolor)、红蜡蘑(Laccaria laccata)、彩色豆马勃(Pisolithus tinctorius)、Rhizopogon amylopogon、Rhizopogon fulvigleba、浅黄根须腹菌(Rhizopogon luteolus)、Rhizopogon villosuli、光硬皮马勃(Scleroderma cepa)、黄硬皮马勃(Scleroderma citrinum)的菌株或其组合。
菌根真菌包括杜鹃花类菌根(ecroid mycorrhizae)、浆果莓类菌根(arbutoidmycorrhizae)、或水晶兰类菌根(monotropoid mycorrhizae)。丛枝和外生菌根与许多属于杜鹃花目的植物形成杜鹃花类菌根，而与一些杜鹃花目形成浆果莓类菌根和水晶兰类菌根。在一个实施方式中，菌根可以是优选子囊菌门的杜鹃花类菌根，例如石楠柔膜菌(Hymenoscyphous ericae)或树粉孢属真菌(Oidiodendron sp.)。在另一实施方式中，菌根还可以是优选担子菌门的浆果莓类菌根。在又一实施方式中，菌根可以是优选担子菌门的水晶兰类菌根。在又一实施方式中，菌根可以是优选丝核菌属的兰科菌根(orchidmycorrhiza)。
本发明的方法适用于豆科种子，其代表性例子包括大豆、苜蓿、花生、豌豆、小扁豆、菜豆和三叶草。本发明的方法也适用于非豆科种子，例如禾本科(Poaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、锦葵科(Malvaceae)、菊科(Asteraceae)、藜科(Chenopodiaceae)和茄科(Solonaceae)。非豆科种子的代表性例子包括大田作物例如玉米、稻、燕麦、黑麦、大麦和小麦、棉花和油菜，以及蔬菜作物例如马铃薯、蕃茄、黄瓜、甜菜、莴苣和甜瓜。
现将在以下非限定性实施例方面对本发明进行说明。除非另外指明，使用水作为对照(表示成“对照”或“CHK”)。
实施例
1-17：温室实验
实施例1：体外蕃茄幼苗根生长生物检定
将杂交蕃茄var.Royal Mounty的蕃茄种子用10％漂白剂溶液表面灭菌10分钟，然后用灭菌的蒸馏水漂洗3次。然后将种子在层式气流罩中干燥3小时。然后将种子置于固化的琼脂培养基上的陪替氏培养皿中，上述培养基含有各种浓度的不同来源的图1b所示的LCO(Darmstadt,Germany和Grenoble,France制造)(在实施例中也称作“大豆LCO”)和图2a所示的本发明的CO(在实施例中也称作“豌豆CO”或“CO-V”)。通过手持尺测量幼苗根部，且根部鲜重在第7天在微量天平上读取。生长研究在生长室中在22℃下进行。
如豌豆CO(本发明实施方式)和LCO(非本发明的、比较的)之间的比较所反映，当测量蕃茄幼苗根长度时豌豆CO比LCO表现得更好(在10-7M和10-9M下)或相等(在10-8M下)(图5)。在幼苗根部鲜重方面，豌豆CO在所有三个浓度水平下均胜过LCO(图6)。在增加根长度和鲜重方面，LCO和CO均显著优于对照幼苗。当对所有3种浓度下的平均根部生长进行作图时，似乎CO在增加蕃茄根部生长方面要显著优于LCO(图7和8)。
实施例2：棉花叶实验
种植棉花种子，且使其生长至V4阶段(4叶阶段)，然后喷以10-8图2b所示的LCO(在实施例中也称作“豌豆LCO”)和豌豆CO，然后使其生长至多4周，不时以Hoagland溶液浇灌。对照植物喷以水。
本发明实施方式(CO)取得的结果表明，CO和LCO(非本发明的、比较的)比起对照均显著增加了植物鲜重，但CO显示出的植物鲜重增加比起LCO更多1.14％。
实施例3：玉米种子处理
在温室中仅使用豌豆LCO、豌豆CO和通过酶促方法由壳聚糖得到的CO混合物(在结构上与豌豆CO不同，在实施例中也称作“China CO”)进行两组种子处理实验。将杂交玉米种子(92L90,Peterson Farm,USA)用处理溶液(10-8M)以3fl oz/100lbs种子的比率处理。将种子种植在含有1:1沙子:珍珠岩混合物的塑料盆中。使种子生长大约3-4周，然后将其收获，并测量其干重。
获自两组实验的结果表明，本发明(豌豆CO)比非本发明的比较的LCO表现出更大的地上部、根部和总生物质的增加。对于第一组试验，CO比LCO的干重增加为11.84％(图10)。在第二组试验中，CO比LCO的干重增加为12.63％(图11)。China CO也可以视作是豌豆CO的替代来源，其与非本发明的LCO相比较也表现出植物干重增加的增加。
实施例4：：用不同活性物质处理大豆
将大豆种子(Jung seed,var.8168NRR)用不同的活性分子处理。将种子以3fl oz/100lbs种子的液体剂量率处理。使种子干燥2小时，并将其在温室中种植在含有1:1沙子:珍珠岩混合物的塑料盆中。使幼苗生长4周，不时地施以液肥，然后收获植物。分离来自第二个三叶(从下往上)的中心小叶，并在WinRhizo扫描仪上测量表面积。植物的剩余部分用于植物干重(DW)。
获自实验的结果说明，非本发明的豌豆LCO、本发明的豌豆CO和China CO表现出显著的叶表面积增加。但在这三种活性物质中，豌豆CO产生的叶表面积最高(显著高于对照(水))，且相对高于Chinese CO(图12)。在另一组实验中，就地上部或根部或植物总生物质而言，CO产生的植物干重最高。因此，很明显，通过CO增加生物质要优于大豆LCO或任何其他处理(包括作为对照的水和作为单独的植物信号分子的异黄酮(图13))。
实施例5：根毛变形生物检定
色拉豆(Macroptelium atropurpureum)种子在陪替氏平皿中在湿滤纸上萌发。当幼苗根部为大约1英寸长时，将其从幼苗割断，并在试管中在暗处用2ml 10-8M处理溶液处理4小时。处理时间结束后，将溶液用刚果红染色10分钟。之后在化合物显微镜下观察根片段，以对在根片段的最敏感的区域中变形的根毛数目进行计数。另外，使用红三叶草以与以上色拉豆类似的方式进行根毛变形生物检定，且仅进行视觉观察，并以文本形式记录。
LCO和CO溶液二者均在根片段中诱导根毛变形(图14)。CO和脂肪酸(硬脂酸或棕榈酸)组合也表现出根毛变形，CO加棕榈酸以及CO加棕榈酸和硬脂酸二者在数字上比LCO或CO提供更好的根毛变形。总体上，在根毛变形反应方面CO等于LCO。加入棕榈酸提高了变形反应。对照或CHK用蒸馏水处理。
红三叶草中的根毛变形模式对于CO来说比起LCO要好得多且突出。CO组合棕榈酸或硬脂酸具有与LCO类似的变形模式。总体上，在红三叶草中CO是最好的根毛变形剂。
实施例6：油菜和小麦种子萌发
在陪替氏平皿中在以10-9M处理溶液润湿的湿滤纸上，铺上油菜和小麦种子以进行萌发。铺好18小时后，与豌豆LCO相比较，豌豆CO诱导更多的油菜和小麦种子萌发。在21-24小时的时间内，LCO和CO的种子萌发率持平。实验显示，CO相对于LCO诱导早期萌发(图15和16)。
实施例7：苜蓿种子萌发
在陪替氏平皿中在含有豌豆LCO和豌豆CO处理溶液(10-8M)的湿滤纸上使苜蓿(Medicago sativa)种子萌发，并将陪替氏平皿在室温(22℃)下在暗处放置。20和27小时之后，观察种子的萌发。在20小时时，对照、LCO和CO之间萌发率没有差异，但在27小时时，CO比对照和LCO多萌发6％。这表明，豌豆LCO可能对苜蓿种子没有效果，但豌豆CO相对于对照和豌豆LCO对于种子萌发有正面影响(图17)。
实施例8：陪替氏平皿中玉米和小麦种子的萌发
将玉米和小麦种子铺在滤纸上含有5ml处理溶液的陪替氏平皿中。将玉米种子置于湿滤纸上进行萌发。类似地，将小麦种子(春小麦)置于陪替氏平皿中。铺好5天后，观察玉米和小麦种子萌发的幼苗。收获根部，并通过WinRhizo***测量其长度。
在玉米中，豌豆LCO、豌豆CO和CO组合棕榈酸显示出萌发增加(图18)，且相对于对照也显著增加了幼苗根长度。它们的效果在统计学上没有差异，CO组合棕榈酸对于萌发和根长度来说最高。棕榈酸与CO的组合添加似乎相对于LCO或CO略微有益(并非在统计学上)(图19)。在小麦中，CO通过产生更长的根而胜过LCO。在小麦中通过LCO和CO的根长度增加并非在统计学上显著，但一致地更大(图20)。
实施例9：箭舌豌豆(Vicia sativa)种子萌发
将箭舌豌豆种子铺在滤纸上含有5ml处理溶液的陪替氏平皿中。24小时后对22℃下的种子萌发进行计数，且在第5天时用WinRhizo***测量幼苗的根长度。
在萌发实验中，使用豌豆LCO和豌豆CO与4种不同的脂肪酸组合。发现单独的CO或者与棕榈酸或硬脂酸组合的CO诱导早期种子萌发。在陪替氏平皿中铺好1天后，CO比对照和LCO多萌发25％(图21)。当测量根长度时，只有LCO和CO组合棕榈酸相对于对照显著增加了幼苗的根长度(图22)。
实施例10：多种作物中的种子萌发
与上述的种子萌发实验类似，将不同作物的种子置于各自含有5ml液体的陪替氏平皿中的湿滤纸上。然后将具有种子的陪替氏平皿在22℃下在暗处放置。24小时之后(除了扁豆(Lab Lab)为30小时以外)，观察种子的萌发。
豌豆CO的总体种子萌发优于豌豆LCO。在四种作物中(绿豆、扁豆、红扁豆和红三叶草)，CO在除红扁豆以外的三种作物中显示出更好的萌发(图23)。CO加上棕榈酸在绿豆和红三叶草中诱导的萌发最高。LCO仅对于红扁豆来说优于CO或CO加棕榈酸。
实施例11：蕃茄幼苗的根部生长
在陪替氏平皿种子萌发法中，将蕃茄Var.Royal Mounty种子置于浸透有5ml处理溶液的湿滤纸上。在22℃下且在暗处5天之后，通过WinRhizo***测量蕃茄的幼苗根部生长。
与水对照相比，豌豆LCO、豌豆CO和豌豆组合脂肪酸均显示出根长度的增加。CO的平均幼苗根长度优于LCO，但是并非显著性地更好。CO组合棕榈酸或脂肪酸显著增加了蕃茄幼苗的根长度(图24)。实施例12：大豆种子处理
将大豆种子(Pioneer 9oM80)铺在陪替氏平皿中浸透有5ml处理溶液的湿育苗纸上，上述处理溶液含有水或大豆LCO、豌豆CO和CO加上脂肪酸。48小时后分离幼苗根部，并测量其长度。
相对于对照和CO，LCO显示出更好的种子根部生长增强，但表现出胚根长度显著增加的是CO加硬脂酸或棕榈酸。CO本身对于大豆比LCO更不有效，但脂肪酸棕榈酸或硬脂酸与CO的组合添加可进一步增强幼苗胚根生长(图25)。
实施例13：棉花种子处理
将棉花种子用LCO和CO 10-8M处理溶液以3fl oz/100lbs种子的剂量率处理。次日，将种子种植在含有1:1沙子:珍珠岩混合物的塑料盆中。使种子在温室中生长4周，然后将其收获。
对照、LCO和CO在棉花植物干重方面没有显著性差异。但是，CO相对于对照和LCO产生相对较高的植物干重。CO相对于对照增加的植物总干重为3.29％(图26)。
实施例14：用不同活性物质处理大豆叶
将大豆植物(Jung seed,var.8168NRR)在V4生长阶段用不同的活性分子处理。植物在温室中在含有1:1沙子:珍珠岩混合物的塑料盆中由种子生长。使幼苗生长4周，不时地施以液肥，然后收获植物。
大豆LCO、豌豆CO或China-CO的叶施用对植物干生物质增加没有显著影响(图27)。对于LCO、CO和China-CO中每一种的生物质相对高于对照植物，活性物质等效。
实施例15：玉米种子施用
将玉米种子用豌豆CO(10-8M)和豌豆LCO(10-8、10-9M)的各种组合处理。将种子种植在温室中的含有1:1沙子:珍珠岩混合物的塑料盆中。种植后10天收获幼苗，将其洗涤干净，然后在烘箱中在60℃下干燥48小时。
如图28所示，单独的CO(10-8M)(指定为CO8)和LCO(10-8M)(指定为SP8)二者均增加了玉米幼苗干重。只有10-9LCO/10-8CO组合相比于豌豆LCO(SP)或豌豆CO增加了玉米幼苗干重。
实施例16：陪替氏平皿中的高粱种子萌发
高粱种子在含有液体处理溶液的陪替氏平皿中萌发。5天之后收获幼苗，并使用WinRHIZO扫描仪对其根部进行测量。如图29所示，豌豆CO(10-8M)和豌豆LCO(10-8M)二者均增加了幼苗根长度，并且相比于单独的CO或LCO的增加，10-8CO和10-9LCO的组合增加幼苗根长度更多。
实施例17：棉花叶施用
棉花植物在温室中的含有沙子:珍珠岩1:1混合物的塑料盆中由种子生长。当幼苗处于V-阶段时，将其用豌豆CO(10-8M)和CO加上各自为微量的微量营养物(泛酸Ca和硼酸)叶喷。
处理之后4周收获植物。在收获之前，通过SPAD叶绿素计对叶子的绿度进行测量。如图30和31所示，与对照相比，CO显著增加了叶子的绿度，并在平均植物干重方面产生数字上的增加，并且CO和微量营养物的组合处理实现了更高的增加。
18-20：田地试验
实施例18：大豆
进行19组田地试验，以在应用于大豆叶子时对本发明的实施方式在谷物产量方面进行评价。田地试验在具有不同土壤特性和环境条件的8个状态下进行。
试验中使用的处理剂为对照(水)、纯CO(壳寡糖)—CO-V(图2a所示)和纯LCO(脂壳寡糖)—SP104(图2b所示)。CO和LCO处理剂为8x 10-8摩尔浓度，导致施用12μg/英亩。采用不同的市售大豆品种。将处理剂加入到草甘膦除草剂中，并在植物营养生长阶段V4-V5喷在叶子上。将4盎司/英亩处理剂与除草剂和水合并，并以5-10加仑/英亩的比率施用。大豆生长至成熟，收获，并测定谷物产量。
结果显示于表1中。
表1
如对照与CO之间的比较所反映，产量通过叶CO处理提高了1.7bu/A，导致相比于对照增加3％，且在试验中出现68.4％的正产量提高。
与叶LCO反应相比较，CO平均产量低0.1bu/A，但相对于对照百分比产量增加相同，且百分比正产量提高相同。因此，CO和LCO二者作为叶处理剂提供了基本上相等的产量提高。
实施例19：玉米
进行16组田地试验，以在应用于玉米叶子时对本发明的实施方式在谷物产量方面进行评价。田地试验在具有不同土壤特性和环境条件的8个状态下进行。
试验中使用的处理剂为对照(水)、纯CO(壳寡糖)—CO-V(图2a所示)和纯LCO(脂壳寡糖)—SP104(图2b所示)。采用不同的市售玉米杂交体。将处理剂加入到草甘膦除草剂中，并在正常施用除草剂时喷在叶子上。将4盎司/英亩处理剂与除草剂加水合并，并以5-10加仑/英亩的比率施用。玉米生长至成熟，收获，并测定谷物产量。
表2
如对照与CO之间的比较所反映，产量通过叶CO处理提高了9.2bu/A，导致相比于对照增加4.8％，且在试验中出现93.8％的正产量提高。
与叶LCO反应相比较，CO平均产量为5.0bu/A更优，提供了高2.6％的产量增加，且具有正反应的试验为18.8％更优。
因此，CO和LCO二者作为叶处理剂均提供了产量提高，但CO的表现至少优于LCO两倍。
实施例20：玉米
进行10组田地试验，以在种植之前应用于玉米种子时对本发明的实施方式在谷物产量方面进行评价。5组田地试验在5种状态下进行，且5组试验在阿根廷进行。
试验中使用的处理剂为对照(水)、纯CO(壳寡糖)—CO-V(图2a所示)和纯LCO(脂壳寡糖)—SP104(图2b所示)。CO和LCO处理剂为1x 10-8摩尔浓度，导致以1μg/英亩施用。采用不同的市售玉米杂交体。在种植之前将3液盎司的处理剂施用于50磅种子。玉米生长至成熟，收获，并测定谷物产量。
结果示于表3中。
如对照与CO之间的比较所反映，产量通过CO处理剂的种子施用提高了6.5bu/A，导致相比于对照增加3.6％，且在试验中出现80.0％的正产量提高。
在比较CO和LCO时，CO平均产量少4.6bu/A，导致在对照之上少2.5％的产量增加，且在10组试验中少10.0％正产量反应。
CO和LCO处理剂二者在施用于玉米种子时均提供了在对照之上的产量提高，且LCO提供的反应最高。
该说明书中引用的所有专利和非专利出版物都是本发明所属领域技术人员技术水平的指示。在此将所有这些出版物并入作为参考，其程度如同每个单独的出版物或专利申请均具体、单独地指明并入作为参考。
尽管已经参考具体实施方式对本发明进行了描述，但应当认识到，这些实施方式仅仅是说明本发明的原理和应用。因此，应当理解到，可以在不偏离所附权利要求限定的本发明主旨和范围的情况下对说明性的实施方式进行许多种修改，并且可以设计出其他的方式。

Claims (20)

1.一种包含农业上可接受的载体中的至少一种几丁质寡聚体的组合物，
其中所述至少一种几丁质寡聚体以适合于增强植物生长和/或产量的量/浓度存在。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种几丁质寡聚体包含至少一种由下式表示的几丁质寡聚体：
其中R1表示氢或甲基；R2表示氢或甲基；R3表示氢、乙酰基或氨甲酰基；R4表示氢、乙酰基或氨甲酰基；R5表示氢、乙酰基或氨甲酰基；R6表示氢、阿糖基、岩藻糖基、乙酰基、硫酸酯、3-0-S-2-0-MeFuc、2-0-MeFuc或4-0-AcFuc；R7表示氢、甘露糖基或甘油；R8表示氢、甲基或-CH2OH；R9表示氢、阿糖基或岩藻糖基；R10表示氢、乙酰基或岩藻糖基；并且n表示0、1、2或3。
3.根据前述任意一项权利要求所述的组合物，其中所述至少一种几丁质寡聚体包含由下式表示的几丁质寡聚体：
其中n＝1或2；R1表示氢或甲基；并且R2表示氢或SO3H。
4.根据前述任意一项权利要求所述的组合物，其中所述至少一种几丁质寡聚体包含由下式表示的几丁质寡聚体：
5.根据前述任意一项权利要求所述的组合物，其中所述至少一种几丁质寡聚体包含由以下结构式表示的几丁质寡聚体：
6.根据前述任意一项权利要求所述的组合物，其中所述至少一种几丁质寡聚体包含由以下结构式表示的几丁质寡聚体：
7.根据前述任意一项权利要求所述的组合物，其中所述至少一种几丁质寡聚体包含由以下结构式表示的几丁质寡聚体：
8.根据前述任意一项权利要求所述的组合物，其中所述至少一种几丁质寡聚体以10-5～10-14摩尔范围的浓度存在。
9.根据前述任意一项权利要求所述的组合物，其中所述至少一种几丁质寡聚体以约10-5～10-11摩尔范围的浓度存在。
10.根据前述任意一项权利要求所述的组合物，其中所述至少一种几丁质寡聚体以约10-5～10-7摩尔范围的浓度存在。
11.根据前述任意一项权利要求所述的组合物，还包含至少一种脂壳寡糖。
12.根据前述任意一项权利要求所述的组合物，还包含至少一种几丁质。
13.根据前述任意一项权利要求所述的组合物，还包含至少一种壳聚糖。
14.根据前述任意一项权利要求所述的组合物，还包含至少一种类黄酮。
15.根据前述任意一项权利要求所述的组合物，还包含至少一种杀真菌剂、除草剂和/或杀昆虫剂。
16.根据前述任意一项权利要求所述的组合物，还包含至少一种解磷微生物。
17.根据前述任意一项权利要求所述的组合物，还包含至少一种固氮生物。
18.根据前述任意一项权利要求所述的组合物，其中所述至少一种几丁质寡聚体以适合于在土壤中种植并生长经所述组合物处理的植物种子时增加按蒲式耳/英亩测得的植物产量的浓度存在。
19.根据前述任意一项权利要求所述的组合物，其中所述植物种子在种植前至少一个月用所述组合物处理。
20.经权利要求1所述的组合物处理的植物种子。
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