CN107219317B - 一种快速测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布和杂质含量的方法 - Google Patents

一种快速测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布和杂质含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布和杂质含量的方法。本发明采用ACQUITY APC XT系列超高效凝胶柱，以甲醇为流动相，示差折光测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布，得到聚乙二醇衍生物的分子量；同时通过面积归一化法得到聚乙二醇衍生物的主成分和杂质的相对含量。本发明方法具有分辨率高、分析速度快的优点，最短可在5.3min内快速测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布，并能有效分离出其中的杂质，得到其主成分的纯度和杂质的含量。本发明为工艺研发和质量控制等提供了一种新的测定方法，具有良好的应用前景。

Description

一种快速测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布和杂质含量 的方法
技术领域
本发明属分析测试技术领域，更具体地说，本发明涉及一种聚合物分子量的凝胶渗透色谱(GPC)测定方法。
背景技术
聚乙二醇(PEG)衍生物在化妆品、制药、化工、食品加工等行业中均有广泛的应用，其分子量及纯度对产品的性能有很大影响。例如，聚乙二醇衍生物作为一种蛋白类药物的修饰剂，可以修饰蛋白药物，改善蛋白药物存在易被酶水解、循环半衰期短、免疫原性高及溶解度低等缺点，还可用于修饰其他药物以改善其性能(增加水溶性、延长半衰期等)，其分子量及其分布和杂质含量对修饰后的药物的功效有较大影响。因此，建立一种快速有效测定其分子量及其分布和杂质含量的方法至关重要。
聚合物分子量的测定方法主要有粘度法、红外光谱法、凝胶渗透色谱(GPC)法、基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)法、快原子轰击质谱(FAB-MS)法、核磁共振法等。其中，粘度法、红外光谱与核磁共振法无法得到分子量分布和聚合物纯度；而MALDI-TOF MS和FAB-MS质谱法的仪器昂贵，无法普及。GPC法不仅可以测定聚合物的相对分子量，同时可以得到分子量分布，并可根据GPC色谱峰面积大小测定杂质的相对含量，是测定高分子聚合物分子量的首选方法。
目前测定PEG衍生物分子量的方法较少，有待开发一种用于测定PEG衍生物分子量的快速高效并准确的方法。
发明内容
本发明的目的在于：克服现有技术中测定PEG衍生物分子量的方法较少的问题，提供一种新的测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布和杂质含量的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供了快速测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布和杂质含量的方法，其是采用ACQUITY APC XT系列超高效凝胶柱，以甲醇为流动相，示差折光测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布，得到聚乙二醇衍生物的分子量；同时通过面积归一化法得到聚乙二醇衍生物的主成分和杂质的相对含量。
具体地，本发明快速测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布和杂质含量的方法包括如下步骤：
(1)标准溶液的制备：取聚乙二醇标准品加入体积比为80:20～100:0的甲醇和水，室温放置24h，待聚乙二醇标准品完全溶解后，待用；
(2)样品溶液的制备：称取聚乙二醇衍生物样品50mg置于10mL容量瓶中，加入体积比为80:20～100:0的甲醇和水溶解定容后，待用；
(3)取步骤(1)得到的标准溶液，注入超高效聚合物***测定，以甲醇为流动相，得到标准溶液的超高效凝胶色谱图；以标准品的峰位分子量的对数为纵坐标，以淋洗体积为横坐标，得到标准校正曲线；
(4)取步骤(2)得到的样品溶液，注入超高效聚合物***测定，以甲醇为流动相，得到样品溶液的超高效凝胶色谱图；通过步骤(3)得到的标准校正曲线，利用凝胶色谱软件计算聚乙二醇衍生物样品的数均分子量、重均分子量及分子量分布系数；
(5)步骤(4)得到的样品溶液的超高效凝胶色谱图，通过峰面积积分、面积归一化计算，得到聚乙二醇衍生物样品中主成分和杂质的相对含量。
作为本发明快速测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布和杂质含量的方法的一种优选技术方案，步骤(1)和步骤(2)中，所述甲醇和水的体积比为95:5。
作为本发明快速测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布和杂质含量的方法的一种优选技术方案，步骤(2)中，所述样品溶液中聚乙二醇衍生物样品的浓度为4～6mg/mL。
作为本发明快速测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布和杂质含量的方法的一种更优选技术方案，所述样品溶液中聚乙二醇衍生物样品的浓度为5mg/mL。
作为本发明快速测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布和杂质含量的方法的一种优选技术方案，步骤(3)中，所述标准品为聚乙二醇，峰位分子量为200～500000Da。
作为本发明快速测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布和杂质含量的方法的一种优选技术方案，步骤(3)和步骤(4)中，所述超高效聚合物***的色谱柱是ACQUITY APCXT系列超高效凝胶柱，分子量量程为200～500000Da。
作为本发明快速测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布和杂质含量的方法的一种优选技术方案，所述ACQUITY APC XT系列超高效凝胶柱为两根或三根串联。
作为本发明快速测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布和杂质含量的方法的一种优选技术方案，步骤(3)和步骤(4)中，还添加水作为改善剂，且所述甲醇和水的体积比为90:10～98:2。
作为本发明快速测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布和杂质含量的方法的一种更优选技术方案，步骤(3)和步骤(4)中，所述甲醇和水的体积比为95:5。
相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明方法与现有方法相比，具有分辨率高的优点，能有效分离聚乙二醇衍生物的主成分与杂质，得到其纯度与杂质的相对含量；
(2)本发明方法与现有方法相比，具有分析速度快的优点，只需5.3min(两根超高效凝胶色谱柱串联)或8.5min(三根超高效凝胶色谱柱串联)即可检测一个聚乙二醇衍生物样品的相对分子量及其分布情况；
(3)传统的凝胶渗透色谱(GPC)法分为脂溶性和水溶性，使用的流动相通常是固定不变的，而且两者之间绝对不能互换或混用；脂溶性GPC法最常用的流动相是四氢呋喃(中等极性有机溶剂)或甲苯(非极性有机溶剂)；水溶性GPC法最常用的流动相是水溶液。因PEG衍生物易溶于水和较强极性有机溶剂，但水溶性GPC的色谱柱填料会与PEG衍生物作用导致柱效很快下降，故最好采用较强极性有机溶剂作为流动相和溶解样品的溶剂，而上述脂溶性的流动相又不合适。本发明方法采用新型的ACQUITY APC XT系列超高效凝胶柱，其填料为刚性的亚乙基桥杂化聚乙氧基硅烷颗粒，适用于有机溶剂体系；并且本发明根据聚乙二醇衍生物的溶解性，选择了较强极性有机溶剂甲醇作为溶解样品的溶剂和色谱流动相，并添加少量水作为改善剂，最终确定样品溶剂中甲醇:水的体积比为80:20～100:0，流动相中甲醇:水的体积比为90:10～98:2，可达到满意的效果。
附图说明
图1为聚乙二醇标准品的APC校正曲线图。
图2为聚乙二醇衍生物的APC分析色谱图。
图3为不同浓度(mg/mL)的聚乙二醇衍生物的APC色谱图。
图4为单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG_pALD)的APC分析色谱图。
图5为Y型聚乙二醇胺(Y-shape PEG-NH2)的APC分析色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。
实施例1
单甲氧基聚乙二醇丙醛(monomethoxy polyethylene glycol propyl aldehyde,mPEG_pALD)的分子量及其分布和杂质含量的测定，包括以下步骤：
1.1溶液配制
标准溶液的制备：分别取聚乙二醇(PEG)标准品2.0mg，其峰位分子量(Mp)分别为2010Da，3120Da，6240Da，8600Da，12000Da，23000Da，40000Da，230000Da，478000Da，加入1.5mL体积比为95:5的甲醇和水，室温放置24h，待标准品完全溶解后待测。
样品溶液的制备：称取mPEG_pALD样品50mg置于10mL容量瓶中，加入体积比为95:5的甲醇和水溶解定容，待测。
1.2实验条件
色谱条件：色谱柱：ACQUITY APC XT 450(4.6×150mm，2.5μm)，分子量量程：20000Da～400000Da；ACQUITY APC XT 200(4.6×150mm，2.5μm)，分子量量程：3000Da～70000Da；ACQUITY APC XT 45(4.6×150mm，1.7μm)，分子量量程：200Da～5000Da；三根色谱柱串联。柱温：40℃；流动相：体积比为95:5的甲醇和水；流速：0.5mL/min；示差折光检测器：40℃；进样量：10μL(图1～3)。
1.3标准曲线的建立
在上述色谱条件下，取标准溶液进行测定，以聚乙二醇标样的峰位分子量(Mp)的对数为纵坐标(logw)，以淋洗体积为横坐标(V)，用三阶方程拟合标准曲线。
1.4样品测定及结果
取样品溶液注入超高效聚合物***测定，得到样品溶液的超高效凝胶色谱图(图4)；通过标准曲线计算样品的数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)及分子量分布系数(D)，见表1。
表1不同PEG衍生物样品的检测结果
Figure BDA0001329463450000071
由面积归一化法可以得出杂质的相对含量，结果见表2。由表2可知，本方法测定mPEG_pALD主成分的含量为98.60％，RSD为0.0059％；杂质1的含量为1.32％，RSD为0.44％；杂质2的含量为0.073％，RSD为7.87％，说明本方法测定mPEG_pALD主成分和杂质含量的重复性良好。
表2 APC***测定mPEG_pALD主成分和杂质含量测定结果
Figure BDA0001329463450000082
实施例2
Y型聚乙二醇胺(Y-shape PEG-NH2)的分子量及其分布和杂质含量的测定，包括以下步骤：
2.1溶液配制
标准溶液的制备：分别取聚乙二醇(PEG)标准品2.0mg，其峰位分子量(Mp)分别为600Da，1500Da，2010Da，3120Da，6240Da，8600Da，12000Da，23000Da，40000Da，加入1.5mL体积比为90:10％的甲醇和水，室温放置24h，待标准品完全溶解后待测。
样品溶液的制备：称取Y型聚乙二醇胺样品40mg置于10mL容量瓶中，加入体积比为90:10的甲醇和水溶解定容，待测。
2.2实验条件
色谱条件：色谱柱：ACQUITY APC XT 200(4.6×150mm，2.5μm)，分子量量程：3000Da～70000Da；ACQUITY APC XT 45(4.6×150mm，1.7μm)，分子量量程：200Da～5000Da；两根色谱柱串联。柱温：40℃；流动相：体积比为90:10的甲醇和水；流速：0.5mL/min；示差折光检测器：40℃；进样量：10μL。
2.3标准曲线的建立
在上述色谱条件下，取标准溶液进行测定，以聚乙二醇标样的峰位分子量(Mp)的对数为纵坐标(logw)，以淋洗体积为横坐标(V)，用三阶方程拟合标准曲线。
2.4样品测定及结果
取样品溶液注入超高效聚合物***测定，得到样品溶液的超高效凝胶色谱图(图5)；通过标准曲线计算样品的数均分子量、重均分子量及分子量分布系数(见表1)；再通过峰面积归一化计算，得到样品中聚合物和杂质的相对含量，结果测得Y型聚乙二醇胺主成分含量为99.51％，杂质1含量为0.49％。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (6)

1.一种快速测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布和杂质含量的方法，其特征在于，采用ACQUITY APC XT系列超高效凝胶柱，以甲醇为流动相，示差折光测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布，得到聚乙二醇衍生物的分子量；同时通过面积归一化法得到聚乙二醇衍生物的主成分和杂质的相对含量；
包括如下步骤：
(1)标准溶液的制备：取聚乙二醇标准品加入体积比为80:20～100:0的甲醇和水，室温放置24h，待聚乙二醇标准品完全溶解后，待用；
(2)样品溶液的制备：称取聚乙二醇衍生物样品50mg置于10mL容量瓶中，加入体积比为80:20～100:0的甲醇和水溶解定容后，待用；
(3)取步骤(1)得到的标准溶液，注入超高效聚合物***测定，以甲醇为流动相，得到标准溶液的超高效凝胶色谱图；以标准品的峰位分子量的对数为纵坐标，以淋洗体积为横坐标，得到标准校正曲线；
(4)取步骤(2)得到的样品溶液，注入超高效聚合物***测定，以甲醇为流动相，得到样品溶液的超高效凝胶色谱图；通过步骤(3)得到的标准校正曲线，利用凝胶色谱软件计算聚乙二醇衍生物样品的数均分子量、重均分子量及分子量分布系数；
(5)步骤(4)得到的样品溶液的超高效凝胶色谱图，通过峰面积积分、面积归一化计算，得到聚乙二醇衍生物样品中主成分和杂质的相对含量；
步骤(1)和步骤(2)中，所述甲醇和水的体积比为95:5；
步骤(3)和步骤(4)中，所述的流动相是在甲醇中还添加水作为改善剂，且甲醇和水的体积比为95:5。
2.根据权利要求1所述的快速测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布和杂质含量的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述样品溶液中聚乙二醇衍生物样品的浓度为4～6mg/mL。
3.根据权利要求2所述的快速测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布和杂质含量的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述样品溶液中聚乙二醇衍生物样品的浓度为5mg/mL。
4.根据权利要求1所述的快速测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布和杂质含量的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述标准品为聚乙二醇，峰位分子量为200～500000Da。
5.根据权利要求1所述的快速测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布和杂质含量的方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)中，所述超高效聚合物***的色谱柱是ACQUITY APC XT系列超高效凝胶柱，分子量量程为200～500000Da。
6.根据权利要求5所述的快速测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布和杂质含量的方法，其特征在于，所述ACQUITY APC XT系列超高效凝胶柱为两根或三根串联。
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