CN107200713A

CN107200713A - 抗肿瘤化合物及其制备方法与用途

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Publication number: CN107200713A
Application number: CN201710434433.1A
Authority: CN
Inventors: 李艳霞; 刘卓; 冯敏; 张文涵; 刘文娟; 张赢; 张�杰; 张中和
Original assignee: First Affiliated Hospital of Dalian Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Dalian Medical University
Priority date: 2017-06-09
Filing date: 2017-06-09
Publication date: 2017-09-26

Abstract

本发明涉及抗肿瘤化合物及其制备方法与用途，该抗肿瘤化合物具体为式I所示的结构。本发明还涉及所述式I所示的化合物或其药学上可接受的盐，或含其药物组合物通过抑制EGFR、突变型EGFR^T790M表皮因子受体蛋白酪氨酸激酶和FAK黏着斑激酶进而***疾病，特别是用于治疗非小细胞肺癌、小细胞肺癌的用途；

Description

抗肿瘤化合物及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及抗肿瘤化合物及其制备方法与用途，具体而言，该抗肿瘤化合物为嘧啶类化合物，属于医药技术领域。

背景技术

蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTKs)通过控制细胞的信号传导通路调节细胞的生长、分化、凋亡等一系列生理生化过程。受体型酪氨酸激酶是一类横跨细胞膜相对较大的激酶，其具有配体结合的胞外结构域、跨膜结构域和起激酶作用—在磷酸化特定酪氨酸残基并且由此影响细胞增殖的胞内结构域。在一般人类癌症中(如肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、淋巴瘤)已发现所述激酶的异常表达。蛋白酪氨酸激酶已成为抗肿瘤药物研究开发的重要靶点之一。

表皮生长因子受体酪氨酸激酶(epidermal growth factor receptor tyrosinekinase，EGFR)是最早发现的蛋白酪氨酸激酶之一，EGFR的胞内区有ATP结合位点，EGFR抑制剂可以竞争性与ATP结合位点相结合，从而抑制EGFR的磷酸化过程，阻断下游信号的传导，进而抑制肿瘤细胞的生长、分化和转移(Yun,et al.Cancer Cell 2007,11,217-227)。EGFR作为抗肿瘤靶点的生化过程已被阐明，其晶体结构和活性部位也已比较清楚，以此为靶点的药物吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼(erlotinib)、阿法替尼(afatinib)等已经应用于临床，且随着EGFR结构和活性关系的深入研究，许多效果更佳优秀的EGFR抑制剂(EP0566226、WO9961428、WO0051587、WO0375947、WO0132651、WO9633980、WO9630347、US7709479、US6716847、US6593333、US6251912、CN201080060451.4、CN201110191525.4等)已被发现。然而这些药物不可避免地存在着抗耐药性差的问题。研究表明：790位点的苏氨酸到790位点的甲硫氨酸的突变(T790M)是此类药物产生耐药性的主要诱因。有临床案例数据显示，大约有60％的患者获得性耐药都源于T790M位点的突变所致。因此开发抗耐药性更强、毒性更小、活性更强的新型EGFR抑制剂具有非常重要现实价值。

AZD9291(Osimertinib)是口服不可逆的，T790M突变选择性EGFR抑制剂，在LoVo细胞中对外显子19位缺失的EGFR^L858R/T790M和EGFR^WT的IC₅₀分别为11.44和493.8nM，于2015年12被美国FDA批准上市(WO2013014448)用于治疗EGFR^T790M耐药型肺癌。CO-1686(Rociletinib,AVL-301)是另一种不可逆的，突变选择性EGFR^T790M抑制剂，在无细胞试验中作用于EGFR^T790M和EGFR^WT的IC₅₀分别为21.5nM和303.3nM，目前处于临床III期研究研究(WO2012061299)。其它如HM61713，EGF816，PF-06747775，Avitinib，ASP8273也是进入临床研究的新型EGFR抑制剂(Ma et al.,J.Med.Chem.,2016，DOI:10.1021/acs.jmedchem.5b00840.)，涉及的专利如：US20120157426、US8563568B2、CN102740847、CN102083800。

黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)是一种细胞内的非受体酪氨酸激酶，FAK是细胞内一种非受体酪氨酸激酶，参与胞内多条信号通路的传导。FAK在多种类型的肿瘤细胞中都出现表达量和活性上调现象，通过激酶依赖和非激酶依赖机制参与肿瘤细胞侵袭、转移、增殖、生长和抗凋亡等多个过程，是目前研究较多的抗肿瘤靶点之一。

鉴于治疗癌症的迫切需要，本领域有必要开发新型作用机制、且效果更佳良好的抗肿瘤药物。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一个抗肿瘤化合物或其药学上可接受的盐，该抗肿瘤化合物具体为含***啉的嘧啶类化合物，该类化合物具有良好的抗肿瘤活性。

本发明的另一目的在于提供前述抗肿瘤化合物的制备方法。

本发明的另一目的在于提供含所述含***啉的嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。

本发明的再一目的在于提供所述含***啉的嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐，或所述组合物的用途。

为此，一方面，本发明提供一种抗肿瘤化合物或其药学上可接受的盐，该抗肿瘤化合物具有式(I)所示的结构：

式(I)所示结构化合物为含***啉的嘧啶类化合物，命名为DM3001，本发明抗肿瘤活性筛选显示，该化合物具有强的抑制非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖能力，显示出比Rociletinib更加优良的抗EGFR^T790M活性，且能够作用于FAK激酶。作为一类结构新颖的分子，本发明中研究化合物具有开发成新型高效EGFR和FAK双靶点抑制剂的潜力，对治疗相关的肿瘤疾病尤其是非小细胞肺癌、小细胞肺癌有较大的应用价值。

前述式(I)所示的结构具有如下名称：

(I)N-[1-[[5-氯-2-[[4-[(4-***啉基)甲基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺。

另一方面，本发明提供前述抗肿瘤化合物的制备方法，该抗肿瘤化合物按如下路线制备：

本发明所述化合物由于它们在药物中的可能用途，式(I)所示化合物的盐优选药物可接受的盐。本发明的化合物为碱，其中所需盐形式可以通过本领域已知的合适方法制备，包括用无机酸处理游离碱，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或用有机酸处理游离碱、所述有机酸例如乙酸、三氟乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、羟基乙酸、水杨酸、吡喃糖苷酸(pyranosidyl acid)，例如葡糖醛酸或半乳糖醛酸，α-羟基酸，例如柠檬酸或酒石酸，氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸，芳香酸，例如苯甲酸或肉桂酸，磺酸，例如p-甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸等。药学上可接受的盐的实施例包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙酸盐(propiolates)、草酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐(phenylbutrates)、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、羟基乙酸盐、酒石酸盐、苦杏仁酸盐和磺酸盐、例如二甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐和萘-2-磺酸盐。

另一方面，本发明提供一种药物组合物，其含有有效剂量的本发明所述式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，及药用载体。

本发明的药物组合物通常含有一种本发明化合物。然而，在一些实施方案中，本发明的药物组合物含有超过一种本发明的化合物。另外，本发明的药物组合物还可任选包括一种或多种其它药学活性化合物。本发明所述含***啉的嘧啶类化合物或其药学上可接受的载体具有良好的抑制EGFR表皮因子受体酪氨酸激酶的活性，因此，本发明还提供所述含***啉的嘧啶类化合物或其药学上可接受的载体，或所述药物组合物在制备EGFR表皮因子受体酪氨酸激酶抑制剂中的应用。

本发明发现所述含***啉的嘧啶类化合物或其药学上可接受的载体具有良好的抑制FAK黏着斑激酶的活性，因此，本发明还提供所述含***啉的嘧啶类化合物或其药学上可接受的载体，或所述药物组合物在制备FAK黏着斑激酶抑制剂中的应用。

本发明还提供所述式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，或本发明所述的药物组合物在制备***的药物中的用途。优选地，所述肿瘤选自非小细胞肺癌、小细胞肺癌，进一步优选非小细胞肺癌。更优选地，所述用途主要通过抑制EGFR表皮因子受体蛋白酪氨酸激酶和FAK黏着斑激酶实现的。

附图说明

图1为不同处理组H1975，A431细胞DAPI染色情况。

图2为不同处理组H1975、A431细胞AO/EB染色情况。

图3为不同处理组H1975、A431细胞划痕和细胞迁移实验结果。

图4为DM3001在H1975(A)和A431(B)两种细胞中对EGFR下游相关信号蛋白表达的情况。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步描述解释本发明，但这些实施例并非意味着限制本发明的范围。

本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

实施例1目标分子的制备

薄层层析硅胶板使用烟台黄海GF254或青岛GF254硅胶板，薄层色谱法(TLC)使用的硅胺板采用的规格是0.15mm-0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm-0.5mm。

本发明使用的原料主要购自可购买自国药集团化学试剂有限公司，北京偶合科技有限公司、阿拉丁化学试剂有限公司、达瑞化学品等公司。

实施例中无特殊说明，溶液是指水溶液。

实施例中无特殊说明，反应的温度为室温，为20℃-30℃。

本发明采用的技术方案如下：

化合物(I)的合成路线.试剂及条件:(a)对硝基苯氨,DIPEA,1,4-二氧六环,rt,2h,91％；b)4-***啉基甲基苯胺,DIPEA,1,4-二氧六环,60℃,2h,49–72％；(c)Fe-NH₄Cl,MeOH-H₂O,80℃至rt,62–85％；(d)丙烯酰氯,NaHCO₃,丙酮,10min,43–68％。

I-b的合成

取I-a(23.44mmol)和DIPEA(4.5g,35.16mmol)于50mL二氧六环中，慢慢加入4-硝基苯胺(3.8g,23.44mmol)，升温60℃，反应5小时后，反应完毕，冷却，加入400mL水，析出黄白色固体，抽滤，烘干，得黄白色固体，未纯化直接下一步反应。

I-c的合成

取I-b(23.44mmol)和三氟乙酸(4.5g,35.16mmol)于2-BuOH(50ml)中，慢慢加入4-***啉基甲基苯胺(23.44mmol)，升温100℃，反应8小时后，反应完毕，冷却，倒入饱和碳酸氢钠溶液中，析出固体，抽滤，水洗，烘干硅胶柱层析分离，得浅褐色固体。

I-d的合成

取I-c(1.9g,6.8mmol)和氯化铵(0.73g,13.6mmol)于反应瓶，加入MeOH(15mL)和水(15mL)，搅拌下加入铁粉(1.5g,27.2mmol)，升温60℃反应2小时，趁热抽滤，水相用乙酸乙酯萃取(100mL×3)，合并乙酸乙酯层，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，减压蒸干得黄色半固体I-d。

目标物(I)的合成

取I-d(2.1g,9.7mmol)溶于20mL乙腈中，加入碳酸氢钠(1.6g,19.4mmol)，和甲基哌嗪(1.2g,11.64mmol)，升温60℃反应5小时，反应完毕后抽干溶剂，加水200mL，未析出固体，水相用乙酸乙酯萃取(100mL x 3)，合并乙酸乙酯层，饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，减压蒸干得目标分子(I)。

根据以上方法合成了目标分子，所合成目标分子的理化数据如下：

(I)N-[1-[[5-氯-2-[[4-[(4-***啉基)甲基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

产率40.8％；黄白色固体。¹H NMR(DMSO-d₆):δ10.20(s,1H),9.32(s,1H),8.96(s,1H),8.15(s,1H),7.91(s,1H),7.56(d,J＝8.4Hz,3H),7.31(d,J＝6.0Hz,2H),7.04(d,J＝8.4Hz,2H),6.48(dd,J＝17.2,10.4Hz,1H),6.27(dd,J＝16.8,2.0Hz,1H),5.76(dd,J＝10.0,2.0Hz,1H),3.55(br,4H),3.32(s,2H),2.29(s,4H).¹³C NMR(DMSO-d₆)δ163.6,158.2,156.7,155.3,139.8,139.7,139.6,139.3,132.4,130.6,129.4(2C),129.0,127.3,119.8,119.3(2C),115.8,104.2,66.7(2C),62.6,53.6(2C).HRMS(ESI)for C₂₄H₂₅ClN₆O₂,[M+H]⁺理论计算:465.1800,实测:465.1808。

目标分子成盐的方法

无机酸盐的制备方法：取目标分子(1mmol)溶于10mL无水甲醇中，冰浴下，慢慢滴加无机酸(1mmol)的5mL无水甲醇溶液，滴加完毕，于此温度下搅拌30分钟，然后常温蒸除甲醇，即得目标分子的无机酸盐。通过该方法制备了化合物I的盐酸盐(I-1)、氢溴酸盐(I-2)、硫酸盐(I-3)及磷酸盐(I-4)；

有机酸盐的制备方法：取目标分子(1mmol)溶于10mL无水甲醇中，冰浴下，慢慢滴加有机酸(1mmol)的5mL干燥***，滴加完毕，于此温度下搅拌30分钟，然后常温蒸除溶剂，即得目标分子的有机酸盐。通过该方法制备了化合物I的马来酸盐(I-5)、琥珀酸盐(I-6)及富马酸盐(I-7)。

实施例2目标分子生物活性评价

1、体外对受体酪氨酸激酶抑制活性测试方法

制备激酶检测缓冲液

①在室温融解激酶检测缓冲液(Kinase Detection Buffer)，观察是否有沉淀。

②如果出现沉淀，就在37℃孵育激酶检测缓冲液(Kinase Detection Buffer)15分钟并经常摇动，溶解沉淀。或者，小心吸走上清，去除沉淀。

制备激酶检测试剂

①使用前在室温平衡激酶检测缓冲液(Kinase Detection Buffe)和激酶检测底物(Kinase Detection Substrate)。

②将激酶检测缓冲液(Kinase Detection Buffer)全部倒进装有激酶检测底物(Kinase Detection Substrate)的棕色瓶中，使冻干粉底物溶解，这样就制成了激酶检测试剂。

③轻轻震荡、涡旋或颠倒混匀，成为均质溶液，底物应在1分钟内溶解。

④激酶检测试剂配好后应立即使用，或分装存于-20℃，配好的试剂经过几次冻融后循环信号活性都没有损失。

制作ATP转化成ADP的标准曲线

①用1×激酶反应缓冲液(kinase reaction buffer)稀释试剂盒提供的UltraPure ATP和ADP，制成900μL 50μM ATP和500μL 50μM ADP。

②将上一步配好的50μM ATP和50μM ADP溶液按表1所示在384孔板A1-A12中混合，模拟每个转化百分比的ATP和ADP的浓度，混合好。

表1.制备50μM系列ATP+ADP标准品

③每孔加入5μL的ADP-Glo^TM试剂来终止激酶反应。在室温孵育40分钟。

④每孔加入10μL激酶检测试剂(Kinase Detection Reagent)将ADP转化成ATP，并引进萤光素酶和萤光素来检测ATP。

⑤在室温孵育30-60分钟，用多功能酶标仪测量萤光并记录萤光值。

⑥绘制ATP转化成ADP的标准曲线。

确定激酶抑制物的IC₅₀值

①按照promega试剂盒说明书配制1×激酶反应缓冲液(kinase reactionbuffer)，2.5×50ng/μL激酶和2.5×0.5μg/μL底物和125μM ATP。

②在无酶对照孔中加入3μL 1×激酶反应缓冲液(kinase reaction buffer)，2μL2.5×0.5μg/μL底物和125μM ATP。在阴性对照孔中加入1μL 1×激酶反应缓冲液(kinasereaction buffer)，2μL 2.5×50ng/μL激酶，2μL 2.5×0.5μg/μL底物和125μM ATP。在测试孔中加入1μL 5×待测药物，2μL 2.5×50ng/μL激酶，2μL2.5×0.5μg/μL底物和125μM ATP。

③混合好平板，孵育60分钟。

④每孔加入5μL的ADP-Glo^TM试剂来终止激酶反应。在室温孵育40分钟。

⑤每孔加入10μL激酶检测试剂(Kinase Detection Reagent)将ADP转化成ATP，并引进萤光素酶和萤光素来检测ATP。在室温孵育30-60分钟，用多功能酶标仪测量萤光并记录萤光值。

⑥结果分析，结果是表2所示。

2、细胞生长实验(MTT检测法)

细胞接种：收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度,以每孔7x10³个细胞,每孔体积100μL接种到96孔板，每组设4个复孔(边缘孔用无菌PBS填充)；

细胞培养：细胞贴壁后，0％FBS RPMI-1640饥饿8h,对照组用10％FBS RPMI-1640培养,，37℃，5％CO₂培养箱中继续培养(按实验要求分别培养不同时间)；

呈色：三组细胞分别于培养72h后加入10μL MTT溶液(5mg/mL)，4h后终止培养，每孔加入100μL三联液，于摇床上低速振荡10min，使结晶充分溶解；

比色：在酶联免疫检测仪上测定各孔光度值(OD值)，选择570nm波长，以无细胞的即RPMl-1640培养液空白孔调零，测各孔的吸光度值。实验重复三次

记录结果：细胞生长抑制率＝(对照组吸光度值一实验组吸光度值)/对照组吸光度值×100％，细胞增殖率＝(实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100；

绘制细胞生长曲线：以时间为横坐标，抑制率/增殖率为纵坐标绘制细胞生长曲线。

在GraphPad软件中的GraphPad Prism作图软件中针对抑制剂浓度做图，以便由log[抑制剂]相对于反应，可变斜率模型估算出IC₅₀。

测试结果如表3所示，表2及表3显示所获得的化合物抗肿瘤细胞增殖中的活性效果^a。

表2

表3

a:H1975为EGFR^T790M突变细胞株，A431EGFR^WT细胞，HCC827为EGFR del E746_A750突变细胞株，HBE为人正常支气管上皮细胞.b:IC₅₀：半数有效抑制浓度.

3、细胞染色实验

3.1实验材料和试剂

H1975细胞，A431细胞，RAPI1640基础培养基，DMEM基础培养基(Hyclone公司，cat:SH30022.01B)，FBS胎牛血清(GIBCO公司，cat:16400-044)，双抗(北京夏斯生物科技有限公司，prospec cat:SV30010)，低速离心机(上海贝恩生物科技有限公司，cat:TDZ4B-WS)，CO₂培养箱(上海***，cat:BC-J160S)，超净工作台(上海***型号SW-CJ-2FD)，倒置荧光电子显微镜(Leica DMI3000B)，AO/EB双染试剂盒，DAPI试剂盒(碧云天)。

3.2实验方法

3.2.1细胞培养：常规扩大培养A431、H1975细胞，取对数生长期的细胞以2x10⁵cells/孔的密度接种于6孔板中；

3.2.2药物处理：于次日用不同浓度的药物(抑制剂)处理贴壁良好的细胞48小时；具体药物及使用浓度如下表4：

表4

3.2.3DAPI染色：弃去培养液，用PBS洗两次，每孔以1mL 4％多聚甲醛固定15min，弃去固定液后再用PBS洗一次；加入1μg/mL的DAPI染色液1mL/孔，37℃孵育5min，PBS清洗后用倒置荧光显微镜进行观察、拍照。结果如图1所示。

AO-EB染色

3.2.4细胞培养：常规扩大培养A431、H1975细胞，取对数生长期的细胞以2x10⁵cells/孔的密度接种于6孔板中；

3.2.5药物处理：于次日用不同浓度的药物(抑制剂)处理贴壁良好的细胞48小时；具体药物及使用浓度如下表5：

表5

3.2.6AO-EB染色：弃去培养液，用PBS洗两次，每孔以20μLAO-EB溶液(1μg/mL AO+1μg/mL EB in PBS)染色，倒置荧光显微镜下观察细胞各期凋亡、死亡等变化，拍照，结果如图2所示。

4、细胞迁移实验

4.1实验材料和试剂

H1975细胞，A431细胞，RAPI1640基础培养基，DMEM基础培养基(Hyclone公司，cat:SH30022.01B)，FBS胎牛血清(GIBCO公司，cat:16400-044)，双抗(北京夏斯生物科技有限公司，prospec cat:SV30010)，低速离心机(上海贝恩生物科技有限公司，cat:TDZ4B-WS)，CO₂培养箱(上海***，cat:BC-J160S)，超净工作台(上海***型号SW-CJ-2FD)，倒置荧光电子显微镜(Leica DMI3000B)，直尺，记号笔，基质胶(美国BD公司)，甲醇，结晶紫染液(中国武汉谷歌生物科技公司)

4.2实验方法

4.2.1将肿瘤细胞以一定密度接种于6孔板中，继续培养48小时。

4.2.2于单层培养细胞中进行划痕实验，用等渗PBS液洗去细胞碎片，再以不同浓度的抑制剂处理细胞48小时，具体药物及使用浓度如下表6，之后用等渗PBS液洗去死亡细胞，显微镜下拍照，图像分析，结果如图3所示。

表6

Transwell实验检测细胞的迁移能力

4.2.3滤膜预处理：实验前将滤膜用60μL的基质胶(1：8稀释)包被，再在小室顶部加入无血清培养基，于37℃培养箱静置0.5小时，进行再次水化处理；

4.2.4细胞培养：A431、H1975细胞采用常规消化传代方法，制成细胞悬液，计数，调整细胞浓度为1×10⁶/mL；

4.2.5于小室的上室加入200μL的上述细胞悬液，每孔细胞量为2×10⁵个；

4.2.6给予细胞药物处理：以不同浓度的药物(抑制剂)处理细胞24小时，具体药物及使用浓度如下表7：

表7

4.2.7在小室的下室(即24孔板底部)中加入600-800μL含10％胎牛血清的培养液；

4.2.8 37℃培养箱加药共孵育处理细胞24小时后，用镊子小心取出小室，吸干上室液体，移到预先加有约800μL甲醇(4％多聚甲醛)的孔中，室温固定10-30分钟；

4.2.9将小室移到预先加入约800μL Giemsa染液的孔中或2％结晶紫溶液中，室温染色15-30分钟；

4.2.10用PBS清洗小室，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞；

4.2.11彻底晾干小室后，倒置显微镜计数、拍照，结果如图3所示。

5、Western Blotting

5.1实验材料和试剂

H1975,A431细胞，RAPI1640,DMEM基础培养基(Hyclone公司，cat:SH30022.01B)，FBS胎牛血清(GIBCO公司，cat:16400-044)，双抗(北京夏斯生物科技有限公司，prospeccat:SV30010)，低速离心机(上海贝恩生物科技有限公司，cat:TDZ4B-WS)，CO₂培养箱(上海***，cat:BC-J160S)，超净工作台(上海***型号SW-CJ-2FD)EGFR一抗(BioworldTechnology),p-EGFR一抗(Bioworld Technology),AKT(Bioworld Technology),p-AKT一抗(Bioworld Technology),ERK(Bioworld Technology),p-ERK一抗(BioworldTechnology),β-actin(中国杭州华安生物),蛋白裂解液(中国上海碧云天生物技术公司),BCA蛋白浓度测定试剂盒(中国上海碧云天生物技术公司),脱脂奶粉(中国伊利公司)，BeyoECL Plus(超敏ECL化学发光试剂盒)(中国上海碧云天生物技术公司)，SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(中国上海碧云天生物技术公司)，BeyoColor^TM彩色预染蛋白分子量标准(中国上海碧云天生物技术公司)，PHS-3C型精密pH计(常州市国立试验设备研究所),纯水机(美国Millipore),制冰机(美国Forma)，凝胶电泳仪、湿式转膜仪和干燥***(美国Bio-Rad)、凝胶成像***(美国UVP公司),脱色摇床(中国北京卓信伟业科技有限公司),倒置显微镜(日本OLYMPAS)。

5.2实验方法

5.2.1细胞总蛋白提取

1、A431、H1975细胞扩大培养后，分别给予如下表8常规药物处理，处理48小时：

表8

2、48小时后PBS洗细胞两次，加入150ul蛋白裂解液，涡旋仪上涡旋8-10次，冰上裂解35-40min；

3、裂解完成后，于4℃下12000rpm离心15min；

4、测定蛋白质浓度：采用碧云天Bradford蛋白浓度测定试剂盒；

5、将离心后的上清加入上样缓冲液，100℃5min，然后放于-80℃保存、备用。

5.2.2细胞总蛋白定量(Bradford法)

1、制作标准曲线

(1)从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。

(2)取6个1.5ml离心管，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg，10.0μg，20.0μg，40.0μg。

(3)按下表9在各管中加入各种试剂。

表9

管别

0μg

2.5μg

5.0μg

10.0μg

20.0μg

40.0μg

1mg/ml BSA

－

2.5μL

5.0μL

10.0μL

20.0μL

40.0μL

0.15mol/L NaCl

100μL

97.5μL

95.0μL

90.0μL

80.0μL

60.0μL

考马斯亮蓝溶液G250

1ml

(4)混匀后，室温放置2min。在96孔板中加入以上每组样品，每孔200ul，每个浓度设三个复孔，于酶标仪595nm测定OD值，制备标准曲线。

2、检测样品蛋白含量

(1)取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。

(2)取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100μL，混匀放置2分钟可做为空白样品，同上法测定OD值，实验重复三次，取均值。

(3)取一管考马斯亮蓝加95μL 0.15mol/L NaCl溶液和5μL待测蛋白样品，混匀后静置2min，同上法测定OD值，实验重复三次，取均值。

(4)根据标准曲线和样本吸光度换算得到待测样品蛋白质浓度。

5.2.3SDS－PAGE电泳

测定完蛋白含量后，计算含100μg蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5ml离心管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×。(上样总体积一般不超过15μL，加样孔的最大限度可加20μL样品。)上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性，然后置于冰上，备用。

1、灌胶：在灌胶之前首先清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸取洗涤剂轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水反复冲洗干净至不挂水，最后用蒸馏水冲洗干净后站立晾干。

(1)玻璃板对齐后放入制胶架中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。(操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。)

(2)配制10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml

移液枪吸取5ml胶沿玻璃以一定速度放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后在胶面上加一层水，液封后的胶凝速度大大提高。(灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，以避免胶中出现气泡。加水液封时速度要慢，否则分离胶会被冲散、变形。)

(3)当水和胶之间出现折射线时，提示分离胶已凝。再等3min使胶充分凝固，倾去胶上层液封水，并用滤纸将水小心吸干，注意不要接触胶面。

(4)配制4％浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子***浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免产生气泡。插梳子时要尽量使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边垂直向上轻轻将其拔出。

(5)用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。(小玻璃面向内，大玻璃面向外。)

2、加样

(1)向电泳槽中加入足够的电泳缓冲液，准备上样。(电泳液至少要浸没内侧小玻璃上沿。)

(2)取出预处理好的蛋白样品，用微量进样器贴壁吸取样品，注意不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。(加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。

3、电泳

(1)插好电源，注意接头电极方向

(2)设置恒压，60V(6V/cm)，当指示染料溴酚蓝前沿进入分离胶后，时间约30min，将电压提高到100－120V(15V/cm)，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm，关闭电源，终止电泳。

5.2.4转膜

1、准备工作

(1)转一张膜需准备6张7.0-8.3cm的滤纸和1张7.3-8.6cm的PVDF膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，避免手部蛋白污染膜。将切好的PVDF膜做好标记，置于水中浸泡2小时。(用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。

(2)将转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻璃棒、滤纸和浸湿的膜放入加有转移缓冲液的搪瓷盘里。

(3)将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻璃棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。)在垫子上垫三层滤纸(可三张纸先叠在一起在垫于垫子上)，一手固定滤纸一手用玻璃棒擀去其中的气泡。

2、取胶

(1)于玻璃板两个边上轻轻将其撬开，小心取下玻璃板。将浓缩胶轻轻切去(浓缩胶影响操作)，避免把分离胶刮破，在分离胶的左上角切一个斜角作为标记。

(2)将分离胶浸于转移缓冲液中进行平衡。

3、转膜

(1)将平衡后的分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻璃棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除去气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。(转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验空间保持空气流通。)

(2)将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，可以在槽的一边放置冰块降温(100V/100mA)。

(3)转膜完毕后将膜用1×丽春红染液染色5min(于脱色摇床上摇)。然后用水冲洗掉没染上的染液就可观察膜上的蛋白。将膜晾干备用。

5.2.5免疫反应

1、封闭

(1)配制封闭液(5％脱脂牛奶in TBST)

(2)将膜用TBST从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上缓慢摇动，室温封闭2小时。

2、一抗结合

(1)配制一抗稀释液：5％BSAin TBST，调整pH为7.4，以保证抗原抗体反应于适宜的pH条件下进行)。

(2)把膜从封闭液里取出，用TBST冲洗一遍后，浸没于含一抗(如下表10)的杂交盒里，置于4℃摇床上缓慢摇动，孵育过夜。磷酸化抗体至少孵育12小时。其他抗体也可室温孵育2-3h。

表10

一抗名称	来源	稀释倍数	二抗
				EGFR一抗	Bioworld Technology	1:300	1:6000
p-EGFR一抗	Bioworld Technology	1:300	1:6000
				AKT	Bioworld Technology	1:300	1:6000
p-AKT一抗	Bioworld Technology	1:300	1:6000
				ERK一抗	Bioworld Technology	1:300	1:6000
p-ERK	Bioworld Technology	1:300	1:6000

3、二抗结合

(1)一抗孵育结束后，回收一抗，并于-20℃保存。将PVDF膜用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。

(2)根据一抗的来源选择相应的二抗，将二抗用封闭液进行一定比例的稀释(1:2000-1:5000)，室温孵育1-2h。

4、化学发光，显影，定影

(1)二抗孵育结束后，可进行二抗的回收再利用，使用两次后弃去。膜用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。

(2)准备好曝光盒、显色液及保鲜膜等。

(3)将ECL-A和ECL-B两种试剂在保鲜膜上进行等体积混合；1min后，将PVDF膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去除残余液体，包裹好，放入X-光片夹中。

(4)在暗室中，将1×显影液和定影液分别倒入塑料盘中；在红灯下取出X-光片，用切纸刀剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大1cm)；打开X-光片夹，把X-光片放在膜上，一旦放上，便不能再移动，关闭X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以取得最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1-2min(20-25℃)，温度过低时(低于16℃)需适当延长显影时间；显影结束后，马上将X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5-10min，以胶片呈透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。(注意：显影和定影需移动胶片时，尽量拿取胶片的一角，手指甲不要划伤胶片，否则将会对结果产生影响。)

5、凝胶图象分析：将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象分析软件(Quantity One)分析目标条带的分子量和光密度值，所得结果如图4所示。

以上生物活性结果表明，本发明中DM3001的体内外作用效果显著，主要表现在以下几个方面:(1)DM3001对突变型EGFR激酶(EGFR L858R/T790M)有强烈抑制作用，IC50仅仅为0.71nM，明显优于参比化合物Rociletinib(21.5nM)和吉非替尼(823.3nM)而对于野生型EGFR激酶(EGFR^wild-type)IC50值高达448.7nM。与Rociletinib(SI＝21.4)比较，DM3001的选择性指数(SI＝632)高出21倍，结果预示着化合物DM3001作用更专一，因此可能的毒副作用会更小，同时，该化合物对FAK黏着斑激酶的抑制效果仅为1.71nM，预示着DM3001可作用于双靶点发挥更好的抗肿瘤活性。(2)抗细胞增殖活性结果揭示，DM3001对于携带突变型EGFR^T790M的H1975细胞有强烈的抑制作用，IC50值仅为0.037μM，而对于携带野生型EGFR^wild-type的细胞株A431的抑制作用很弱，IC50值分别为0.382μM。明显优于参比药物Rociletinib、吉非替尼。对于携带敏感突变的HCC827(EGFR ^{del E746_A750})，DM3001及参比药物都有很好的抑制作用。另外，DM3001对人正常支气管上皮细胞HBE的抑制作用较弱，在其发挥抑制H1975细胞的有效浓度下，几乎对正常细胞没有影响，证明此类化合物的毒性更小。(3)AO/EB荧光双染法和DAPI染色法结果表明DM3001作用于EGFR野生株A431细胞和T790M突变株H1975细胞，均可引起细胞凋亡的形态学改变。同时DM3001对于H1975的诱导凋亡作用更显著，证明其作用更专一。(4)细胞的迁移和侵袭实验表明DM3001能够强烈抑制H1975细胞和A431细胞。与Rociletinib和Osimertinib比较，同样浓度下DM3001对H1975细胞侵袭能力的抑制作用更强，说明DM3001在抑制肿瘤细胞增殖的同时，还强烈抑制细胞的迁移。(5)WesternBlotting实验表明，DM3001能够显著抑制EGFR下游AKT信号通路中相关蛋白的表达，随着给药浓度的依次增大，p-EGFR、p-AKT、p-ERK表达水平依次下调，呈现出剂量依赖性；对H1975细胞的抑制作用优于A431细胞，进一步在分子水平验证了DM3001的选择性更高。该化合物具有较强的抑制非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖能力，显示出比Rociletinib更加优良的抗EGFR^T790M活性，且能够作用于FAK激酶。作为一类结构新颖的分子，本发明中研究化合物具有开发成新型高效EGFR和FAK双靶点抑制剂的潜力，对治疗相关的肿瘤疾病尤其是非小细胞肺癌、小细胞肺癌有较大的应用价值。

以上所述仅是本发明的优先实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种抗肿瘤化合物或其药学上可接受的盐，该抗肿瘤化合物具有式(I)所示的结构：

2.根据权利要求1所述的抗肿瘤化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述的药学上可接受的盐包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙酸盐、草酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、羟基乙酸盐、酒石酸盐、苦杏仁酸盐和磺酸盐中的一种或多种。

3.权利要求1或2所述的抗肿瘤化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其中，该抗肿瘤化合物按如下路线制备：

4.一种药物组合物，其含有有效剂量的权利要求1或2所述的抗肿瘤化合物或其药学上可接受的盐，及药用载体。

5.权利要求1或2所述的抗肿瘤化合物或其药学上可接受的盐，或权利要求4所述的药物组合物在制备EGFR表皮因子受体蛋白酪氨酸激酶抑制剂的应用。

6.权利要求1或2所述的抗肿瘤化合物或其药学上可接受的盐，或权利要求4所述的药物组合物在制备FAK黏着斑激酶抑制剂中的应用。

7.权利要求1或2所述的抗肿瘤化合物或其药学上可接受的盐，或权利要求4所述的药物组合物在制备***的药物中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述肿瘤选自非小细胞肺癌、小细胞肺癌中的一种或多种。

9.根据权利要求8所述的用途，其中，所述肿瘤为非小细胞肺癌。

10.根据权利要求7或8所述的用途，其中，所述用途主要通过抑制EGFR、EGFR^T790M突变型表皮因子受体蛋白酪氨酸激酶和FAK黏着斑激酶实现的。