CN106117355B - 一种转录因子hoxb9乙酰化位点的特异性抗体及其制备方法 - Google Patents

一种转录因子hoxb9乙酰化位点的特异性抗体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种转录因子HOXB9乙酰化位点的特异性抗体及其制备方法。研究发现，HOXB9在体内存在特异性乙酰化并确定其具***点为第27位，通过本发明所述方法制备得到的抗体，可特异性的识别肿瘤标本中HOXB9第27位氨基酸的乙酰化的量，从而判断多种肿瘤的预后。

Description

一种转录因子HOXB9乙酰化位点的特异性抗体及其制备方法
技术领域
本发明属于肿瘤预后判断领域，特别涉及一种转录因子HOXB9第27位乙酰化位点的特异性诊断性抗体及其制备方法。
背景技术
同源异形盒基因最初是在研究黑腹果蝇胚胎发育时发现的，该类基因的突变可导致真核生物某一器官异位生长。人类HOX基因在结构和功能上与果蝇的同源异型复合体高度同源，共有39个基因，根据序列的相似性及在染色体上的位置可以分为HOXA、HOXB、HOXC和HOXD四簇。HOXB9基因主要在胚胎发育晚期开放，主要控制体轴远端和神经外胚层末端的发育，促进细胞的分化和凋亡。异常表达的HOXB9正向调控肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、淋巴瘤等多种恶性肿瘤的发生、侵袭和转移。然而HOXB9在胃癌中却被认为是一种保护因素，HOXB9高表达是胃癌和结肠癌预后良好的一个重要的指标。HOXB9在不同类型恶性肿瘤中发挥多面性的调节作用引起我们的关注。
发明内容
本发明的目的是提供一种转录因子HOXB9第27位乙酰化位点的特异性诊断性抗体及其制备方法。通过本发明所述方法制备得到的抗体，可特异性的识别肿瘤标本中HOXB9第27位氨基酸的乙酰化的量，从而判断包括人食管癌、胃癌、肝癌、肾癌和结肠癌在内的多种肿瘤的预后。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种转录因子HOXB9第27位乙酰化位点的特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：
1）人工合成SEDAPPAKFPSGQYAS序列多肽，并将K位点进行乙酰化处理；
2）利用步骤1）合成的多肽免疫兔获得多克隆抗血清，酶联免疫吸附试验法（ELISA）测定血清中抗体滴度，并对抗体进行纯化处理，即得到所述特异性抗体。
进一步的，步骤1）所述的K位点的乙酰化处理使用的乙酰化酶为赖氨酸乙酰化酶2B（PCAF），是一个p53相关的转录共结合因子。我们是从一系列乙酰化酶中排除CBP、P300、hMOF的作用，筛选出来的可以特异性乙酰化HOXB9第27位赖氨酸的酶。
进一步的，步骤2）中的免疫兔的具体过程为：分别于初次免疫28天后、42天后、56天后进行三次加强免疫，用250μg 27Ace-HOXB9多肽与等体积的弗氏不完全佐剂混匀，背部皮下多点注射；第三次加强免疫前取耳血，分离血清作为免疫后血清，采用ELISA测定血清中的抗体效价，当抗体滴度达到106数量级时，颈动脉放血，收集血清，即获得所述的多克隆抗血清。
进一步的，步骤2）中所述的ELISA测定血清中抗体滴度，具体方法为：吸取适量0.1mol/L，pH 9.5的碳酸缓冲液，稀释步骤1）所述多肽至5mg/L，每孔50μl加入96孔板，4℃包被过夜；第二天移去包被液，稀释缓冲液洗3次，每次5min；3％牛血清白蛋白（Bovine SerumAlbumin，BSA），37℃封闭2 h，依次与梯度稀释的兔抗血清、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗，37℃分别反应1h；稀释缓冲液洗3次，每次5min；底物液避光显色15min后，每孔加入50μl，2mol/L硫酸终止反应，酶联免疫吸附试验检测仪读取490nm吸光度值进行分析。
进一步的，步骤2）中所述的抗体纯化处理的具体方法为：取Protein A珠子加入兔抗血清2ml中充分混合，室温孵育2h，PBS洗三次；加入450μl的甘氨酸，静置2min，洗脱至预先加有50μlTris缓冲液的管中，立即颠倒混匀，重复洗脱5管，即得到所述特异性抗体。
本发明相比现有技术的有益效果为：
1、本发明发现在HOXB9 五个可乙酰化的赖氨酸位点中（K27, K117, K159, K167and K202），只有K27R突变显著影响HOXB9被乙酰化，且筛选出PCAF特异性乙酰化HOXB9；
2、本发明所制备得到的抗体可特异性识别肿瘤标本中HOXB9第27位氨基酸的乙酰化的量，从而判断包括人食管癌、胃癌、肝癌、肾癌和结肠癌在内的多种肿瘤的预后；
3、目前对于结肠癌的分子病理检测主要是k-ras、b-Raf等分子，本项发明提供潜在的另一预测分子Ace-27HOXB9，而且不仅在结肠癌，在食管癌、胃癌、肝癌、肾癌中也有类似的预测作用，该分子在多种癌组织中预示良好预后的发现为其开展广泛的临床应用奠定基础。
附图说明
图1为用乙酰化抗体IP发现细胞中的HOXB9存在乙酰化修饰状态；
图2为HOXB9乙酰化位点在第27位赖氨酸，其中（A）电离质谱(m/z 1384.3141)分析发现HOXB9乙酰化位点在第27位赖氨酸；（B）突变27位赖氨酸为精氨酸显著降低HOXB9的乙酰化程度；（C）HKEK-293T细胞内共转Flag-HOXB9突变体和PCAF后IP下拉Flag，再用乙酰化抗体检测发现其乙酰化程度显著降低；（D）AcK27-HOXB9抗体特异性用Dot blot方法，以HOXB9乙酰化肽(EDAPPA(AcK)FPSGQYAC)，三种浓度和HOXB9 非乙酰化肽(EDAPPAKFPSGQYAC)为对照；（E）免疫组织化学法在C57BL6小鼠一系列组织中检测AcK27-HOXB9的表达水平。在肺、脑、肾、子宫和卵巢中均检测到内源性AcK27-HOXB9的表达；
图3为AcK27-HOXB9在人食管癌、胃癌、肝癌、肾癌和结肠癌中的表达水平示意图；
图4为免疫组织化学法检测肺腺癌患者27Ace-HOXB9的表达水平；
图5为免疫组织化学法检测结肠癌患者27Ace-HOXB9的表达水平。
具体实施方式
本发明实施例中所采用的材料：浓盐酸、浓硫酸、氢氧化钠、二甲苯、碳酸氢钠、异丙醇、三氯甲烷、丙三醇、无水乙醇、甲醇、冰醋酸、葡萄糖、无水乙酸钠、氯化钙等购自北京化工厂；对苯二酚、2-巯乙基磺酸钠、多聚甲醛、二磷酸氯喹盐、过硫酸铵、焦碳酸二乙酯(DEPC)、结晶紫、考马斯亮蓝R250、氯化镁六水合物、氯化锰、氯化钠、硼酸、氢氧化钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、脱氧胆酸钠、硝普钠、乙二胺四乙酸(EDTA)、原钒酸钠盐、HEPES、二甲基亚砜(DMSO)、戊巴比妥钠、二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、溴酚蓝、CHAPS、Tris、Tween-20、NP-40、Triton X-100、dNTP、氯霉素(Cam)等购自Sigma公司；氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kana)等购自北京鼎国昌盛生物技术公司。
实施例1
用乙酰化特异性抗体下拉，发现细胞内HOXB9是一种乙酰化蛋白，如图1所示，接下来从4种乙酰化酶中筛选出PCAF特异性乙酰化HOXB9，而非其它三种酶（CBP, P300 和hMOF），如图1B所示。通过共转FLAG-HOXB9 和FLAG-PCAF，之后通过LC-MS/MS分析，我们发现在HOXB9 五个可乙酰化的赖氨酸位点中(K27, K117, K159, K167 and K202)，只有K27R突变显著影响HOXB9被PCAF乙酰化，如图2A 和2B所示。
一种转录因子HOXB9第27位乙酰化位点的特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：
1）人工合成SEDAPPAKFPSGQYAS序列多肽，并将K位点进行乙酰化处理；所述序列由上海吉玛公司合成；
2）利用步骤1）合成的多肽免疫兔获得多克隆抗血清，酶联免疫吸附试验法（ELISA）测定血清中抗体滴度，并对抗体进行纯化处理，即得到所述特异性抗体。
进一步的，步骤1）所述的K位点的乙酰化处理使用的乙酰化酶为PCAF。
进一步的，步骤2）中的免疫兔的具体过程为：分别于初次免疫28天后、42天后、56天后进行三次加强免疫，用250μg 27Ace-HOXB9多肽与等体积的弗氏不完全佐剂混匀，背部皮下多点注射；第三次加强免疫前取耳血，分离血清作为免疫后血清，采用ELISA测定血清中的抗体效价，当抗体滴度达到106数量级时，颈动脉放血，收集血清，即获得所述的多克隆抗血清。
进一步的，步骤2）中所述的ELISA测定血清中抗体滴度，具体方法为：吸取适量0.1mol/L，pH 9.5的碳酸缓冲液，稀释步骤1）所述多肽至5mg/L，每孔50μl加入96孔板，4℃包被过夜；第二天移去包被液，稀释缓冲液（0.01mol/L PBS，0.05% Tween-20，pH 7.0）洗3次，每次5min；3％牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA），37℃封闭2 h，依次与梯度稀释的兔抗血清（稀释液为1％牛血清白蛋白）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗，37℃分别反应1h；稀释缓冲液洗3次，每次5min；底物液避光显色15min后，每孔加入50μl，2mol/L硫酸终止反应，酶联免疫吸附试验检测仪读取490nm吸光度值进行分析。
进一步的，步骤2）中所述的抗体纯化处理的具体方法为：取Protein A珠子加入兔抗血清2ml中充分混合，室温孵育2h，PBS洗三次；加入450μl的甘氨酸（0.1mol/L，pH 2.8），静置2min，洗脱至预先加有50μl Tris缓冲液（1mol/L，pH 8.0）的管中，立即颠倒混匀，重复洗脱5管，即得到所述特异性抗体。
通过Dot blotting方法检测本实施例制备得到的兔抗27Ace-HOXB9多克隆抗体的有效性和特异性。
实施例2
在本实施例中收集北医三院肺癌病理切片75例肺腺癌。收集齐全的病例资料：包括档案号、姓名、性别、年龄、病理诊断（类型及分化程度）、TNM分级和生存期等。免疫组织化学法检测27Ace-HOXB9的表达水平，以中位数分界Kaplan-Meier 分析高表达与低表达组之间的生存差异，具体检测方法如下所述。结果如图4显示：低水平27Ace-HOXB9预示不良肺腺癌的预后。
免疫组织化学方法检测所得抗体的组织检测有效性与特异性，具体步骤如下：
1）石蜡切片免疫组织化学染色（Envision二步法）
① 石蜡切片脱蜡水化：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min；100%酒精Ⅰ、Ⅱ各5min；95%酒精Ⅰ、Ⅱ各5min；90%酒精5min ；80%酒精5min，70%酒精5min；
② 3% H2O2封闭内源性过氧化物酶，室温下，10min；
③ 自来水冲洗2min，蒸馏水冲洗2 次；
④ 抗原修复（抗原修复液分为pH6.0）：水浴锅煮沸10min，之后自然冷却到室温；
⑤ PBS缓冲液冲洗3次，每次3min；
⑥ 加一抗4℃冰箱中过夜；以PBS 代替一抗做阴性对照；
⑦ PBS缓冲液冲洗3 次，每次3min；
⑧ 滴加相应二抗，室温孵育30min；
⑨ PBS缓冲液冲洗3次，每次3min；
⑩ DAB显色，苏木精复染细胞核，逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片；镜检。
Western Blot检测
1）聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
① 胶的制备
配制所需浓度的下层分离胶，混匀后灌胶，并在胶面上小心加入蒸馏水，待胶自然凝结后将未凝的蒸馏水倾出，将配置好的5%浓缩胶倒入上层，迅速***梳子，待凝结后小心拔出梳子，备用。
② 样品的制备
将蛋白质样品（根据不同实验要求取合适蛋白量上样）与上样缓冲液（5×）在离心管中混合，沸水加热5min，最大转数离心10s。
③ 电泳
将配好的胶正确装入电泳槽中，倒入电泳液。用微量移液器将蛋白质样品加入样品孔底部，避免带入气泡，气泡易使样品混入到相邻的样品孔中。将电极插头与适当的电极相连。浓缩胶中电泳电压80 V，当样品进入分离胶后，调节电压使之恒定在120 V。染料的前沿迁移至分离胶的底部时关闭电源。
④ 转膜
SDS-PAGE结束后，从电泳槽中取出凝结玻璃板。轻轻撬开玻璃板，凝胶会贴在其中的一块玻板上。取下凝胶，放入电转缓冲液中平衡5 min 后进行转膜。将塑料支架平放，注意黑片（负极）在下，依次放置海绵垫、3层厚滤纸、凝胶、转印膜（PVDF膜）、3层厚滤纸、海绵垫，赶走各层间气泡，夹好支架，在冰浴中进行电转，200 mA，约2 h（PVDF膜需先经甲醇浸透，电转液平衡10 min 后方可使用）。电转结束后，将膜剪去右上角作为标记。
2）抗原抗体反应
① 封闭：拆卸转移装置，将滤纸揭下，用镊子或戴手套将膜放入容器中。5%牛奶（TBST配置）室温振摇封闭1h。
② 加一抗：用封闭液按最佳比例稀释一抗，与PVDF膜室温孵育1h或4℃过夜。洗涤：TBS-T洗涤3次，每次10min。
③ 加二抗：用封闭液以1:5000稀释HRP标记的山羊抗鼠IgG或山羊抗兔IgG，与PVDF膜在室温下孵育1h。洗涤：TBS-T洗涤3次，每次10min。
3）辣根过氧化物酶化学发光法检测蛋白（ECL反应）
取等体积Western Blot Luminol Reagent试剂A液、B液混合（按每平方厘米转印膜0.125ml混合液计算）。将转印膜轻轻接触滤纸吸干液体，有蛋白质的一面朝上放在保鲜膜上，然后将A、B混合液加到转印膜上，反应1min，提起转印膜，轻轻接触滤纸吸干液体。用保鲜膜覆盖转印膜，有蛋白质的一面朝上，表面要注意平整，用透明胶带将保鲜膜覆盖的转印膜固定在显影盒中，使用超敏化学发光成像***进行曝光。
裂解液RIPA buffer：
Tris-HCl(pH=7.4) 25mM
KCl 150mM
EDTA 5mM
脱氧胆酸钠 0.5%
SDS 0.1%
NP-40 1%
Cocktail（MERCK） 1×
PBS-TDS裂解液：
PBS 1×
Triton X-100 1%
EDTA 1mM
脱氧胆酸钠 0.5%
SDS 0.1%
Cocktail（MERCK） 1×
SDS PAGE胶主要试剂及配方
储存液：
1.0M Tris-HCl (pH6.8)：称取12.11g Tris碱溶于80ml双蒸水中，加入浓盐酸调pH至6.8，加双蒸水定容至100ml。
1.5M Tris-HCl (pH8.8)：称取45.4g Tris碱溶解于200ml双蒸水中，加入浓盐酸调pH至8.8，加双蒸水定容至250ml。
10%SDS：称取10g SDS溶于90ml 双蒸水，用1M HCl调pH至7.2，加双蒸水定容至100ml。
30%丙烯酰胺：称取29g丙烯酰胺（Fluka公司）及1g N,N-亚甲双丙烯酰胺加入60ml双蒸水中，37℃助溶，加双蒸水至100ml，验证其pH≤7.0，4℃避光保存。
10%过硫酸胺(AP)：称取1g过硫酸胺溶于10ml双蒸水中，分装，4℃保存。
实施例3
本实施例收集北医三院肺癌病理切片90例结肠癌。收集齐全的病例资料：包括档案号、姓名、性别、年龄、病理诊断（类型及分化程度）、TNM分级和生存期等。免疫组织化学法检测27Ace-HOXB9的表达水平，Kaplan-Meier 分析高表达与低表达组之间的生存差异。具体检测方法如实施例2所示，结果如图5显示：低水平27Ace-HOXB9预示结肠癌的不良预后。

Claims (7)

1.一种转录因子HOXB9第27位乙酰化位点的特异性抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
1）人工合成SEDAPPAKFPSGQYAS序列多肽，并将K位点进行乙酰化处理；
2）利用步骤1）合成的多肽免疫兔获得多克隆抗血清，酶联免疫吸附试验法（ELISA）测定血清中抗体滴度，并对抗体进行纯化处理，即得到所述特异性抗体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1）所述的K位点的乙酰化处理使用的乙酰化酶为PCAF。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中的免疫兔的具体过程为：分别于初次免疫后再进行三次加强免疫，用250μg SEDAPPAKFPSGQYAS序列多肽与等体积的弗氏不完全佐剂混匀，背部皮下多点注射；第三次加强免疫前取耳血，分离血清作为免疫后血清，采用ELISA测定血清中的抗体效价，当抗体滴度达到106数量级时，颈动脉放血，收集血清，即获得所述的多克隆抗血清。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中所述的ELISA测定血清中抗体滴度，具体方法为：吸取适量0.1 mol/L，pH 9.5的碳酸缓冲液，稀释步骤1）所述多肽至5mg/L，每孔50μl加入96孔板，4℃包被过夜；第二天移去包被液，稀释缓冲液洗3次，每次5min；3％牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA），37℃封闭2 h，依次与梯度稀释的兔抗血清、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗，37℃分别反应1h；稀释缓冲液洗3次，每次5min；底物液避光显色15min后，每孔加入50μl，2mol/L硫酸终止反应，酶联免疫吸附试验检测仪读取490nm吸光度值进行分析。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中所述的抗体纯化处理的具体方法为：取Protein A珠子加入兔抗血清2ml中充分混合，室温孵育2h，PBS洗三次；加入450μl的甘氨酸，静置2min，洗脱至预先加有50μlTris缓冲液的管中，立即颠倒混匀，重复洗脱5管，即得到所述特异性抗体。
6.一种转录因子HOXB9第27位乙酰化位点的特异性抗体，其特征在于，所述特异性抗体由如权利要求1-5中任一项所述的制备方法制得。
7.根据权利要求6所述的转录因子HOXB9第27位乙酰化位点的特异性抗体，其特征在于，所述抗体能够有效判断不良肺腺癌和结肠癌的预后。
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