CN107190077A

CN107190077A - 尿液miRNAs生物标志物及其筛选方法和应用

Info

Publication number: CN107190077A
Application number: CN201710521228.9A
Authority: CN
Inventors: 张辉; 苏式兵; 商嘉玮; 郭鑫昕; 陆奕宇; 周钱梅
Original assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2017-06-30
Publication date: 2017-09-22

Abstract

本发明涉及生物医药领域，公开了尿液miRNAs生物标志物及其在肝癌诊断标志物发现中的应用。其筛选方法所述方法包括如下步骤：1)从尿液中提取包括miRNAs在内的总RNA；2)比较健康者和肝癌患者的miRNAs表达谱，找出肝癌患者尿液中异常表达的miRNAs；3)用实时定量RT‑PCR方法，经小样本初筛及扩大样本验证，筛选可用作肝癌标志物的miRNAs；4)ROC曲线进行相关分析。与健康者比较，miR‑6798‑5p在肝癌患者尿液中呈高表达。本发明建立了尿液miRNAs生物标志物的筛选方法，并发现尿液miRNAs可作为肝癌患者的辅助诊断，样本易得、收集简便、无创，具有重要的学术意义和广阔的应用前景。

Description

尿液miRNAs生物标志物及其筛选方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及尿液miRNAs生物标志物的筛选方法及其在肝癌诊断标志物发现中的应用。

背景技术

原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是临床上最常见的恶性肿瘤之一，在全球恶性肿瘤发病率和死亡率分别为第七位和第五位，我国卫生部统计得出肝癌死亡率占肿瘤死亡率的第二位。在肝癌的治疗中，早期手术切除是目前首选的、最有效的治疗方法，而早期诊断和早期治疗，是提高疗效的关键。但是鉴于肝癌起病隐匿，恶性程度高，进展迅速，只有10-20％适合手术治疗。因此，早期诊断对提高肝癌患者的生存率和改善肝癌患者预后至关重要。

miRNAs是现代生物医学中的一个重要的调节分子，它通过对基因转录表达的调控，调控着人体所有细胞、组织和器官的各种功能，在人类疾病的发生和防治中具有十分重要的作用。现大量研究发现，miRNAs可以广泛而稳定地存在于细胞外液，包括血清、血浆、尿液和组织间液之中。它们不仅是细胞内基因转录和表达的调节分子，还是细胞之间信息传递的信号分子。在病理过程中，血清/ 血浆/尿液miRNAs表达谱会发生特征性的改变，这些改变有助于对疾病进行诊断和预后判断，甚至与临床分期分级密切相关。且循环和尿液中miRNAs作为疾病诊断和预后的标志物，具有检测损伤小、稳定性好、灵敏度高等诸多优点。

在正常机能状态下，机体内循环和尿液中miRNAs的种类及其表达丰度可能处于一个相对稳定、平衡的状态。当机体处于疾病过程中，表现为异常代谢或特定疾病状态下某些循环/尿液miRNAs的表达水平显著性升高或降低。本研究以肝癌患者为研究对象，检测出肝癌患者尿液中miRNAs的表达谱和特征性的 miRNAs，对于丰富肝癌的辅助诊断及病理机制等，具有重要的学术意义和应用前景。

发明内容

本发明旨在提供一种尿液miRNAs生物标志物的筛选方法。

本发明还将尿液miRNAs应用于肝癌的辅助诊断标志物。

技术方案为，尿液miRNAs生物标志物的筛选方法，包括如下步骤：

1)采集健康者和肝癌患者的尿液，提取总RNA；

2)初筛：检测健康者和肝癌患者临床尿液标本中miRNAs表达，比较健康者和肝癌患者的miRNAs表达谱，找出肝癌患者尿液中异常表达的miRNAs作为候选；

3)复筛：采用实时定量RT-PCR技术，测定尿样中候选miRNAs的含量，分别进行小样本和/或扩大样本筛选，筛选和确定可用作肝癌标志物的miRNAs；

4)用ROC曲线法确定步骤3)筛选的肝癌标志物的miRNAs。

步骤2)中，用miRNAs表达谱芯片检测miRNAs的表达；利用T检验的P值和倍数变化值进行差异miRNA筛选，筛选的标准为差异倍数变化值≥2且P值≤ 0.05。

步骤3)中，选择的标准为差异倍数变化值≥2，且P值≤0.05。

步骤3)中，所述的定量RT-PCR技术采用miRNA特异的茎环引物逆转录法，并用SYBR Green qPCR检测法进行检测。

通过上述方法，步骤2)初筛结果发现，有13个miRNAs表达呈上调： miR-125b-2-3p、miR-139-3p、miR-1587、miR-205-5p、miR-422a、miR-3154、 miR-3615、miR-3659、miR-422a、miR-4535、miR-4651、miR-6798-5p、miR-6799-5p、 miR-6880-5p。

步骤3)中，选取miR-205-5p、miR-422a、miR-6798-5p和miR-6799-5p用实时定量RT-PCR方法进行小样本复筛，筛选得到miR-6798进行扩大样本筛选。

用ROC曲线法(受试者工作特性曲线，Receiver Operator CharacteristicCurve，简称ROC曲线)评估miR-6798-5p作为肝癌标志物的临床价值，结果显示，尿液 miR-6798-5p进行肝癌诊断的曲线下面积(area under the curve，AUC)为0.83，效果良好。

由此可见，miR-6798-5p在肝癌患者尿液中高表达，可以作为尿液样本中辅助诊断肝癌的生物标志物，也可以用来筛选治疗肝癌的药物。

miR-6798-5p检测引物和逆转录引物，可用来检测尿液样本中miR-6798-5p 的表达量，从而用于制备诊断或辅助诊断肝癌的试剂、试剂盒或生物芯片，或者用于筛选治疗肝癌药物的试剂、试剂盒或生物芯片。

本发明另一个技术方案为：一种试剂盒或生物芯片，包括在肝癌患者尿液中表达异常的miRNA的qPCR逆转录引物和正向检测引物，用于检测在肝癌患者尿液中表达异常的miRNA及其表达量，可用来诊断肝癌或者辅助肝癌诊断，也可以用来筛选或辅助筛选治疗肝癌的药物。

优选的，所述检测肝癌的试剂盒或生物芯片包括miR-6798-5p的qPCR的转录引物和正向检测引物。

优选的，所述检测肝癌的试剂盒或生物芯片，所述miR-6798-5p的逆转录引物的序列包括SEQ ID No.1所述的序列：

CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCCAAGCT；

所述的正向检测引物序列包括SEQ ID No.2所述的序列：

ACACTCCAGCTGGGCCAGGGGGATGGGCGA。

更优选的，所述miR-6798-5p的逆转录引物的序列如SEQ ID No.1所示：

CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCCAAGCT；

所述的正向测序引物序列如SEQ ID No.2所示：

ACACTCCAGCTGGGCCAGGGGGATGGGCGA。

试剂盒或生物芯片中还包括通用反向检测引物，其序列为： TGGTGTCGTGGAGTCG。

由此可见，miR-6798-5p在肝癌患者尿液中高表达，可以作为辅助筛选肝癌的生物标志物。也可以用来筛选治疗肝癌的药物。

含有miR-6798-5p检测引物和逆转录引物的试剂盒或生物芯片，可用来检测尿液样本中miR-6798-5p的表达量，从而用于制备诊断肝癌或者筛选治疗肝癌药物的试剂盒或生物芯片。

本发明的有益效果在于：

1.建立了尿液miRNAs生物标志物的筛选方法，并发现与健康者比较，肝癌患者尿液中miRNAs存在异常表达；尿液miRNAs可作为肝癌诊断标志物，可用于肝癌患者的辅助诊断，对于肝癌的辅助诊断及丰富肝癌的病理机制等，具有重要的学术意义和应用前景；

2.miR-6798-5p在肝癌患者尿液中呈高表达，可能是肝癌患者特征性的 miRNAs分子；采用miR-6798-5p作为尿液中的肝癌生物标志物，可以方便快速地检测，不会对患者造成创伤，miR-6798-5p可用于诊断的标志物及筛选治疗肝癌的药物；

3.本发明以尿液为样本，生物样本易得，收集简便、无创、数量大，通过检测疾病标志物miRNAs就可以进行诊断或辅助诊断，miRNAs作为疾病生物标记物具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明筛选方法的流程图；

图2为健康者(Ctrls)和肝癌(HCC)患者尿液miR-205-5p、miR-422a、 miR-6798-5p和miR-6799-5p表达情况(小样本验证)；

图3为健康者(Ctrls)和肝癌(HCC)患者尿液miR-6798-5p表达情况；

图4为肝癌(HCC)患者尿液miR-6798-5p的ROC曲线。

具体实施方式

筛选过程如图1所示，步骤包括：

(a)采集健康者(Ctrls)和肝癌患者(HCC)的尿液，提取总RNA(包括 miRNAs)；

(b)初筛：用miRNAs芯片检测健康者和肝癌患者临床尿液标本中miRNAs 表达谱，比较健康者和肝癌患者的miRNAs表达谱，初筛找出肝癌患者尿液中异常表达的miRNAs作为候选；

(c)小样本复筛：用实时定量RT-PCR(qRT-PCR)技术，测定每份尿样中候选miRNAs的含量，筛选可以用作HCC标志物的miRNAs；

(d)扩大样本复筛：用实时定量RT-PCR(qRT-PCR)技术，测定每份尿样中候选miRNAs的含量，进一步确定可用作HCC标志物的miRNAs；

(e)用ROC曲线法分析筛选的肝癌标志物的miRNAs，进行临床价值评估。

实施例1

采集样本和用mirVana^TM PARIS^TM Kit(Ambion-1556)提取尿液Total RNA：

1.取尿液样本800μL，加入等量的2×Denaturing Solution，涡旋混匀，冰上放置5分钟。

2.加入等体积的酚/氯仿，涡旋混匀30-60秒。

3.加入10μL cel-miR-39(1.5x10⁹copies/μL)，充分混匀。室温，12000转/ 分钟离心5分钟。

4.小心吸取上清到新的1.5mL离心管中，添加1.25倍体积的无水乙醇，涡旋混匀。

5.转移至柱子中(最大体积700μL)，10000g离心30s。

6.混合10μL DNase I和70μL Buffer RDD QIAGEN(#79254)总体积： 80μL，加到离心柱中的膜上，室温放置15min。

7.加入350μL miRNA Wash Solution 1到离心柱中，10000g，室温离心15 秒，弃流过液，将离心柱重新放置到收集管中

8.加入500μL Wash Solution 2/3过柱两次，10000g，室温离心15秒，弃流过液，之后空柱离心1分钟。将离心柱放置到新的收集管中，柱中心加50μL 95℃ 预热的ElutionSolution，室温12000转/分钟离心20-30秒，收集管中的液体即为提取的Total RNA，可放置在-80℃保存或进行后继实验。

实施例2

芯片检测初筛，芯片杂交的操作流程如下：

取100ng total RNA起始，定容到2μL。

(1)去磷酸化：

a.按下表所示的顺序配制去磷酸化混合液：

表A

CIP Master Mix	1×	9×
			10×Calf Interinal Phosphatase Buffer	0.4μL	3.6μL
Labeling Spike-In	1.1μL	9.9μL
			Calf Intestinal Phosphatase	0.5μL	4.5μL
总体积	2μL	18μL

b.PCR仪反应：37℃下扩增30min。

(本步骤结束后，如不立即进行下面的反应，可将反应样品置于-80℃保存备用。)

(2)样品变性：

a.在每管样品中添加2.8μL 100％DMSO,混匀离心；

b.上述反应混合液置于100℃PCR仪中5-10分钟(7分钟)；

c.迅速转入冰水浴中冷却。

(3)连接标记：

a.将10×T4 RNA Ligase Buffer置于37℃温育并间隔涡旋，直至沉淀全部溶解，然后将其冷却至室温备用。

b.按下表配制连接反应混合液(注意，反应混合液应在使用前配制，配好后放在冰上，并在15分钟内使用)：

表B

Ligation Master Mix	1×	9×
			10×T4 RNA Ligase Buffer	1μL	9μL
Cy3-pCp	3μL	27μL
			T4 RNA Ligase	0.5μL	4.5μL
total	4.5μL	40.5μL

c.PCR反应：16℃温育2小时。

(4)标记后RNA纯化：

标记后RNA移至2mL管，1000×g离心2min；取上清液移至1.5mL管，向样品中加入38.7μL超纯水(RF water)定容至50μL，1000×g离心4min，弃上清，定容至50μL。

(5)纯化后样品抽干：

1)45℃浓缩1小时(如未经纯化的样品45℃浓缩3小时)

2)将抽干的样品重新溶解在17μL nuclease-free水中

(6)准备10×Blocking Agent:

1)在冻干的10×GE Blocking Agent管中加入125μL nuclease-free水，轻微涡旋，以使其完全溶解，必要时可将其置于37℃温育4-5分钟。

2)稍离心，放置备用。配制好的10×GE Blocking Agent可放置在-20℃保存 2个月，每次融化使用时，注意涡旋混匀并离心。

(7)准备杂交反应：

1)配置反应体系

表C

杂交反应体系混合物
		样品	17μL
Hyb Spike-In	1μL
		10×GE Blocking Agent	4.5μL
2×Hi-RPM Hybridization Buffer	22.5μL
		总体积	45μL

2)反应条件：

100℃5min

冰水混合物5min

3)上芯片，55℃20小时，20rpm滚动杂交。

杂交后，取出芯片于洗液1中洗涤5分钟；再将芯片放入洗液2中洗涤5分钟 (37℃)。

然后在Agilent扫描仪中选择相应的参数扫描。

结果如表1所示，miR-125b-2-3p、miR-139-3p、miR-1587、miR-205-5p、 miR-422a、miR-3154、miR-3615、miR-3659、miR-422a、miR-4535、miR-4651、 miR-6798-5p、miR-6799-5p、miR-6880-5p的表达均有2倍以上提高，而且P值≤ 0.05。

表1.肝癌患者(HCC)尿液中miRNAs的表达(HCC/Ctrls)

实施例3

复筛：RT-qPCR检测

小样本复筛选取miR-205-5p、miR-422a、miR-6798-5p和miR-6799-5p，检测 Ctrls和HCC患者尿液中这些miRNAs分子表达情况(Ctrls 14个，HCC 19个)。结果显示，miR-6798-5p在肝癌患者尿液中呈高表达(P<0.0001)，如图2所示。其余的miRNAs表达量没有显著差异，而且P值超过0.1。

大样本复筛检测miR-6798-5p在肝癌患者尿液中的表达(Ctrls 24个，HCC 47个)。结果显示，miR-6798-5p在肝癌患者尿液中呈高表达(P<0.0001)，如图3 所示。

用“两步法”RT-qPCR的方法定量基因表达。两步法中，首先，RNA用反转录酶生成cDNA。第二步为取一部分cDNA作为模板再进行多个qPCR反应。小样本复筛和扩大样本复筛均按以下步骤操作。

1.第一步：cDNA模板的制备(反转录)

20μl反转录体系如下：

表D

试剂	浓度	体积
			miRNA逆转录引物	0.5μM	2μl
总RNA	——	13μl

其中，逆转录引物RTP的序列如表2所示。

轻柔混匀，65℃孵育5min，之后，放到冰上冷却，短暂离心收集，加入以下试剂：

表E

试剂	浓度	体积	终浓度
				5×RT Buffer	5×	4μl	1×
RT Enzyme Mix		1μl

轻柔混匀，37℃孵育60min，之后，70℃孵育15min，灭活M-MLV活性。置于冰上冷却，短暂离心收集，可以直接用于PCR扩增，或于-20℃保存。

2.第二步：PCR反应

(A)PCR反应液的配制

表F

(B)PCR的反应条件

95℃60s，(95℃15s，60℃20s，72℃10s)×40循环，溶解曲线分析

以上PCR反应所使用的引物序列如表2所示，其中，RTP表示RT primer，即逆转录引物；FP表示forward primer，即上游检测引物。下游检测引物为URP(统一反向引物)。

表2 miRNAs的qRT-PCR表达检测引物

数据处理与统计分析

采用cel-miR-39标化、计算每一种被检miRNAs的△Ct值，录入Excel数据表，建库。采用2△^Ct分析不同组别间的miRNAs表达水平的差异，△Ct＝Ct内参基因-Ct靶基因。

数据正态性检验采用动差法，非正态数据的组间比较采用Mann-whitney检验或Kruskal-Wallis检验。对差异表达的miRNAs、差异表达的miRNAs与中医证候及临床指标等进行相关性分析和统计学处理，采用SPSS 15.0和SAS软件完成，以P<0.05为显著性检验水准。ROC(receiver operating characteristic，ROC) 分析及AUC(area under the curve，AUC)计算由GraphPad Prism软件完成。

小样本复筛的结果如图2所示，其中Ctrls数量为14个，HCC样本数量19 个。结果显示，miR-6798-5p的表达量有显著提高，而且<0.0001；其余3种miRNAs 的Ctrls和HCC表达量没有明显差异，P值大于0.1，其中，miR-205-5p为0.8128， miR-422a为0.1131，miR-6799-5p为0.8986。。

扩大样本复筛进一步验证(Ctrls数量为24个，HCC样本数量71个)， miR-6798-5p的复筛结果如图3所示，HCC患者尿样中的miR-6798-5p表达量有明显增加，而且P<0.0001。

用ROC曲线法(受试者工作特性曲线，Receiver Operator CharacteristicCurve，简称ROC曲线)分析miR-6798-5p在HCC方面的诊断价值。结果如图 4所示，其中纵轴为灵敏度，横轴为100％-Specificity％(即100％-特异度％，假阳性率)。曲线下面积AUC＝0.83，说明诊断的正确度高。

由此可见，miR-6798-5p在肝癌患者尿液中高表达，可以作为筛选肝癌的生物标志物，也可以用来筛选治疗肝癌的药物。

miR-6798-5p检测引物和逆转录引物，可用来检测尿液样本中miR-6798-5p 的表达量，从而用于制备诊断或辅助诊断肝癌的试剂、试剂盒或生物芯片，或者用于制备筛选治疗肝癌药物的试剂、试剂盒或生物芯片。含有miR-6798-5p检测引物和逆转录引物的试剂盒或生物芯片，可用来检测尿液样本中miR-6798-5p的表达量，从而用于诊断或辅助诊断肝癌，或者筛选治疗肝癌药物。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海中医药大学

<120> 尿液miRNAs生物标志物及其筛选方法和应用

<130> 0

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagccca agct 44

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acactccagc tgggccaggg ggatgggcga 30

Claims

1.尿液miRNAs生物标志物的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)采集健康者和肝癌患者的尿液，提取总RNA；

4)用ROC曲线法确定步骤3)筛选的肝癌标志物的miRNAs。

2.权利要求1所述尿液miRNAs生物标志物的筛选方法，其特征在于，步骤2)中，用miRNAs表达谱芯片检测miRNAs的表达；利用T检验的P值和倍数变化值进行差异miRNA筛选，筛选的标准为差异倍数变化值≥2且P值≤0.05。

3.权利要求1所述尿液miRNAs生物标志物的筛选方法，其特征在于，步骤3)中，所述的定量RT-PCR技术采用miRNA特异的茎环引物逆转录法，并用SYBR Green qPCR检测法进行检测。

4.一种用于肝癌检测的试剂盒或生物芯片，其特征在于，包括在肝癌患者尿液中表达异常的miRNA的qPCR逆转录引物和正向检测引物。

5.权利要求4所述检测肝癌的试剂盒或生物芯片，其特征在于，包括miR-6798-5p的qPCR的逆转录引物和正向检测引物。

6.权利要求5所述检测肝癌的试剂盒或生物芯片，其特征在于，所述miR-6798-5p的逆转录引物的序列包括SEQ ID No.1所述的序列：

CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCCAAGCT；

所述的正向检测引物序列包括SEQ ID No.2所述的序列：

ACACTCCAGCTGGGCCAGGGGGATGGGCGA。

7.权利要求5所述检测肝癌的试剂盒或生物芯片，其特征在于，所述miR-6798-5p的逆转录引物的序列如SEQ ID No.1所示：

CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCCAAGCT；

所述的正向检测引物序列如SEQ ID No.2所示：

ACACTCCAGCTGGGCCAGGGGGATGGGCGA。

8.miR-6798-5p作为尿液样本中肝癌生物标志物的应用。

9.miR-6798-5p、miR-6798-5p检测引物或miR-6798-5p逆转录引物在筛选治疗肝癌的药物方面的应用。