CN110656171B - 小核仁核糖核酸snord33作为生物标记物用于制备检测试剂盒中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属生物诊断检测技术领域，涉及SNORD33作为生物标记物用于制备检测试剂盒中的用途，本发明利用生物标志物SNORD33预测三阴性乳腺癌患者铂类治疗的疗效，以及用于铂类治疗前的三阴性乳腺癌患者，通过血浆SNORD33检测试剂盒，指导个体化治疗方案，包括检测受试者血浆SNORD33水平变化的方法，以及通过人血浆SNORD33检测试剂盒对受试者进行检测，将未接受铂类治疗前受试者血浆SNORD33作为一种生物标记物用于三阴性乳腺癌患者铂类治疗有效率及疾病控制时长的预测。对于血浆SNORD33高水平的受试者，选择铂类药物治疗疗效较好；对于血浆SNORD33低水平的受试者，考虑选择其他药物。检测血浆SNORD33水平能更精准的有助于指导三阴性乳腺癌患者的治疗。

Description

小核仁核糖核酸SNORD33作为生物标记物用于制备检测试剂盒中的用途

技术领域

本发明属于生物诊断检测技术领域，涉及人血浆小核仁核糖核酸(SNORD33)的分离、定性和定量分析，以及涉及乳腺癌患者的疗效预测。具体涉及SNORD33作为生物标记物用于制备检测试剂盒中的用途，更具体地，涉及一种利用血浆中的小核仁核糖核酸的水平预测三阴性乳腺癌患者铂类药物治疗的疗效，判断三阴性乳腺癌患者接受铂类药物后的有效率、疾病控制时长以及预后。本发明进一步涉及用于提高铂类药物有效性的预测方法。

背景技术

资料记载了乳腺癌是全世界女性中最多罹患的侵袭性癌症，同时也是引起女性肿瘤相关死亡的最常见原因之一。三阴性乳腺癌(TNBC)是***受体(ER)阴性、孕激素受体(PR)阴性、人表皮生长因子受体2(HER2)阴性的一类分子亚型，占所有类型的乳腺癌中的12–17％。研究表明，TNBC是一类具有异质性的乳腺癌亚型，其恶性程度高，具有高侵袭及转移性，患者复发比例高、疾病进展时间短、总体生存率低，是亟待解决的难点问题。

精准医学时代的到来使得业内对TNBC的研究日益深入，使得越来越多的靶向药物应用到TNBC的治疗中，但靶向治疗在TNBC中的疗效仍不肯定，化疗仍具有不可替代的地位。近期有研究提示铂类药物在TNBC的治疗中有着重要作用；铂类化疗药物通过与双链DNA交联致其断裂、阻滞DNA复制、转录并最终导致细胞死亡；研究表明，部分三阴性乳腺癌有着与基底样乳腺癌相似的分子特征，分子表达的一致性高达70-90％，其中11.2％-14.3％的三阴性乳腺癌患者存在BRCA1/2突变，而BRCA1基因在DNA复制过程中，与DNA双链断裂时的同源重组修复密切相关；铂类化疗药物由于增加了DNA双链的断裂，导致BRCA1突变的乳腺癌细胞在DNA双链断裂后不能修复后出现停止生长，甚至死亡。铂类在临床的应用中也显示出良好的疗效，与其他化疗联合治疗时，其有效率可达64％，但仍有相当一部分患者对铂类药物不敏感或药物控制较短时间后即出现进展。现有的预测指标，包括BRCA1/2突变、HRD-LOH、HRD-LST、HRD-TAI等指标对三阴性乳腺癌铂类疗效的预测作用仍不肯定，亟需预测作用肯定且检测便利的分子标志物对铂类的疗效进行预测。

小核仁核糖核酸是一类小分子非编码RNA，结构保守，代谢稳定，多富集于核仁，广泛存在于有核细胞中；其主要功能是参与包括核糖体RNA(ribosomal RNA)、小核RNA(smallnuclear RNA)在内的多种RNA前体的修饰和成熟过程，影响核糖体的生物合成以及剪接体的剪切组装功能。小核仁核糖核酸常通过与特定RNA结合蛋白质结合，在包括遗传、造血、代谢、神经***等疾病的发生发展中扮演重要作用。且小核仁核糖核酸在B细胞淋巴瘤、***癌、乳腺癌等多种肿瘤中不同程度的改变，且在通过对比包括乳腺癌、肾癌、***癌等14种肿瘤后发现，其中13种肿瘤较正常组织出现特定若干小核仁核糖核酸的改变，这些现象提示肿瘤的发生发展与小核仁核糖核酸的相关性；同时，小核仁核糖核酸在血浆RNA中的含量丰富，与细胞内小核仁核糖核酸相关性较好，可作为一种液体活检的新的生物标志物，预测患者的预后及药物敏感性。既往研究已在包括乳腺癌在内的多种肿瘤中，验证了血浆中的小核仁核糖核酸含量与患者肿瘤临床病理恶性程度以及预后的相关性，因此，研究人员猜想小核仁核糖核酸表达改变是肿瘤发生发展的重要因素，且小核仁核糖核酸完全可以作为一种新的疾病诊断以及疗效预测的标志物，其在疾病过程中发生的特异性变化，可以帮助了解疾病的发展阶段以及预测机体对药物的反应性，对小核仁核糖核酸的研究和分析将为肿瘤的诊断和治疗提供新途径。

基于现有技术的基础与现状，本申请的发明人拟提供小核仁核糖核酸SNORD33作为生物标记物用于制备检测试剂盒中的用途。

发明内容

本发明的目的是基于现有技术的基础与现状，提供小核仁核糖核酸SNORD33作为生物标记物用于制备检测试剂盒中的用途。本发明涉及将血浆SNORD33的特异性变化应用于预测三阴性乳腺癌患者铂类治疗敏感性的方法，以及涉及定性或定量检测人血浆SNORD33的引物在预测铂类疗效的试剂盒中的应用。本发明的又一目的是提供一种体外辅助预测三阴性乳腺癌的试剂盒。

基于本申请选取SNORD33作为研究对象的研究发现，治疗前血浆小核仁核糖核酸SNORD33(small nucleolar RNA,C/D box 33，NC_000019.10)水平低的TNBC患者，其接受顺铂治疗的有效率低，无进展时间短；所以SNORD33可用作预测TNBC患者铂类药物疗效的生物标记物；与所述接受铂类药物治疗有效的三阴性乳腺癌受试者血浆样品相比，SNORD33在来自接受铂类药物治疗无效的三阴性乳腺癌受试者血浆样品中的水平显著减少，并且SNORD33在血浆样品中高水平的三阴性乳腺癌受试者，其接受铂类药物治疗的无进展生存时间(progression-free survival,PFS)较SNORD33在血浆样品中低水平所述受试者显著延长；血浆小核仁核糖核酸SNORD33水平低的TNBC患者，其接受顺铂治疗的有效率低，无进展生存时间短，因而，本发明提出“通过检测血浆SNORD33水平，以预测TNBC患者接受铂类治疗的疗效”的方法。可以预测TNBC患者接受铂类后有效率、疾病控制时长，并根据患者治疗前血浆SNORD33水平，选择是否进行铂类治疗，从而达到个性化、精准化的治疗的目的。

本发明通过检测血浆中SNORD33解决TNBC患者铂类药物疗效预测等问题；更具体的，提供小核仁核糖核酸SNORD33作为生物标记物用于制备检测试剂盒中的用途。

本发明的目的通过下述技术方案：

采用所述的小核仁核糖核酸SNORD33作为生物标记物制备得检测试剂盒，通过定性或定量检测人血浆SNORD33的引物，用荧光定量PCR技术检测SNORD33在所述三阴性乳腺癌患者受试者血浆样本中水平；比较SNORD33在来自于所述铂类治疗有效的受试者的血浆样品中的水平与SNORD33在所述铂类治疗无效的受试者的血浆样品中的水平；以及确定SNORD33预测铂类有效性的最佳界值。

通过受试者血浆SNORD33与界值的比较，预测三阴性乳腺癌患者铂类的疗效。

进一步，可以通过检测SNORD33在三阴性乳腺癌受试者的血浆样品中表达量预测铂类药物治疗的疗效；并且可根据受试者血浆SNORD33表达水平指导铂类药物的选用；对于血浆SNORD33高水平的受试者，选择铂类药物治疗疗效较好；对于血浆SNORD33低水平的受试者，可考虑选择其他抗肿瘤治疗药物，因此能够更好的指导三阴性乳腺癌患者的治疗。

本发明中，对于SNORD33的检测方法可通过任何有效途径来进行，包括荧光定量PCR方法、RT-PCR方法、Northern blotting方法、RNase protection assay、Solexasequencing technology以及生物芯片方法中的一种或几种。

本发明中，优选荧光定量PCR方法，其包括：(1)提取受试者血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；(2)用小核仁核糖核酸设计引物；(3)加入荧光探针进行PCR反应；(4)检测并比较血清/血浆样品相对于设定的预测界值中小核仁核糖核酸的量的变化。

本发明中，另优选RT-PCR方法，其包括步骤：(1)提取受试者血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；(2)用小核仁核糖核酸设计的引物进行PCR反应；(3)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；(4)EB染色后紫外灯下观察结果。

本发明中，所述Northern blotting方法包括步骤：(1)提取受试者血清/血浆总RNA(例如使用Trizol试剂提取)；(2)变性PAGE电泳和膜转移实验；(3)制备同位素标记小核仁核糖核酸探针；(4)进行膜杂交反应；(5)同位素信号检测，如磷屏扫描检测结果。

本发明中，所述RNase protection assay方法包括步骤：(1)进行反义RNA探针的合成，同位素标记与纯化；(2)提取受试者血清/血浆总RNA(例如使用Trizol试剂提取)；(3)将提取后的RNA溶解在杂交缓冲液中并加入反义RNA探针进行杂交；(4)加入RNase消化液进行反应；(5)进行电泳与放射自显影；(6)分析结果。

本发明中，所述Solexa sequencing technology方法包括步骤：(1)提取受试者血清/血浆总RNA(例如使用Trizol试剂提取)；(2)进行PAGE电泳回收80-90ntRNA分子；(3)将adaptor primer酶联在小RNA分子的3’与5’端；(4)进行RT-PCR反应后并进行测序；(5)数据分析与处理。

本发明中，所述生物芯片方法包括步骤：(1)将人体血浆中全部小核仁核糖核酸库点阵并制备生物芯片；(2)提取受试者血浆总RNA(例如使用Trizol试剂提取)；(3)通过柱分离来分离小核仁核糖核酸；(4)利用T4 RNA连接酶进行小核仁核糖核酸荧光标记；(5)与生物芯片进行杂交反应；(6)数据检测与分析。

本发明所述上述方法中所使用的血清/血浆来源于受试者活体、组织、器官或/和尸体。

前期实验结果显示，在三阴性乳腺癌患者血浆样品中，SNORD33水平在铂类治疗无效的受试者中显著低于治疗有效的受试者；并且SNORD33低水平的受试者，其铂类治疗的PFS时间显著短于SNORD33高水平的受试者。

本发明SNORD33表达水平可以作为一种明确、有效、直观的疗效预测的生物标志物，诊断和预测三阴性乳腺癌患者接受铂类治疗后疗效、有效率、疾病控制时长以及预后，指导三阴性乳腺癌患者的用药，达到个体化治疗的目的；其预测疗效的铂类药物是包括顺铂、卡铂、奥沙利铂、洛铂、奈达铂在内的所有铂类化疗药物；可检测标本包括受试者活体、组织、器官和/或尸体中收集的血清/血浆；SNORD33作为疗效预测生物标志物可以通过任何有效途径来检测，包括荧光定量PCR方法、RT-PCR方法、Northern blotting方法、RNaseprotection assay、Solexa sequencing technology以及生物芯片方法中的一种或几种；通过荧光定量PCR方法，利用包含人血浆SNORD33的引物的三阴性乳腺癌铂类疗效预测试剂盒在受试者中进行检测。

本发明利用血浆SNORD33进行个体化，精准化治疗：对于血浆SNORD33高水平的受试者，选择铂类药物对三阴性乳腺癌具有更好的抑制作用；对于血浆SNORD33低水平的受试者，可考虑选择其他抗肿瘤治疗药物。通过检测血浆SNORD33水平指导临床上三阴性乳腺癌患者的铂类药物的选用。

本发明所涉及的检测血浆中的SNORD33有以下优势：首先，血浆较组织容易获得，平时日常诊疗活动中都可以收集到；其次，SNORD33反映的是机体整体的生理病理情况，其检测具有指导意义；第三，SNORD33可以实时反映机体目前所处的状态，较原发灶组织更能贴近机体的实际情况，同时还可以通过SNORD33监控其实时变化。綜上，利用小核仁核糖核酸SNORD33作为生物标记物制备的检测试剂盒检测血浆中的SNORD33，无创简便且预测作用明确，从血浆的小核仁核糖核酸的特异性变化着一新角度预测药物的疗效，并指导治疗，本发明将有助于建立一种更敏感更精确的用于个体化治疗的技术方案。

附图说明

图1：三阴性乳腺癌患者血浆中能检测到SNORD33的荧光定量PCR的扩增曲线及溶解曲线的实验图。

图2：三阴性乳腺癌铂类治疗无效的患者血浆SNORD33相对于有效患者血浆SNORD33的变化量。

图3：血浆SNORD33低表达的三阴性乳腺癌患者相对于血浆SNORD33高表达患者的顺铂治疗的无进展生存时间的差异。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。需要强调的是，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在不偏离与本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。除非另行定义，所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中，这些等同物被认为处在本发明的范围之内，并且被权利要求所覆盖。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1.样本要求及样本处理方法

本实施例的目的是说明对于受试者采集的血清/血浆标本的要求及具体处理方法。

样本要求：

(1)样本类型：血浆，血浆以新鲜采集分离为好，采血6小时内必须分离、收集血浆，采集的全血放入EDTA素抗凝管，并将血浆转移至一次性使用的无RNA酶的无菌微量离心管中；

(2)血清样本置于室温可稳定保存24小时，2-8℃可稳定保存7天，-18℃一下可稳定保存6个月；

(3)血清/血浆来自于签订了知情同意书的受试者，受试者在取血前未使用铂类药物的治疗；

(4)血清/血浆样本提取出的RNA，室温可稳定保存12小时，2-8℃可稳定保存3天，-18℃一下可稳定保存3个月；

处理方法：

(1)将全血样本处理成血浆：采集静脉血2ml，于5ml洁净离心管中，抗凝。静置30分钟后，5000rpm离心5分钟，取其上清。如果样本不立即使用，需-18℃以下保存，本实施例所需血浆样本体积为200ul；

(2)血浆样本的RNA提取：使用Qiagen miRNeasy Mini Kit试剂盒，遵循厂商说明进行操作，在制备血浆样品的同时，制备好阳性质控品及阴性质控品。

实施例2.逆转录操作过程

逆转录体系如表1所示：

表1

名称	体积
		2x miRNA逆转录反应缓冲液	5ul
miRNA逆转录酶mix	1ul
		RNA	1ul
DEPC水	3ul
		总体积	10ul

实验操作：

(1)计算反应体系：按照检测样本量计算逆转录反应体系所需体系量；

(2)按照表1以及天根miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒的配制反应体系，遵循厂商说明进行操作；

(3)分布反应混合液：将步骤(2)所得混合液9ul/孔分布于相应96孔板中；

(4)加入样品：所有提取后的待测血浆样本RNA、提取后的阴性质控品及阳性质控品、标准品S1-S4、空白对照1ul置于(3)步骤中的96孔板中，贴膜；

(5)混匀：96孔PCR板置于涡旋震荡仪上涡旋约5s，然后置于板式离心机(1500rmp，30s)进行离心；

反应程序：将96孔板置于PCR仪中，按照miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒进；

将逆转录后所得的cDNA样品用DEPC水稀释10倍。

实施例3.荧光定量PCR过程

实验体系如表2所示：

表2

名称	体积
		SYBR	10ul
引物探针(SNORD33引物或U6引物)F	0.4ul
		引物探针(SNORD33引物或U6引物)R	0.4ul
ROX	0.4ul
		cDNA	2ul
DEPC水	6.8ul
		总体积	20ul

SNORD33引物正向序列为GGCCGGTGATGAGAA，反向序列为CGAATGTGAGTGGGAGAA，内参U6引物正向序列为CTCGCTTCGGCAGCACA，反向序列为AACGCTTCACGAATTTGCGT；

实验操作：

(1)计算反应体系：按照检测样本量计算荧光定量PCR反应体系所需体系量；

(2)按照表2以及TAKARA

qPCR Premix试剂盒的配制反应体系，遵循厂商说明进行操作；

(3)分布反应混合液：将步骤(2)所得混合液18ul/孔分布于相应96孔板中；

(4)加入cDNA：所有逆转录所得的样品cDNA 2ul置于(3)步骤中的96孔板中，贴膜；

(5)混匀：96孔PCR板置于涡旋震荡仪上涡旋约5s，然后置于板式离心机(1500rmp，30s)进行离心；

3.反应程序：将96孔板置于ABI7500或ABI7300荧光定量PCR仪中，按照TAKARA

qPCR Premix试剂盒进行qPCR反应。于每个循环的第二步，即：60℃收集荧光信号。

实施例4.产品的质量要求

本实施例中SNORD33标准品的线性范围为10⁶-10³拷贝/ul；

准确度：准确度即阳性符合率，用质控标本中的10分阳性参考品P1-P10(其中SNORD33的浓度＞20000copy/ul)对SNORD33进行测定，检测结果均应为阳性，即10/10；对内对照U6进行测定，检测结果均应符合Ct＜26.5；

特异度：特异度即阴性符合率，用质控标本中的10分阴性参考品N1-N10(其中SNORD33的浓度＜20000copy/ul)对SNORD33进行测定，检测结果均应为阴性，即10/10；对内对照U6进行测定，检测结果均应符合Ct＜26.5；

检测阈值：本专利SNORD33最低检测阈值应≤10³拷贝/ul，检测SNORD33的10³拷贝/ul的标准品20次，至少17次检测结果高于最低检测阈值的判读值；

本申请对阳性质控品、阴性质控品和空白对照有效性的要求：

经抽提后阳性质控品应满足：10⁵拷贝/ul＜SNORD33相对拷贝数＜10⁶拷贝/ul，内对照Ct＜26.5；

经抽提后阴性质控品应满足：10³拷贝/ul＜SNORD33相对拷贝数＜10⁴拷贝/ul，内对照Ct＜26.5；

经抽提后空白对照应满足：SNORD33相对拷贝数＜10³拷贝/ul，内对照Ct＜26.5；

精密度：批次内精密度的测定方法：阳性质控品、阴性质控品各平行检测10次，SNORD33检测应符合相对拷贝数的变异系数(CV,％)＜5％，内对照检测应符合Ct变异系数(CV,％)＜5％；

经过对临床常见的高浓度甘油三酯、胆红素、血红蛋白血浆样本的***研究，此类样本不影响本试剂盒的定性检测结果。

实施例5.检测结果分析和判读

表达水平的计算：公式为SNORD33表达水平＝2^-ΔΔCt；

受试者血浆样品中SNORD33表达水平结果如图2所示，铂类治疗有效的受试者(n＝13)血浆样品中SNORD33表达水平(2.7±0.8)显著高于铂类治疗无效的受试者(n＝17)血浆样品中SNORD33表达水平(0.5±0.1，P<0.001)；

血浆样品中SNORD33表达水平预测界值0.69，低于此界值可定义为三阴性乳腺癌患者对铂类治疗不敏感；受试者血浆样品中SNORD33表达水平与无进展生存时间预测相关性结果如图3所示，血浆样品中SNORD33表达水平低的患者，其接受顺铂治疗后的无进展生存时间显著低于血浆样品中SNORD33表达水平高的患者(P＝0.005)；

本实施例结果的解释方法为：

检测样品SNORD33表达量＞0.69，考虑此三阴性乳腺癌患者后续铂类药物治疗有效的可能性大；

检测样本SNORD33表达量≤0.69，考虑此三阴性乳腺癌患者后续铂类药物治疗有效的可能性小。

实施例6制备小核仁核糖核酸试剂盒

基于定量PCR技术用于预测三阴性乳腺癌铂类疗效的小核仁核糖核酸的试剂盒的专门制作工艺和流程操作，实验包括常用的SYBR、dNTP、以及优选的人血浆SNORD33的引物，通过制备的试剂盒，用于检测三阴性乳腺癌患者铂类治疗前血浆的SNORD33水平，预测患者接受铂类治疗的敏感性以及疗效，利用血浆SNORD33水平进行个体化，精准化治疗，指导临床上三阴性乳腺癌患者的铂类药物的选用。

Claims (1)

1.检测小核仁核糖核酸SNORD33表达水平的试剂用于制备预测三阴性乳腺癌顺铂疗效的试剂盒中的用途，其特征在于，通过检测SNORD33的表达水平，用于区分三阴性乳腺癌患者接受铂类药物治疗的有效性。

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