CN113061176B

CN113061176B - 一种草鱼抗菌蛋白lect2及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113061176B
Application number: CN202110267641.3A
Authority: CN
Inventors: 张永安; 张旭杰; 胡亚珍
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2021-03-12
Filing date: 2021-03-12
Publication date: 2022-08-16
Anticipated expiration: 2041-03-12
Also published as: CN113061176A

Abstract

本发明公开了一种草鱼抗菌蛋白LECT2及其制备方法和应用，属于基因工程技术领域，其中所述草鱼抗菌蛋白LECT2的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明采用大肠杆菌BL21(DE3)Rosetta表达草鱼抗菌蛋白LECT2，并经Ni²⁺‑TED琼脂糖凝胶柱纯化、肠激酶酶切和离子交换层析纯化后得到LECT2重组蛋白，并发现该LECT2蛋白对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有显著的杀菌效果，可用于制备广谱抗菌剂或抗菌药物，以保护草鱼免受细菌感染。通过将其注射至感染草鱼体内，显著增强了草鱼对细菌感染的抵抗力，提高了草鱼成活率并降低各组织中的载菌量，具有较高的应用价值。

Description

一种草鱼抗菌蛋白LECT2及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种草鱼抗菌蛋白LECT2及其制备方法和应用。

背景技术

随着水产养殖业的发展，由于抗生素的不断使用，抗生素耐药性问题日益严重，严重影响水产养殖业的可持续发展。因此，开发新型抗菌药物替代传统抗生素在水产养殖业中的应用迫在眉睫。抗菌肽(Antibacterial peptide，又叫抗微生物肽(Antimicrobialpeptide)、抗生素肽(Antibiotics peptide))和抗菌蛋白，是由多种生物细胞特定基因编码产生的一类具有广谱抗细菌、真菌、病毒、原虫、抑杀肿瘤细胞等活性作用的多肽或蛋白。因其具有热稳定性、不易获得耐药性、效果稳定等特点，被认为对病害防控有着广大的应用前景。

哺乳动物白细胞衍生趋化因子2(Leukocyte-derived chemotaxin-2，LECT2)属于金属肽酶M23家族，是由肝脏分泌的多功能细胞因子，参与调节肝再生、维持自然杀伤T细胞稳态以及细胞癌变等生物学过程；此外LECT2通过参与机体免疫细胞的定向趋化及吞噬细胞的激活而调控机体的细胞免疫反应。

发明内容

本发明的目的在于提供一种草鱼抗菌蛋白LECT2及其制备方法和应用。本发明首次发现来源于草鱼的LECT2蛋白具有广谱的抗菌活性，可用于制备广谱抗菌剂，以保护养殖鱼类免受细菌感染。

本发明的目的之一在于提供了一种草鱼抗菌蛋白LECT2，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。

本发明的目的之二在于提供了一种编码所述草鱼抗菌蛋白LECT2的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的目的之三在于提供了一种载体，所述载体包含上述核苷酸序列。

本发明的目的之四在于提供了一种工程菌，所述工程菌包含上述载体。

本发明的目的之五在于提供了上述草鱼抗菌蛋白LECT2制备抗菌药物或抗菌剂中的应用。

进一步地，所述抗菌药物或抗菌剂用于抗革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌。

进一步地，所述革兰氏阴性菌包括：大肠杆菌E.coli(Escherichia coli)、荧光假单胞杆菌P.fluorescens(Pseudomonas fluorescens)、拟态弧菌V.mimicus(Vibriomimicus)和嗜水气单胞菌A.hydrophila(Aeromonas hydrophila)；

所述革兰氏阳性菌包括：金黄色葡萄球菌S.aureus(Staphylococcus aureus)、无乳链球菌S.agalactiae(Streptococcus agalactiae)和藤黄微球菌M.luteus(Micrococcus luteus)。

本发明的目的之六在于提供了一种所述草鱼抗菌蛋白LECT2的制备方法，所述方法包括：

步骤1、克隆草鱼LECT2基因；

步骤2、将草鱼LECT2基因与载体连接，并转化至表达菌株中得到重组工程菌；

步骤3、诱导重组工程菌表达目的蛋白，并纯化目的蛋白，即得所述草鱼抗菌蛋白LECT2。

进一步地，所述步骤1中，以草鱼cDNA为模板，以SEQ ID NO:3所示的上游引物和SEQ ID NO:4所示的下游引物进行PCR扩增，得到草鱼LECT2基因。

进一步地，所述步骤2中，将草鱼LECT2基因与pET-32a质粒连接，并转化至BL21(DE3)Rosetta表达菌株中得到重组工程菌。

进一步地，所述步骤3中，诱导重组工程菌表达目的蛋白，经Ni²⁺-TED琼脂糖凝胶柱纯化得到TrxA-LECT2融合蛋白，用肠激酶酶切后，利用离子交换层析纯化得到如SEQ IDNO:1所示的草鱼抗菌蛋白LECT2。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用大肠杆菌BL21(DE3)Rosetta表达草鱼抗菌蛋白LECT2，并经Ni²⁺-TED琼脂糖凝胶柱纯化、肠激酶酶切和离子交换层析纯化后得到LECT2重组蛋白，并发现该重组蛋白LECT2对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有显著的杀菌效果，即具有广谱抗菌活性，可用于制备广谱抗菌剂或抗菌药物，以保护养殖鱼类免受细菌感染，通过将其注射至细菌感染的草鱼体内，显著增强了草鱼对细菌感染的抵抗力，提高了草鱼成活率并降低各组织中的载菌量，该抗菌蛋白LECT2具有较高的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中LECT2重组蛋白纯化检测结果图，其中泳道M：ProteinMarker；泳道1：TrxA-LECT2融合蛋白；泳道2：TrxA-LECT2酶切产物；泳道3：纯化后的LECT2重组蛋白；

图2为本发明实施例3中感染草鱼注射LECT2蛋白后的成活率统计结果，其中图A为感染后3h注射LECT2蛋白和对照组的成活率统计结果，图B为感染后12h注射LECT2蛋白和对照组的成活率；

图3为本发明实施例3中感染草鱼注射LECT2蛋白后不同组织的载菌量统计结果，其中Head-kidney为头肾组织的载菌量统计结果，Intestine为肠道组织的载菌量统计结果，Liver为肝脏组织的载菌量统计结果，Spleen为脾脏组织的载菌量统计结果。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1草鱼LECT2重组蛋白的制备

(1)草鱼LECT2基因扩增

根据NCBI上草鱼LECT2的基因序列及pET-32a载体上的多克隆位点，使用PrimerPremier 5.0软件设计分别带Kpn I和EcoR I酶切位点以及肠激酶酶切位点的特异性引物，其中上游引物(如SEQ ID NO:3所示)和下游引物(如SEQ ID NO:4所示)分别为：

Up:cgg^a ggtacc^b gacgacgacgacaag^c AGTCGAGTGAAATTTGGCACC，

Down:ccg^d gaattc^e TCAAAAATACTTGGTGGGATCTGA。

其中^a和^d代表酶切位点的保护碱基，^b和^e分别代表Kpn I和EcoR I酶切位点，^c代表肠激酶酶切位点。

以草鱼cDNA为模板克隆如SEQ ID NO:2所示的目的基因LECT2(该基因中不包含信号肽序列)，并使用PCR产物回收试剂盒回收PCR产物。

(2)BL21-pET-32a-LECT2工程菌获得

将步骤(1)中的PCR回收产物与pET-32a质粒经Kpn I和EcoR I双酶切后，酶切产物使用T4 DNA连接酶连接，然后转化至DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆并测序。测序正确的菌株将其质粒转化至BL21(DE3)Rosetta表达菌株，阳性克隆即为含有pET-32a-LECT2重组质粒的工程菌(BL21-pET-32a-LECT2)。

(3)TrxA-LECT2融合蛋白的原核表达及纯化

1)配制结合缓冲液A，pH 7.4：3.8mM Na₂HPO₄，16.2mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，15mM咪唑，10％甘油；洗杂缓冲液B，pH 7.4：3.8mM Na₂HPO₄，16.2mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，50mM咪唑，10％甘油；洗脱缓冲液C，pH 7.4：3.8mM Na₂HPO₄，16.2mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，300mM咪唑，10％甘油。

2)将工程菌BL21-pET-32a-LECT2接种至含氨苄青霉素(100μg/mL)和卡那霉素(15μg/mL)的LB培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.6，加入IPTG至终浓度为0.75mM后于16℃诱导培养12h。

3)离心收集菌体(5000g，10min)后重悬于50mL预冷的A液，高压破碎10min后12000g离心60min，收集上清。

4)100mL A液平衡Ni²⁺-TED琼脂糖凝胶柱，上清与纯化填料室温孵育1h，200mL A液洗涤，200mL B液洗杂，20mL C液洗脱目的蛋白。洗脱后的目的蛋白以咪唑梯度、氯化钠和甘油梯度透析至缓冲液D中(3.8mM Na₂HPO₄，16.2mM NaH₂PO₄，50mM NaCl，2.5％甘油，pH7.4)，获得融合有TrxA标签的TrxA-LECT2融合蛋白。

(4)LECT2重组蛋白的纯化

1)配制结合缓冲液A，pH 7.4：3.8mM Na₂HPO₄，16.2mM NaH₂PO₄；洗脱缓冲液B，pH7.4：3.8mM Na₂HPO₄，16.2mM NaH₂PO₄，1M NaCl。

2)将肠激酶和TrxA-LECT2融合蛋白按照体积比1：1000混合，用于酶切TrxA-LECT2融合蛋白9h，获得酶切产物。

3)利用AKTA蛋白纯化***，HiTrap SP HP离子交换柱纯化LECT2蛋白，具体为：100mL A液平衡离子交换柱，TrxA-LECT2融合蛋白酶切产物以0.5mL/min流速与离子交换柱结合，90％A液与10％B液混合洗杂，70％A液与30％B液混合洗脱LECT2重组蛋白。洗脱后的目的蛋白于含15mM NaCl和0mM NaCl的A液中依次透析12h，超滤浓缩可得LECT2重组蛋白。LECT2重组蛋白纯化结果如图1所示，其中泳道M：Protein Marker；泳道1：TrxA-LECT2融合蛋白；泳道2：TrxA-LECT2酶切产物；泳道3：纯化后的LECT2重组蛋白。LECT2重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

实施例2草鱼LECT2蛋白体外抗菌活性检测

本实施例以本领域常见的共7种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌为例，以验证草鱼LECT2蛋白的体外广谱抗菌活性，其中包括：革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌S.aureus、无乳链球菌S.agalactiae、藤黄微球菌M.luteus；革兰氏阴性菌：大肠杆菌E.coli、荧光假单胞杆菌P.fluorescens、拟态弧菌V.mimicus、嗜水气单胞菌A.hydrophila。

(1)最小杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration，MBC)检测

1)取-80℃冷冻保存的7种菌株于TSA平板上划线接种，37℃(大肠杆菌、荧光假单胞杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和藤黄微球菌)或28℃(拟态弧菌、嗜水气单胞菌)培养18-24h；挑选TSA平板上的单个菌落接种到20mL TSB培养基中，振摇至对数期(3-5h)，离心(5000g，10min)收集菌体；

2)20mM Tris(pH 7.4)洗涤细菌两次(5000g，10min)，重悬后调整菌液浓度为5×10⁶CFU/mL。

3)取步骤2)中菌液10μL与90μL不同浓度的LECT2蛋白混合均匀，并于37℃或28℃孵育3h，CFU计数法统计各组细菌量。

4)根据以下公式计算抑菌率：

抑菌率＝(阴性对照菌落数-实验组菌落数)/阴性对照菌落数×100％

抑菌率﹥99％的最低蛋白浓度即为MBC，检测结果如表1所示。

表1 LECT2蛋白的抗菌活性检测结果

根据表1的检测结果，LECT2蛋白对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有较好的杀菌活性，即具备较好的广谱抗菌活性，可用于制备抗菌剂。

实施例3草鱼抗菌蛋白LECT2的应用

(1)实验动物

试验所用草鱼体重30±5g，购自湖北省黄冈市团风县百荣良种中心养殖场，饲养于华中农业大学水产学院养殖基地，暂养2周后随机分组开始正式试验。暂养期间每天喂食1次、换水1次，24h充氧，日投喂量为体质量的2％。

(2)腹腔感染模型的建立

以嗜水气单胞菌为例，建立草鱼腹腔感染模型，具体为：取-80℃冷冻保存的嗜水气单胞菌菌株(ZYAH72)，在TSA平板上划线接种，28℃培养18-24h；挑选TSA平板上的单个菌落接种到20mL TSB培养基中，振摇至对数期(3-5h)，离心(5000g，10min)；将其悬浮于无菌PBS中，以5×10⁵CFU/尾、1×10⁶CFU/尾、2×10⁶CFU/尾和4×10⁶CFU/尾四种浓度分别腹腔注射上述菌液，每个浓度感染20尾草鱼，注射完毕后于4天内观察和记录死亡情况，选取草鱼100％死亡率组对应的菌液剂量建立腹腔感染模型。最终确定实验中嗜水气单胞菌的最小致死剂量是2×10⁶CFU/尾。

(3)LECT2重组蛋白对草鱼病害的治疗作用

28℃水温，以步骤(2)中的最小致死剂量2×10⁶CFU/尾感染草鱼，于感染后3h或12h分别腹腔注射LECT2重组蛋白(30μg/尾)，对照组于感染细菌后3h或12h注射空白PBS。自此连续观察7天，统计死亡情况并计算成活率，成活率的统计结果如图2所示，其中图A为感染后3h注射LECT2蛋白和对照组的成活率统计结果，图B为感染后12h注射LECT2蛋白和对照组的成活率。结果显示，注射LECT2重组蛋白的实验组，其发病率显著下降，3h和12h注射组的平均成活率分别为56％和68％，而注射空白PBS液的对照组在3d内全部死亡，表明注射LECT2重组蛋白能显著增强草鱼对嗜水气单胞菌感染的抵抗力，提高平均成活率。

在草鱼感染并注射LECT2重组蛋白后48h，使用MS-222对草鱼进行麻醉，取头肾、肠道、肝脏和脾脏，经PBS稀释匀浆后将组织液均匀涂布于RS琼脂培养基表面，28℃恒温孵育24h，进行菌落计数，并以注射PBS液的草鱼组织菌落计数结果作为对照。检测结果如图3所示，其中Head-kidney为头肾组织的载菌量统计结果，Intestine为肠道组织的载菌量统计结果，Liver为肝脏组织的载菌量统计结果，Spleen为脾脏组织的载菌量统计结果。结果显示，向感染草鱼体内注射LECT2蛋白后，草鱼各组织的载菌量均显著下降，其中头肾下降10-1000倍，肠道、肝脏和脾脏下降100-1000倍。结果表明，LECT2蛋白在草鱼体内也具有较强的杀菌效果，因此可制备成抗菌药物用以治疗由于细菌感染导致的疾病。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种草鱼抗菌蛋白LECT2及其制备方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 136

<212> PRT

<213> 草鱼(Ctenopharyngodon idella)

<400> 1

Ser Arg Val Lys Phe Gly Thr Leu Cys Ser Arg Asn Pro Ser Asn Arg

1 5 10 15

Gln Arg Gly Cys Asp Lys Lys Tyr Gly Cys Gly His Tyr Gly Ala Lys

20 25 30

Arg Gly Asn Arg Lys His Met Gly Leu Asp Ile Met Cys Ala Asp Gly

35 40 45

Asp Thr Val Val Ala Pro Phe Asp Val Lys Leu Asn Gly Arg Ser Met

50 55 60

Pro Tyr Ser Gln Asn Asn Ala Ile Asn Asp Gly Ile Asn Leu Ser Gly

65 70 75 80

Gln Gly Leu Cys Phe Lys Leu Phe Tyr Val Lys Pro Asp Arg Tyr Ser

85 90 95

Gly Thr Leu Lys Lys Gly Gln Arg Ile Gly Arg Met Leu Pro Met Gln

100 105 110

Arg Val Tyr Pro Gly Ile Thr Ser His Val His Val Gln Met Cys Asp

115 120 125

Arg Ser Asp Pro Thr Lys Tyr Phe

130 135

<210> 2

<211> 411

<212> DNA

<213> 草鱼(Ctenopharyngodon idella)

<400> 2

agtcgagtga aatttggcac cctctgcagt cgtaacccaa gtaaccgtca aagaggatgt 60

gataaaaagt atggctgtgg acactatgga gccaagcgtg ggaatcggaa acatatgggt 120

cttgacatta tgtgtgctga tggagacaca gttgttgctc catttgatgt gaagttgaac 180

ggcagatcta tgccatactc acagaacaac gctatcaatg atggcattaa cttgagcgga 240

caaggtctct gcttcaagct gttctacgtt aagccagacc gttactctgg gaccctaaag 300

aaagggcaga ggatcggacg tatgctccca atgcagaggg tttatcctgg catcacttcc 360

catgttcacg ttcaaatgtg tgacagatca gatcccacca agtatttttg a 411

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cggggtaccg acgacgacga caagagtcga gtgaaatttg gcacc 45

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccggaattct caaaaatact tggtgggatc tga 33

Claims

1.草鱼抗菌蛋白LECT2在制备抗菌药物或抗菌剂中的应用，其特征在于，所述草鱼抗菌蛋白LECT2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，所述抗菌药物或抗菌剂用于抗革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，革兰氏阴性菌包括：大肠杆菌、荧光荧光假单胞杆菌、拟态弧菌和嗜水气单胞菌；

所述革兰氏阳性菌包括：金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和藤黄微球菌。