CN107119006B - 一种快速培养金黄色葡萄球菌的方法 - Google Patents

一种快速培养金黄色葡萄球菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速培养金黄色葡萄球菌的方法，属于酶制剂技术领域。本发明是向每100mL水中加入10～14g牛肉浸粉，加入氨肽酶和中性蛋白酶进行酶解，以酶解的产物进行冻干后配成培养基，对金黄色葡萄球菌进行培养。该方法处理下的培养基中多肽分子量小于500的占总量的75.48％，能够有效促进金黄色葡萄球菌的生长，缩短培养周期，使金黄色葡萄球菌的培养周期缩短将近9～15h。

Description

一种快速培养金黄色葡萄球菌的方法
技术领域
本发明涉及一种快速培养金黄色葡萄球菌的方法，属于酶制剂技术领域。
背景技术
牛肉原料酶解产物作为氮源存在于多种培养基中，如普通培养基、检测培养基和发酵培养基等。这类氮源有两种形式，一种是膏状的，但膏状物存在溶解性差，称量费劲并且伴随浪费严重，因此牛肉浸粉因为具备溶解性好，方便使用等优点得到比较多的应用。国内外的牛肉浸粉因为原料和生产工艺的不同在质量上差别还是比较大。牛肉浸粉应用面很宽，对国产牛肉浸粉通过酶解改善其多肽和氨基酸的成分及比例，找出提升其品质的一些规律，在相关行业有重要的学术和应用意义。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是兼性厌氧的革兰氏阳性菌，是医院获得性感染中最常见和食源性疾病的病原体之一。金黄色葡萄球菌毒素和毒力蛋白酶通常在宿主血管中循环导致危及生命的疾病，病原体通常在开放性伤口和尿道中生长，从轻微的皮肤感染到危及生命的疾病如脓肿，肺炎，脑膜炎，心内膜炎和败血病。金黄色葡萄球菌可以生活在恶劣的环境中，容易污染冷冻食品、水等物品，在每个国家，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占的比例较大，成为世界性的公共卫生问题。因此，尽可能缩短检测时间，尽早检测和鉴定出金黄色葡萄球菌，对于公共卫生和食品安全的监测和控制具有重要的意义。现有的检测方法通常将培养的金黄色葡萄球菌的菌液稀释104倍后，涂布在培养基上进行菌落计数，然而受到金黄色葡萄球菌的生长周期的限制，通常要24h后才能对菌落进行计数。
发明内容
为解决现有技术检测周期长的问题，本发明的第一个目的是提供一种快速培养金黄色葡萄球菌的方法，是向含有牛肉浸粉的溶液中同时加入氨肽酶和蛋白酶进行酶解，以酶解后的溶液作为培养基成分对金黄色葡萄球菌进行培养。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基中还含有NaCl、蛋白胨。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基中，酶解前的牛肉浸粉、NaCl和蛋白胨的质量比为：8～12:1:3～5。
在本发明的一种实施方式中，所述酶解是按200U/g牛肉浸粉的加酶量加入氨肽酶，和/或按0.44～1.5×104U/g牛肉浸粉的加酶量加入中性蛋白酶。
在本发明的一种实施方式中，所述酶解是对浓度为100～140g/L牛肉浸粉溶液进行酶解。
本发明的一种实施方式中，所述氨肽酶添加量为200U/g牛肉浸粉。
本发明的一种实施方式中，所述中性蛋白酶添加量0.44～1.5×104U/g牛肉浸粉。
本发明的一种实施方式中，所述酶解是在40℃～50℃下进行。
本发明的一种实施方式中，所述酶解时间为1～5h。
本发明的一种实施方式中，所述酶解pH为7.5～8.0。
本发明的一种实施方式中，所述培养金黄色葡萄球菌在培养前经过活化，所述活化培养基LB成分为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述培养是在36～38℃培养10～42h。
在本发明的一种实施方式中，所述牛肉浸粉的浓度为120g/L，氨肽酶添加量200U/g底物，中性蛋白酶添加量2.5×104U/g底物，反应温度50℃，pH7.5，反应时间1h。
本发明的第二个目的是提供一种用于快速培养金黄色葡萄球菌的培养基，所述培养基含有3～5g/L牛肉浸粉，并经过氨肽酶和蛋白酶酶解处理。
在本发明的一种实施方式中，所述酶解是按200U/g牛肉浸粉的加酶量加入氨肽酶，和/或按0.44～1.5×104U/g牛肉浸粉的加酶量加入中性蛋白酶。
本发明的一种实施方式中，所述酶解是在40℃～50℃下进行。
本发明的一种实施方式中，所述酶解时间为1～5h。
本发明的一种实施方式中，所述酶解pH为7.5～8.0。
本发明还要求保护所述培养基及培养方法在食品、医药领域食源性致病菌检测方面的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括制备食源性致病菌快速检测试剂盒。
本发明的有益效果；1、本发明提供了一种快速检测金黄色葡萄球菌的一种氮源的酶解优化策略，从而促进金黄色葡萄球菌的生长。经过酶解后的牛肉浸粉中多肽分子量小于500的占总量的75.48％，对金黄色葡萄球菌有明显的促生长作用，使其在同菌浓条件下培养24h后获得的OD值分别是酶解前和市场销售牛肉浸粉的2倍和2.9倍。2、应用本发明的培养基在平板上检测，培养24后即出现小菌落，培养36h后，菌落特征明显，便于定性和定量分析。相比于食品领域标准的平板检测方法(培养周期45～48h)时间缩短将近9～15h。3、本发明的培养基对菌株有冷冻复原的能力，能够有效缩短菌株的活化时间。
附图说明
图1为酶解牛肉浸粉流程示意图；
图2为不同酶解时间的产物对金黄色葡萄球菌生长的影响；
图3为不同酶解温度的产物对金黄色葡萄球菌生长的影响；
图4为不同酶量酶解的产物对金黄色葡萄球菌生长的影响；
图5为不同pH的酶解产物对金黄色葡萄球菌生长的影响；
图6为不同底物浓度的酶解产物对金黄色葡萄球菌生长的作用；
图7为酶解前后多肽分子量分布；
图8为酶解前后支链氨基酸含量的变化；
图9为酶解前后牛肉浸粉对不同细菌的生长曲线变化；
图10为酶解后的培养基与未酶解的培养基中细菌的生长曲线。
具体实施方式
采用分光光度计法对细菌的OD值进行检测；采用平板菌落计数法进行菌落计数。
实施例1
(1)酶解牛肉浸粉：配制浓度为100～160g/L的牛肉浸粉溶液，氨肽酶添加量200U/g底物，中性蛋白酶添加量2.5×104U/g底物，反应温度50℃，pH7.5，反应时间1h。将反应后的酶解液冻干处理，获得酶解牛肉浸粉冻干粉(冻干粉质量为原牛肉浸粉质量的90～95％)。
(2)冻干程序如下表1所示：
Figure BDA0001342710150000031
将酶解后的液体离心保留上清液，将上清液分装到50mL的离心管中，放入-20℃冰箱中预冻12h后，再将其放入-80℃冰箱预冻12h。将其放入真空冷冻干燥机的托盘中，按照表1中的程序进行冻干。
(3)配制营养肉汤液体培养基：1000mL超纯水，蛋白胨10g，酶解牛肉浸粉冻干粉3g，NaCl5g，在液体培养基中加入1.5％的琼脂粉即为相应的固体培养基。
(4)商业化的金黄色葡萄球菌在LB培养基中进行活化，活化好的金黄色葡萄球菌在LB液体培养基中培养16-18小时，取菌液用灭菌的去离子水稀释104倍，从中取100uL稀释液到上述组成的液体培养基，37℃，220r/min摇床培养，培养24h，分别在各摇瓶中取2mL菌液离心，条件为：12000g，4min。保留菌体，再用去离子水重悬，离心。重复2-3次后，用2mL去离子水重悬，以去离子水为空白对照，用分光光度计在波长为600nm条件下测OD值。OD值达0.8以上。OD值越高，说明此条件下的酶解条件获得的牛肉浸粉对金黄色葡萄球菌的促进作用更明显。
(4)取菌液用灭菌的去离子水稀释107倍，从中取100ul稀释液到上述组成的固体培养基中，37℃，培养36h后对平板进行菌落计数。菌落数达1.31～2.18×109CFU/mL。
实施例2
按实施例1相同的步骤进行操作，区别在于，酶解时间分别为1、2、3、4、5、6h。结果如图2所示，金黄色葡萄球菌的OD600值在酶解的前3h，呈现先减后增。酶解3到5h区间，OD600值先减后增。金黄色葡萄球菌在酶解1h产物上的菌落总数和酶解时间在3至5h的相应产物上的菌落数接近，分别达到1.92×109CFU/mL、1.84×109CFU/mL，1h后的组分对微生物的生长削弱了，产物的促进作用减缓，达到1.59×109CFU/mL。
实施例3
按实施例1相同的步骤进行操作，区别在于，酶解温度分别为40、45、50、55℃。结果如图3所示，当温度为45℃时，两者达到最大值，分别为0.752和1.83×109CFU/mL。该温度下的牛肉浸粉利于微生物金黄色葡萄球菌的生长，其中的成分利于它们的利用。微生物能够很好的利用其中的组分，更短时间里快速生长。达到55℃时，OD600值和菌落数都最低，分别为0.502和1.73×109CFU/mL。
实施例4
按实施例1相同的步骤进行操作，区别在于，加酶量分别为100、150、200、250、300U/mL。结果如图4所示，当加酶量为E/S＝200U/g时，达到最大值，OD和菌落数分别为0.799和2.02×109CFU/mL。当加酶量为150U/g或250U/g时，OD和菌落数分别为0.398～0.414和1.84×109CFU/mL～1.84×109CFU/mL。可见酶量的过多与过少的产物都不适合金黄色葡萄球菌的生长。
实施例5
按实施例1相同的步骤进行操作，区别在于，用5.0mol/L和0.5mol/L的氢氧化钠调节维持酶解pH的稳定分别为7、7.5、8、8.5、9。结果如图4所示，当pH达到8时，OD600值达到0.66。当pH为7.0时，菌落数达到最大值2.18×109CFU/mL。pH为9时，OD600值0.466；pH为7时，OD600值0.412。可见，pH过高使酶呈现不可逆的失活，酶解底物效果差，pH低于其最适反应范围，酶解底物处于劣势，所得产物对微生物的生长作用相对没有优势。
实施例6
按实施例1相同的步骤进行操作，区别在于，牛肉浸粉浓度分别为6、8、10、12、14％。结果如图4所示，随着物料浓度的增加，在摇瓶中培养的金黄色葡萄球菌的OD600值，呈现先减后增的趋势，当物料比达到14％时，OD600值达到最大，为0.362。当物料比为10％时，OD600值最低，0.275，但其在相应的平板上，菌落数达最大值2.11×109CFU/mL，说明在此种产物下，摇瓶培养和平板培养2种形式下，摇瓶培养更有利于金黄色葡萄球菌的生长。
实施例7
准确称取6g牛肉浸粉，配制成底物浓度为12％牛肉浸粉溶液50mL，利用恒温磁力搅拌器维持酶解温度为50℃，按亮氨酸氨肽酶与底物的用量比为200U/g,加入0.837g酶粉(酶活力1434U/g)于牛肉浸粉溶液中，按中性蛋白酶与底物的用量比为2.5×104U/g，加入0.9375g酶粉(酶活力16万U/g)于牛肉浸粉溶液中,滴加0.5mol/L的NaOH调节pH，维持pH7.5，酶解1h，将酶解液12000rpm离心10min，取上清液2mL测酶解液的多肽分子量分布，取上清3mL加入等体积的10％的TCA溶液，静置1h，10000rpm，离心10min，取上清过0.22um的微滤膜，取400uL测酶解液的游离氨基酸含量和多肽分子量。
多肽分子量分布(图7)结果所示：经过酶解后的牛肉浸粉中多肽分子量小于500的占总量的75.48％，比酶解前增加10.7％，说明酶解后的多肽分子量主要以小分子居多。
氨基酸分析(图8)可以看出主要提升的氨基酸种类如图8所示，支链氨基酸缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和亮氨酸(Leu)的含量，分别是酶解前的3.4倍、2.5倍和1.49倍。
实施例8
细菌生长曲线的测定，将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌在LB培养基上活化。实验组是将普通培养基中的牛肉浸粉换成酶解后的冻干产物，其余不变。对照组的牛肉浸粉为酶解所用的原料牛肉浸粉。活化好的细菌分别在LB培养基中培养16～18h，按照0.5％的接菌量吸取到相应的液体培养基中，37℃，220r/min摇床培养24h，其中每隔2h从摇瓶取一次样，测OD600，考察酶解产物促进作用的特异性。结果(图9)表明：金黄色葡萄球菌培养至10h即进入对数期，培养36h即可在平板上形成明显的菌落。此外，该酶解的培养基只对金黄色葡萄球菌有促进增菌的作用，具有特异性。可以用此产物应用于富集含有金黄色葡萄球菌的混合菌群的成分之一。
实施例9
挑取在0℃斜面上保藏的金黄色葡萄球菌到LB液体中培养16～18h，该时间下的菌还没有活化好，目的是为了保持接种等体积的菌液。活化后的菌液用无菌水稀释104倍，取250ul到相应的实验组和对照组培养基，其中实验组是将普通培养基中的牛肉浸粉替换为等量的牛肉浸粉酶解冻干产物(制备方法见实施例1)，其余条件不变，对照组是不经过酶解的牛肉浸粉配制的培养基。按照以下配方：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L，氯化钠5g/L，配制培养基。37℃，220r/min摇床培养培养。分别在培养24h和36h后，取样测OD600值。
结果(表1)表明：实验组中的OD600值远高于原料培养的，并且对照组的菌株几乎还在延迟期，说明酶解后的牛肉浸粉有利于此菌缩短延迟期，快速进入对数期，有利于冷冻后的菌株复原，酶解后的产物利于菌株的吸收利用，进行新陈代谢活动，恢复各种机能，加快增殖。
表2为酶解前后牛肉浸粉对冷冻负伤的金黄色葡萄球菌的复原能力。
Figure BDA0001342710150000061
实施例10
将金黄色葡萄球菌在LB培养基上活化，实验组是将普通培养基中的牛肉浸粉换成酶解后的冻干产物，其余不变。对照组的牛肉浸粉为酶解所用的原料牛肉浸粉。活化好的细菌分别在LB培养基中培养16～18h，将此时的菌液稀释104后，从中取100uL到相应的液体培养基中，37℃，220r/min摇床培养54h，从22h开始，每隔2h从摇瓶取一次样，测OD600，结果(图10)表明，实验组培养金黄色葡萄球菌，从26h后，开始进入了对数期，比对照组提前6h。意味着实验组能够在更短的时间里对金黄色葡萄球菌起富集作用。并且与图9的a图比较发现，图10中OD值的最大差距，实验组是对照组的10倍，而图9的a图中最大差距，实验组是对照组的2倍。。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种快速培养金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，向含有牛肉浸粉的溶液中同时加入氨肽酶和中性蛋白酶进行酶解，以酶解后的溶液作为培养基成分对金黄色葡萄球菌进行培养；所述氨肽酶的添加量为200U/g牛肉浸粉；所述中性蛋白酶的添加量为0.44～1.5×104U/g牛肉浸粉；所述酶解是在40℃～50℃下进行；所述酶解pH为7.5～8.0。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基中还含有NaCl、蛋白胨。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，酶解前的牛肉浸粉、NaCl和蛋白胨的质量比为：8～12:1:3～5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解时间为1～5h。
5.一种用于快速培养金黄色葡萄球菌的培养基，其特征在于，所述培养基含有酶解后的牛肉浸粉；所述酶解是用氨肽酶和中性蛋白酶酶解处理；所述氨肽酶的添加量为200U/g牛肉浸粉；所述中性蛋白酶的添加量为0.44～1.5×104U/g牛肉浸粉；所述酶解是在40℃～50℃下进行；所述酶解pH为7.5～8.0。
6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述酶解时间为1～5h。
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