CN107083337A - 一种食用菌原生质体的制备方法以及原生质体 - Google Patents

一种食用菌原生质体的制备方法以及原生质体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种食用菌原生质体的制备方法以及原生质体，涉及丝状真菌的工程细胞的制备技术领域。本发明提供的食用菌原生质体的制备方法包括：将食用菌菌种接种于含固体培养基的容器中进行菌丝培养，得到长有菌丝的菌落；将菌落进行细胞壁酶解，得到原生质体粗溶液；以及原生质体粗溶液经过滤、离心以及重悬后得到原生质体溶液。本发明提供的制备方法可快速获得大量原生质体。与现有的常规方法相比，本发明提供食用菌原生质体的制备方法速度有很大提高，并且步骤简单，操作更方便。

Description

一种食用菌原生质体的制备方法以及原生质体
技术领域
本发明涉及丝状真菌的工程细胞的制备技术领域，具体而言，涉及一种食用菌原生质体的制备方法以及原生质体。
背景技术
原生质体为脱去细胞壁的细胞，在原生质体制备过程中，人为使细胞壁降解，去除原有细胞壁后，得到仅有细胞膜包裹着的圆球状对渗透压敏感的原生质体。在食用菌等的丝状真菌中在原生质体形成的过程中，由于长丝状的菌丝使细胞断裂后细胞膜包裹细胞的不同部位和大小，使得形成的原生质体呈单(细胞)核，双核或多核以及无核，再生后可得到单核体和双核体菌丝。
因此，食用菌原生质体的制备在育种中可用于双核菌株的单核化、杂交育种及原生质体融合育种等，对无性系菌株进行再生、复壮等，作为转化***的受体等的应用。并且食用菌双核体菌丝特殊的异核体现象使得原生质体制备在食用菌的遗传育种中可发挥最大的作用。目前，对食用菌原生质体制备技术以及理论和应用上都取得了很大的进展。多年以来，已有50多种食用菌中被报道进行了原生质体的制备，并利用制备的原生质体进行食用菌遗传、育种等研究。可以说原生质体制备方法，是推动食用菌科研和产业发展不断进步的重要技术之一，是食用菌遗传育种不可获取的研究手段。
但是，现有的食用菌原生质体的制备方法存在步骤繁多、速度慢、效率低等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种食用菌原生质体的制备方法，该制备方法具有制备速度快、并且步骤简单，操作更方便等特点。
本发明的另一目的在于提供一种由上述制备方法所制备得到的食用菌原生质体。
本发明是这样实现的：
一种食用菌原生质体的制备方法，其包括：
菌丝培养步骤：将上述食用菌菌种接种于含固体培养基的容器中进行菌丝培养，得到长有菌丝的菌落；
酶解步骤：将上述菌落进行细胞壁酶解，得到原生质体粗溶液；
纯化步骤：上述原生质体粗溶液经过滤、离心以及重悬后得到原生质体溶液。
根据上述的食用菌原生质体的制备方法所制备得到的食用菌原生质体。
本发明具有以下有益效果：
相对于现有的食用菌原生质体的制备方法，本发明提供的食用菌原生质体的制备方法简化了食用菌原生质体制备的现有方法的制备步骤，主要对食用菌菌种的菌丝体的培养方法做了创新性变化即将食用菌菌种直接接种于含固体培养基的容器中进行菌丝培养，这一变化步骤使得后续的酶解步骤中减少了溶壁酶溶液的使用量，简化酶解的培养条件和缩短酶解时间，这大大地提高了食用菌原生质体的制备速度；另外还可使得到的原生质体粗溶液的纯化环节减少过滤步骤，降低离心时的溶液总量，使得原生质体制备过程更加快捷；
此外，本发明提供的食用菌原生质体的制备方法可提高科研人员的效率，加快育种速度，推动食用菌产业不断发展。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1提供的香菇菌株“申香215”酶解前菌落形态图；
图2为本发明实施例1提供的香菇菌丝酶解后显微观察结果图；
图3为本发明实施例2提供的金针菇菌株“G1”在酶解状态下的结果图；
图4为本发明实施例2提供的金针菇菌株原生质体浓度血球计数板计数结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
现有的原生质体制备方法通常采用液体静置培养的方法获得大量幼嫩的菌丝体，随后过滤去除培养液收集菌丝体，置于酶溶液中进行细胞壁酶解，然后对酶解后获得的原生质体进行过滤纯化，收集到的原生质体经过离心沉淀后重悬浮，得到原生质体溶液。
该方法在获得幼嫩菌丝体(即菌丝的端部)时需要进行液体静置培养，接种液体培养的菌丝体需要经过匀浆器进行匀浆，断裂菌丝，以获得足够多的生长点，再重新培养，而这一培养时间根据不同的食用菌品种又需要3-5天不等。因此，现有的的原生质体制备方法在制备过程中要获取足够数量的幼嫩菌丝体所耗时间长且速度慢。
酶解过程中因为收集的菌丝体较多，需要配置大量的酶液，并使用摇床进行轻微震荡酶解；酶解后的酶液中因为有大量的菌丝片段残留，一般需要通过2-3级过滤，先用300和600目的滤网，再使用砂芯漏斗过滤；最后得到的过滤液体积往往超过50mL，需要使用大容量的离心管和离心机转子。总而言之，目前原生质体制备的常用方法步骤繁多，需要使用多种实验仪器，准备大量的实验器材，并且耗时较长，使实验人员对原生质体制备产生抗拒感。因此，开发一种快速、便捷的食用菌原生质体制备方法可提高科研人员的效率，加快育种者的脚步，推动食用菌产业不断发展。
基于此，特提出本发明。
下面对本发明实施例的一种食用菌原生质体的制备方法以及原生质体进行具体说明。
一方面，本发明提供的食用菌原生质体的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
S1菌丝培养步骤
将食用菌菌种接种于含固体培养基的容器(例如培养皿)中进行菌丝培养，得到长有菌丝的菌落。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，采用7点接种法(如图1所示)将食用菌菌种接种于固体培养基上进行菌丝培养。
本发明采用固体培养基进行菌丝培养，以获取长有菌丝的菌落，同时避免可减少菌丝片段的生成量，使得后续的酶解步骤中减少了溶壁酶溶液的使用量，简化酶解的培养条件和缩短酶解时间，这大大地提高了食用菌原生质体的制备速度。
同时，通过7点接种法进行接种，每个菌落周围可长出足够数量的菌丝体，确保了可获取到足够数量的幼嫩菌丝体。避免采用断裂菌丝又重新培养的步骤，节约了步骤和时间。待7个接种点的菌落扩展至将要衔接时(如图1所示)，可进行后续试验。
进一步地，本发明的一些实施方案中，固体培养基表面覆有玻璃纸，食用菌菌种接种于玻璃纸上进行菌丝培养。
培养好的菌落需要进行细胞壁酶解，为了便于转移菌落并确保菌落在培养基上能够正常生长，在本发明的一些实施方案中，在固体培养基表面覆有玻璃纸，食用菌菌种接种于玻璃纸上进行菌丝培养。当培养结束后，可直接用镊子揭起带有菌落的玻璃纸，放入另一个空的容器中，进而将所有菌落转移，操作简单方便。
采用玻璃纸作为转移载体转移菌落时，在容器中可预先加入的甘露醇溶液以防止玻璃纸贴入时玻璃纸与容器底壁之间产生气泡。甘露醇溶液优选地为0.5mL 6％的甘露醇溶液。
进一步地，本发明的一些实施方案中，菌丝培养的温度为24-26℃。优选为25℃。不同类别的食用菌及丝状真菌品种根据生长速度不同而培养时间各异。
S2酶解步骤
将菌落进行细胞壁酶解，得到原生质体粗溶液。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，若采用7点接种法将食用菌菌种接种于固体培养基上进行菌丝培养，待菌落扩展至将要衔接时(如图1所示)，将菌落转移至新的容器中，加入溶壁酶溶液浸没菌落进行细胞壁酶解。
通过上述酶解步骤后，酶解后的酶液中不含有的菌丝片段残留，也就不需要通过2-3级过滤等步骤，大大地提高了制备速度和节约了时间。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在加入溶壁酶溶液之前，在将菌落转移至新的容器之后，还包括：用甘露醇溶液润洗菌落的菌丝。
用甘露醇溶液润洗菌落的菌丝可使菌丝周围及玻璃纸上形成等渗溶液环境，有助于维持原生质体的结构稳定。随后倒去容器内多余的甘露醇溶液即可。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，溶壁酶溶液的浓度为0.18-0.22％(m/v)。
需要说明的是，根据不同溶壁酶生产单位的酶活不同，溶壁酶液配置浓度也不同，在实际酶解时通过预实验进行确定即可。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，为了避免最大程度地获取原生质体，可先将容器倾斜，用移液器将酶解处理后的酶液转移至离心管中。再用移液器吸取0.6mol/L的甘露醇溶液冲洗菌落3-4次，将冲洗后的甘露醇溶液也移入同一离心管中，得到原生质体粗溶液。
S3纯化步骤
上述原生质体粗溶液经过滤、离心以及重悬后得到原生质体溶液。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，原生质体粗溶液用砂芯漏斗过滤，滤液经2800-3200rpm离心18-22min后，取沉淀，用0.5-0.7mol/L的甘露醇重悬沉淀。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，砂芯漏斗在过滤前用少量0.6mol/L的甘露醇溶液预先润洗，使其在过滤的过程中具有等渗溶液环境，有助于维持原生质体的结构稳定。滤液转入离心管中即可。
S4检测步骤(可选步骤)
吸取重悬浮的原生质体溶液，用血球计数板观察并计数；
将原生质体溶液稀释至一定浓度例如1×105个/mL，取一定体积例如50uL涂布原生质体再生平板，待菌落长出后可计数统计，原生质体再生比例。
另一方面，本发明提供了根据上述制备方法所制备得到的原生质体。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例以香菇为例，对本发明提供的食用菌原生质体的制备方法进行说明，具体如下。
本实施例提供的食用菌原生质体的制备方法，其包括如下步骤：
(1)采用7点接种法将香菇菌株“申香215”(购自上海市农业科学院食用菌研究所)的菌种接种于覆盖有玻璃纸的PDA平板上，25℃下避光培养；
(2)香菇菌株培养约4天，待7个接种点的菌落扩展至将要衔接时各菌落的菌丝将要接触时，菌落大小如图1所示，可进行原生质体的制备；
(3)将带有菌落的玻璃纸从PDA平板上揭起后置于另一空的灭菌培养皿中，用少量0.6mol/L的甘露醇溶液润洗菌落后，倒去多余的甘露醇溶液；
(3)使用0.6mol/L的甘露醇配置0.2％(w/v)的溶壁酶(lywallzyme、购于广东微生物研究所)溶液，并用细菌过滤器过滤除菌；
(4)在放有香菇的培养皿中加入2mL酶溶液进行酶解；
(5)香菇的最佳酶解时间为30min，置于37℃培养箱中静置酶解30min，酶解后用显微镜观察菌落酶解效果；
结果如图2所示：有大量原生质球产生，或在菌丝尖端泌出，或整条菌丝被降解形成一串原生质球。
(6)用移液器吸取酶溶液到10mL离心管中，再用0.6mol/L的甘露醇溶液1mL冲洗菌落和玻璃纸表面4次，并将冲洗的甘露醇溶液都转移到离心管中；
(7)将离心管在3000rpm下离心20min，倒去上清液，留下原生质体形成的沉淀；
(8)用200μL 0.6mol/L的甘露醇重新悬浮沉淀；
(9)用血球计数板计算原生质体浓度，原生质体浓度约为2×106个/mL；
(10)将原生质体溶液稀释至1×105个/mL后，每个再生平板加入50uL稀释液进行涂布，25℃下培养，观察原生质体再生后的数量。
再生率计算方法：涂板后再生的菌落数/涂板前估计的原生质体数。
采用本实施例提供的食用菌原生质体的制备方法所制备的香菇原生质体的再生率为：2.15％
实施例2
本实施例以金针菇为例，对本发明提供的食用菌原生质体的制备方法进行说明，具体如下。
(1)采用7点接种法将金针菇生产菌株“G1”(购自上海市农业科学院食用菌研究所)的菌种接种于覆盖有玻璃纸的PDA平板上，26℃下避光培养；
(2)金针菇菌株培养约3天，待7个接种点的菌落扩展至将要衔接时各菌落的菌丝将要接触时，进行原生质体的制备；
(3)将带有菌落的玻璃纸从PDA平板上揭起后置于另一空的灭菌培养皿中，用少量0.6mol/L的甘露醇溶液润洗菌落后，倒去多余的甘露醇溶液；
(3)使用0.6mol/L的甘露醇配置0.18％(w/v)的溶壁酶(lywallzyme、购于广东微生物研究所)溶液，并用细菌过滤器过滤除菌；在其他的实施例中，溶壁酶的浓度也可以是0.22％(w/v)。
(4)在放有金针菇的培养皿中加入2mL酶溶液进行酶解，使酶溶液浸没菌落即可，如图3所示；
(5)金针菇的最佳酶解时间为30min，置于37℃培养箱中静置酶解30min，酶解后用显微镜观察菌落酶解效果；
(6)用移液器吸取酶溶液到10mL离心管中，再用0.6mol/L的甘露醇溶液1mL冲洗菌落和玻璃纸表面4次，并将冲洗的甘露醇溶液都转移到离心管中；
(7)将离心管在3000rpm下离心20min，倒去上清液，留下原生质体形成的沉淀；
(8)用200μL 0.6mol/L的甘露醇重新悬浮沉淀；
(9)用血球计数板计算原生质体浓度，如图4所示，原生质体浓度约为2×106个/mL；
(10)将原生质体溶液稀释至1×105个/mL后，每个再生平板加入50uL稀释液进行涂布，25℃下培养，观察原生质体再生后的数量。
再生率为：2.36％
实施例3
本实施例提供了由上述实施例1或实施例2提供的食用菌原生质体的制备方法所制备得到的原生质体。
本实施例提供的原生质体可应用于杂交育种及原生质体融合育种中，有助于加快育种速度，推动食用菌产业不断发展。
综上，相对于现有的食用菌原生质体的制备方法，本发明提供的食用菌原生质体的制备方法简化了食用菌原生质体制备的现有方法的制备步骤，主要对食用菌菌种的菌丝体的培养方法做了创新性变化即将食用菌菌种直接接种于含固体培养基的容器中进行菌丝培养，这一变化步骤使得后续的酶解步骤中减少了溶壁酶溶液的使用量，简化酶解的培养条件和缩短酶解时间，这大大地提高了食用菌原生质体的制备速度；另外还可使得到的原生质体粗溶液的纯化环节减少过滤步骤，降低离心时的溶液总量，使得原生质体制备过程更加快捷；
此外，本发明提供的食用菌原生质体的制备方法可提高科研人员的效率，加快育种速度，推动食用菌产业不断发展。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种食用菌原生质体的制备方法，其特征在于，其包括：
菌丝培养步骤：将所述食用菌菌种接种于含固体培养基的容器中进行菌丝培养，得到长有菌丝的菌落；
酶解步骤：将所述菌落进行细胞壁酶解，得到原生质体粗溶液；
纯化步骤：所述原生质体粗溶液经过滤、离心以及重悬后得到原生质体溶液。
2.根据权利要求1所述的食用菌原生质体的制备方法，其特征在于，在所述菌丝培养步骤中，采用7点接种法将所述食用菌菌种接种于所述固体培养基上进行所述菌丝培养。
3.根据权利要求2所述的食用菌原生质体的制备方法，其特征在于，在所述酶解步骤中，待所述菌落扩展至将要衔接时，将所述菌落转移至新的容器中，加入溶壁酶溶液浸没所述菌落进行所述细胞壁酶解。
4.根据权利要求3所述的食用菌原生质体的制备方法，其特征在于，在所述菌丝培养步骤中，所述固体培养基表面覆有玻璃纸，所述食用菌菌种接种于所述玻璃纸上进行所述菌丝培养。
5.根据权利要求3所述的食用菌原生质体的制备方法，其特征在于，在所述酶解步骤中，在加入所述溶壁酶溶液之前，在将所述菌落转移至新的容器之后，还包括：用甘露醇溶液润洗所述菌落的菌丝。
6.根据权利要求3-4中任一项所述的食用菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述溶壁酶溶液的浓度为0.18-0.22％(m/v)。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的食用菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述食用菌菌种选自香菇和金针菇中的任意一种。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的食用菌原生质体的制备方法，其特征在于，在所述纯化步骤中，所述原生质体粗溶液用砂芯漏斗过滤，滤液经2800-3200rpm离心18-22min后，取沉淀，用0.5-0.7mol/L的甘露醇重悬所述沉淀。
9.根据权利要求1-5中任一项所述的食用菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述菌丝培养的温度为24-26℃。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的食用菌原生质体的制备方法所制备得到的食用菌原生质体。
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