CN107058132A - 小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备方法 - Google Patents

小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备方法 Download PDF

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CN107058132A CN201710328722.3A CN201710328722A CN107058132A CN 107058132 A CN107058132 A CN 107058132A CN 201710328722 A CN201710328722 A CN 201710328722A CN 107058132 A CN107058132 A CN 107058132A
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高利
沈慧敏
陈万权
刘太国
刘博�
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Abstract

本发明涉及一种小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备方法，包括如下步骤：(1)菌丝培养：在土壤浸提液培养基上培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子，待冬孢子萌发后转接到T19液体培养基中振荡培养，在土壤浸提液培养基上培养的天数与在T19液体培养基中振荡培养的天数总共为40～50天，收集菌丝体；(2)细胞壁裂解：以KCl溶液作为渗透压稳定剂，配制混合酶液，加入到菌丝体中，28℃振荡酶解2～3小时，即得到小麦矮腥黑粉菌原生质体；所述混合酶液包括质量百分比浓度为1.5％的崩溃酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蜗牛酶。采用该方法制备小麦矮腥黑粉菌原生质体，产量高达12.0×105个/mL，且释放的原生质体均匀散乱分布，不聚集成堆。

Description

小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备方法
技术领域
本发明涉及细胞工程中真菌原生质体制备与再生技术领域，具体涉及一种小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备方法。
背景技术
小麦矮腥黑穗病(wheat dwarf bunt disease，DB)是一种由小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kühn,TCK)引起的检疫性病害，具有危害严重、防治困难等特点，对小麦的生产具有毁灭性破坏。感病植株通常具有矮化多分蘖的症状，穗上的籽粒变成黑粉，是病原菌的冬孢子，冬孢子有鱼腥味，引起小麦产量和品质降低。国内外对于小麦矮腥黑穗病的研究主要集中在病原菌的鉴定、生物学特性以及分子检测技术等，对该病原菌的致病机制研究较少。遗传转化技术是实现大规模定点突变的重要方法，利用该技术能够改变真菌的遗传物质，研究植物病原菌的的致病机理。目前，真菌遗传转化的方法有很多，常见的有聚乙二醇介导的原生质体转化、限制性内切酶介导的整合以及农杆菌转化等。
当前，利用原生质体进行分子转化技术已成为丝状真菌转化、相关分子克隆技术和致病机制研究的重要组成部分，原生质体分子转化技术依赖于制备高效可再生的原生质体，但由于不同种类丝状真菌细胞结构，尤其是细胞壁的结构和组成存在着明显差异，因此制备原生质体的最佳条件和体系也存在着很大差异。国内外尚未见小麦矮腥黑粉菌的原生质体制备体系相关报道，这不利于对该病原菌进行深入的致病分子机制研究。原生质体的高效再生是后期深入研究其致病分子机制的必需条件，不同的酶解时间及稳渗剂对原生质体再生具有重要影响。为了筛选小麦矮腥黑粉菌致病力变异菌株，加强对其致病机制的了解，更好地为农业生产上开展抗病分子育种提供基础，需要对其原生质体制备及再生的方法进行研究。
发明内容
针对上述领域存在的不足和需求，本发明的目的在于提供一种小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备方法。
本发明通过如下技术方案实现：
小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)菌丝培养：在土壤浸提液培养基上培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子，待冬孢子萌发后转接到T19液体培养基中振荡培养，在土壤浸提液培养基上培养的天数与在T19液体培养基中振荡培养的天数总共为40～50天，收集菌丝体；
(2)细胞壁裂解：以KCl溶液作为渗透压稳定剂，配制混合酶液，加入到菌丝体中，28℃振荡酶解2～3小时，即得到小麦矮腥黑粉菌原生质体；
所述混合酶液包括质量百分比浓度为1.5％的崩溃酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蜗牛酶。
优选地，所述在土壤浸提液培养基上培养的天数与在T19液体培养基中振荡培养的天数总共为45天。
优选地，所述在土壤浸提液培养基上培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子的天数为30～35天，所述转接到T19液体培养基中振荡培养的天数为10～15天。
优选地，所述28℃振荡酶解的时间为2.5小时。
优选地，所述在土壤浸提液培养基上培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子的培养条件为温度为5℃和相对湿度为50％；所述转接到T19液体培养基中振荡培养的培养条件为温度为5℃和转速为150rpm。
优选地，所述KCl溶液的浓度为1.2mol/L。
优选地，所述混合酶液与所述菌丝体的配比为20ml：1g。
优选地，所述振荡酶解在180r/min的转速下进行。
优选地，所述土壤浸提液培养基的制备方法为：称取75g灭菌土壤，溶于500ml沸水后，过滤，取滤液，加入20g琼脂粉，然后加水定容至1L，121℃高压蒸汽灭菌。
优选地，所述T19液体培养基的配方为：KH2PO4 613mg/L，MgSO4·7H2O 246mg/L，K2HPO4·3H2O 114mg/L，CaCl2 55.5mg/L，螯合Fe 20mg/L，ZnSO4·7H2O 3.52mg/L，CuSO4·5H2O 0.38mg/L，MnSO4·H2O 0.31mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.025mg/L，氯化硫胺素5mg/L，L-天冬酰胺3mg/L，蔗糖20mg/L。
原生质体是许多真菌进行遗传转化的受体细胞，优化原生质体的制备方法，能更好的建立小麦矮腥黑粉菌的遗传转化体系。本发明以小麦矮腥黑粉菌菌株为供试材料，研究了菌株培养时间、细胞壁裂解酶、酶解时间和渗透压稳定剂等对原生质体制备的影响，获得了小麦矮腥黑粉菌原生质体制备的最佳条件。
菌龄：制备真菌的原生质体一般都采用新鲜的菌丝或孢子，细胞壁的结构和成分在不同的生长时期会有所不同。小麦矮腥黑粉菌冬孢子萌发后先产生先菌丝和初生担孢子，之后初生担孢子H结合产生侵染菌丝，侵染菌丝既对小麦有侵染性，又容易被酶解。培养时间过短，产生的先菌丝和担孢子相对比较幼嫩，在原生质体释放后容易受到酶的作用而破裂，降低原生质体得率；培养时间过长，菌丝细胞壁老化、成分改变，酶***对其作用不显著，原生质体得率较低。因此，小麦矮腥黑粉菌冬孢子的培养时间直接影响原生质体数量。并且，小麦矮腥黑粉菌菌丝非常难以培养，本发明采用两种不同的培养基，首先将小麦矮腥黑粉菌的冬孢子在土壤浸提液培养基中培养至萌发(约30-35天)，然后用灭菌蒸馏水将萌发的冬孢子冲洗下来，转接入T19液体培养基中振荡培养10-15天，花费较长培养时间才能稳定地培养出其菌丝体，作为原生质体制备的初始材料。本发明实验结果表明，最适宜制备原生质体的小麦矮腥黑粉菌的菌龄为45天。
裂解酶及酶解时间：真菌细胞壁成分复杂多样，在原生质体制备中，选择合适的酶溶解细胞壁，对原生质体产出率有非常重要的影响。其次，酶解时间对原生质体的制备和再生至关重要，时间过短，细胞壁破解不完全，许多原生质体不能从菌丝上分离下来，使原生质体产率降低；时间过长，酶对得到的原生质膜伤害作用过大，容易造成原生质体的破裂，也会降低原生质体的产率。担子菌菌丝的细胞壁主要成分是几丁质和葡聚糖。本发明采用崩溃酶、溶壁酶和蜗牛酶对小麦矮腥黑粉菌细胞壁进行溶解实验，其中崩溃酶是含有木聚糖酶、昆布多糖酶、及纤维素酶等的复合酶；溶壁酶具有几丁质酶、纤维素酶及蛋白酶等活性；蜗牛酶中含有纤维素酶、果胶酶、葡糖酸酶、几丁质酶和脂酶等多种酶。本发明实验结果表明，一种酶或者两种酶都不能很好地溶解小麦矮腥黑粉菌细胞壁，而采用质量浓度为1.5％的崩溃酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蜗牛酶的复合酶液，在28℃振荡条件下对菌体细胞壁酶解2.5h后，获得的原生质体产率最高。
渗透压稳定剂：渗透压稳定剂可以保护细胞膜使其不受裂解酶过度破坏，对原生质体起到保护作用，能影响原生质体的制备和再生。渗透压稳定剂通常包括有机和无机两种，针对不同的菌，作用效果不同。本发明研究发现，以1.2mol/L的KCl为渗透压稳定剂，所得的小麦矮腥黑粉菌原生质体数量最多，且释放的原生质体能够均匀散乱分布，不聚集成堆。
综上，采用本发明的方法制备小麦矮腥黑粉菌原生质体，产量高达12.0×105个/mL，且释放的原生质体能够均匀散乱分布，不聚集成堆。得到的原生质体可以在TB3培养基上长出较多单菌落，可用于小麦矮腥黑粉菌的再生培养。
附图说明
图1为小麦矮腥黑粉菌原生质体的释放过程，
其中，A：菌丝体在裂解酶的作用下开始向内凹陷，呈节状断裂；B：原生质体从菌丝体细胞壁比较薄弱的位置释放，多数TCK的原生质体从顶端开始释放；C：小麦矮腥黑粉菌在酶解2.5h后，大部分原生质体从菌丝体上释放出来，呈圆形透明的小球。
图2为菌丝体的培养时间对原生质体形成的影响，
其中，横坐标为菌丝体的培养天数，纵坐标为原生质体数量(×105个/mL)。
图3为不同酶解时间对原生质体产量的影响，
其中，横坐标为酶解时间(小时)，纵坐标为原生质体数量(×105个/mL)。
图4为不同渗透压稳定剂对小麦矮腥黑粉菌原生质体产量的影响，
其中，横坐标为不同的渗透压稳定剂，纵坐标为原生质体数量(×105个/mL)。
图5为小麦矮腥黑粉菌的原生质体在四种渗透压稳定剂中的状态，
其中，A：以山梨醇作为渗透压稳定剂，释放的原生质体发生聚集现象，箭头所示为聚集的原生质体；B：以蔗糖作为渗透压稳定剂，原生质体聚集现象更严重，箭头所示为聚集成堆的原生质体；C：以硫酸镁为渗透压稳定剂，原生质体呈分散状态，箭头所示为分散的原生质体；D：以氯化钾为渗透压稳定剂，原生质体呈分散状态，箭头所示为分散的原生质体。
图6为小麦矮腥黑粉菌原生质体的再生，
其中，左侧为TB3培养基，右侧为PDA培养基。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步描述本发明，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。
生物材料
小麦矮腥黑粉菌：本发明所使用的小麦矮腥黑粉菌菌株为现有文献L.GAO etal.Development of a SCAR Maker by inter-simple sequence repeat for dignoisisof Dwarf Bunt of Wheat and Detection of Tilletia controversa Ku hn.FoliaMicrobiol.55(3),258–264(2010)所记载，参见其中材料与方法部分记载的在美国由B.Goates教授分离到的分离株。
上述生物材料，本实验室亦有保存，申请人声明可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
主要试剂
溶壁酶(Lysing enzyme)，购于Sigma公司，货号：SIGML1412；
崩溃酶(Driselase)，购于Sigma公司，货号：D9515；
蜗牛酶(Snailase)，购于上海生化所，货号：D2412；
PDA粉末，购于北京奥博星生物技术有限责任公司，货号：02-023；
硫酸镁，购于北京化工厂公司，货号：34156-69-9；
氯化钾，购于国药集团化学试剂有限公司，货号：7447-40-7；
山梨醇，购于Amresco公司，货号：0691-500G；
蔗糖，购于国药集团化学试剂有限公司，货号：57-50-1；
培养基
2％土壤浸提液培养基：称取75g灭菌土壤，溶于500ml沸水，过滤，取滤液，加入20g琼脂粉，最后加水定容至1L，121℃高压蒸汽灭菌。
T19培养基：按照表1所示的配方称取各组分，溶解于蒸馏水中，定容至1L后，121℃高压蒸汽灭菌。固体培养基另加入20g琼脂粉。
表1 T19培养基的成分和质量
马铃薯葡萄糖固体培养基(PDA)：称取PDA粉末37g，加水定容到1L，121℃高压蒸汽灭菌。
TB3培养基：酵母提取物3g，酸水解酪蛋白3g，蔗糖200g，酵母粉10g，加水定容到1L，121℃高压蒸汽灭菌。
下述实施例中未特别说明的生物化学试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制而得或商购获得，规格为实验室纯级。
实施例1：小麦矮腥黑粉菌原生质体制备方法的优化
将小麦矮腥黑粉菌的冬孢子在土壤浸提液培养基中培养，温度为5℃，相对湿度为50％，选取不同培养天数的菌体，用灭菌蒸馏水冲洗下来后，转接入T19液体培养基中，在全温振荡器中5℃，150rpm振荡培养，收集菌丝培养液，过滤后，5000r/min离心10min收集菌丝。取1g菌丝，加入20ml不同组合的酶液，28℃，180r/min振荡酶解，每隔30min，用显微镜观察原生质体获得情况，设置不同的实验参数，筛选出最适宜原生质体制备的菌龄、酶解时间、酶***、渗透压稳定剂。
1、菌体培养时间
在土壤浸提液培养基上培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子，温度为5℃，相对湿度为50％，待冬孢子萌发后转接到T19液体培养基中，在全温振荡器中5℃，150rpm振荡培养。总培养时间分别设置为40天、45天、50天、55天、60天，取不同培养天数的菌丝培养液，过滤后，5000r/min离心10min收集菌丝。取1g菌丝，加入20ml用1.2M氯化钾溶液配制的质量浓度为1.5％崩溃酶，1.5％溶壁酶和1.5％蜗牛酶的复合酶液，28℃，180r/min振荡酶解2.5h，观察并记录原生质体获得量，选出最适宜制备原生质体的菌龄。
试验结果如图2所示，在相同处理条件下，随着培养天数的增加，原生质体的数量呈先增后减的状态，在菌龄为45d时原生质体数量达到最高峰，为12.0×105个/mL。之后原生质体数量随着培养时间的增加而减少。
2、细胞壁裂解酶
用1.2M氯化钾溶液分别配制质量浓度为1.5％的崩溃酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蜗牛酶，研究单一酶和不同组合的酶液对小麦矮腥黑粉菌原生质体产量的影响。
在土壤浸提液培养基上培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子，温度为5℃，相对湿度为50％，待冬孢子萌发后转接到T19液体培养基中，在全温振荡器中5℃，150rpm振荡培养。选取培养40天的菌丝培养液，过滤后，5000r/min离心10min收集菌丝。取1g菌丝，分别加入20ml不同组合的酶液，28℃，180r/min振荡酶解2.5h，观察并记录原生质体获得量。
结果如表2所示，原生质体的产量受细胞壁裂解酶的种类和浓度的影响较大，且混合酶的作用效率高于单一酶。在单个酶作用时，1.5％的崩溃酶得到的小麦矮腥黑粉菌的原生质体数量最多，为3.0×105个/mL；1.5％的溶壁酶得到的原生质体数量最少，为2.4×105个/mL；两种酶组合时，原生质体的数量比单种酶有所提高；三种酶混合时，得到的原生质体最多。因此，在小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备中，采用质量浓度为1.5％的崩溃酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蜗牛酶的复合酶液对细胞壁进行溶解，原生质体得率最高。
表2不同裂解酶组合对小麦矮腥黑粉菌原生质体数量的影响
注：不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。
3、酶解时间
在土壤浸提液培养基上培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子，温度为5℃，相对湿度为50％，待冬孢子萌发后转接到T19液体培养基中，在全温振荡器中5℃，150rpm振荡培养。选取培养40天的菌丝培养液，过滤后，5000r/min离心10min收集菌丝。取1g菌丝，加入20ml用1.2M氯化钾溶液配制的1.5％崩溃酶+1.5％溶壁酶+1.5％蜗牛酶复合酶液，置于28℃，180r/min摇床中振荡酶解，设置酶解时间分别为1h、1.5h、2h、2.5、3h，每隔半小时显微镜检观察是否获得原生质体以及原生质体的数量。
结果如图3所示，在酶解1h时原生质体数量较少，很多菌丝的细胞壁虽然被不同程度的破坏，但大多数还没有破解完全，原生质体还没有从菌丝上分离下来，随着酶解时间的增加，原生质体的数量也增加，2.5h时达到最大值，为9.5×105个/mL，之后继续酶解会导致原生质体数量减少。
4、渗透压稳定剂
采用1.2mol/L的MgSO4、KCl、D-山梨醇、蔗糖作为渗透压稳定剂，设置4个实验组，观察不同渗透压稳定剂对小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备的影响。
在土壤浸提液培养基上培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子，温度为5℃，相对湿度为50％，待冬孢子萌发后转接到T19液体培养基中，在全温振荡器中5℃，150rpm振荡培养。选取培养40天的菌丝培养液，过滤后，5000r/min离心10min收集菌丝。取1g菌丝，加入20ml用不同渗透压稳定剂配制的复合酶液(1.5％崩溃酶+1.5％溶壁酶+1.5％蜗牛酶)，置于28℃，180r/min摇床中振荡酶解2.5h，记录原生质体的数量。
结果如图4和图5所示，不同类型的渗透压稳定剂对产生原生质体的影响不同，在所选的四种渗透压稳定剂中，相同条件的处理下，无机溶剂比有机溶剂原生质体得率更高，且以山梨醇和蔗糖作为渗透压稳定剂所得到的原生质体易聚集。采用氯化钾作为渗透压稳定剂，得到原生质体最多，为10.8×105个/mL，且原生质体不会聚集成堆。
实施例2：采用优化后的方法制备小麦矮腥黑粉菌原生质体
用1.2mol/L的氯化钾配制质量浓度为1.5％的崩溃酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蜗牛酶的混合酶液。然后按照如下步骤制备原生质体：
(1)菌丝培养：在土壤浸提液固体培养基上于5℃、相对湿度为50％的条件下培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子35天，然后将萌发的冬孢子用灭菌蒸馏水冲洗下来后，转接入T19液体培养基中，在全温振荡器中5℃，150rpm振荡培养10天，收集菌丝培养液。
(2)酶解菌丝细胞壁：将收集的菌丝培养液过滤除去液体培养基，5000r/min离心10min收集菌丝，取1g菌丝，加入20mL混合酶液，28℃，180r/min，振荡酶解2.5h，将酶解液过滤，5000r/min离心10min，即得小麦矮腥黑粉菌原生质体。
结果表明，采用本发明优化的方法制备小麦矮腥黑粉菌原生质体，原生质体得率可达到12.0×105个/mL。
小麦矮腥黑粉菌原生质体的释放过程如图1所示，在酶解初始阶段，菌丝在裂解酶的作用下开始向内凹陷，呈节状断裂(如图1中A)。原生质体通常从细胞壁比较薄弱的位置释放，薄弱的细胞壁比较容易被酶解变形，显微镜下观察可知，多数TCK的原生质体从顶端开始释放(如图1中B)。随着酶解进行，细胞壁逐渐被酶解完全，原生质体由于没有细胞壁的束缚，通常在释放后呈圆形透明的小球。小麦矮腥黑粉菌在酶解2.5h后，大部分原生质体从菌丝上释放出来(如图1中C)。
实施例3：小麦矮腥黑粉菌原生质体的再生
将实施例1和2制备得到的原生质体分别用1.2mol/L的氯化钾重新悬浮后，分别涂布在PDA和TB3固体培养基中，5℃培养2-3周，观察长出的单菌落。
结果如图6所示，小麦矮腥黑粉菌的原生质体在TB3培养基上长出较多单菌落，而PDA培养基上无单菌落长出，因此，TB3培养基比PDA培养基更适合原生质体再生，可用于小麦矮腥黑粉菌原生质体的再生培养。

Claims (10)

1.小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)菌丝培养：在土壤浸提液培养基上培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子，待冬孢子萌发后转接到T19液体培养基中振荡培养，在土壤浸提液培养基上培养的天数与在T19液体培养基中振荡培养的天数总共为40～50天，收集菌丝体；
(2)细胞壁裂解：以KCl溶液作为渗透压稳定剂，配制混合酶液，加入到菌丝体中，28℃振荡酶解2～3小时，即得到小麦矮腥黑粉菌原生质体；
所述混合酶液包括质量百分比浓度为1.5％的崩溃酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蜗牛酶。
2.根据权利要求1所述的小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述在土壤浸提液培养基上培养的天数与在T19液体培养基中振荡培养的天数总共为45天。
3.根据权利要求2所述的小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述在土壤浸提液培养基上培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子的天数为30～35天，所述转接到T19液体培养基中振荡培养的天数为10～15天。
4.根据权利要求1所述的小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述28℃振荡酶解的时间为2.5小时。
5.根据权利要求1所述的小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述在土壤浸提液培养基上培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子的培养条件为温度为5℃和相对湿度为50％；所述转接到T19液体培养基中振荡培养的培养条件为温度为5℃和转速为150rpm。
6.根据权利要求1所述的小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述KCl溶液的浓度为1.2mol/L。
7.根据权利要求1所述的小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述混合酶液与所述菌丝体的配比为20ml：1g。
8.根据权利要求1所述的小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述振荡酶解在180r/min的转速下进行。
9.根据权利要求1所述的小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述土壤浸提液培养基的制备方法为：称取75g灭菌土壤，溶于500ml沸水后，过滤，取滤液，加入20g琼脂粉，然后加水定容至1L，121℃高压蒸汽灭菌。
10.根据权利要求1所述的小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述T19液体培养基的配方为：KH2PO4 613mg/L，MgSO4·7H2O 246mg/L，K2HPO4·3H2O 114mg/L，CaCl255.5mg/L，螯合Fe 20mg/L，ZnSO4·7H2O 3.52mg/L，CuSO4·5H2O 0.38mg/L，MnSO4·H2O0.31mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.025mg/L，氯化硫胺素5mg/L，L-天冬酰胺3mg/L，蔗糖20mg/L。
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