CN102766632B - 一种高尔基体膜蛋白gp73核酸适配子、其制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子，所述适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子，能够很好的同高尔基体膜蛋白GP73结合，具有较高的特异性和灵敏度，而且保存时间长，成本较低。本发明还公开了所述适配子的制备方法及其在制备诊断或治疗肝细胞癌药物中的用途。

Description

一种高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子、其制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及一种适配子、其制备方法及其用途，尤其是一种高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子、其制备方法及其在制备诊断或治疗肝细胞癌药物中的用途。

背景技术

随着基因工程技术的发展，人们可以方便地根据基因序列进行各种蛋白的人工表达，大大推动了基于抗原抗体反应的免疫检测技术的快速发展。尽管如此，由于抗体本身的不稳定性，如制备周期长、杂交瘤细胞在长期冻存和传代过程中易发生染色体突变，以及对外界环境敏感，受pH、温度影响易失活，保存期短等特性的影响，一定程度上制约了免疫检测技术的特异性和灵敏度。

肝细胞癌（HCC）是世界五大常见癌症之一，其增长速度非常之快。肝硬化是HCC发病过程中的一个重要发展过程，因此，肝硬化患者组成了HCC的高危人群。近年来研究发现，一种高尔基体膜蛋白GP73以良好的敏感性被视为最具有潜力的HCC标记物。GP73作为潜在的HCC标记物，首先要考虑的是建立一种经济、简便的抗干扰能力强的方法来检测GP73，这样才能真正将GP73的价值推广运用于临床。

目前，检测人GP73的酶联免疫吸附实验（ELLSA）试剂盒已经出现，但由于受到抗体来源和自身不稳定性质的影响，如抗体本身的不稳定性（制备周期长，杂交瘤细胞在长期冻存和传代过程中易发生染色体突变），及对外界环境敏感，受pH、温度影响易失活，保存期短等特性的影响，一定程度上制约了免疫检测技术的特异性和灵敏度，同时动物实验难以控制，制备抗体实验周期较长，成本较高，故目前仅限于科研使用，难以推向临床。

适配体是一种DNA或RNA的寡核苷酸单链，它能与其他分子靶标高亲和力、高特异性地结合。它是利用指数富集配体进化***（systematic evolution ofligands by exponential enrichment，SELEX）技术从人工合成的寡核苷酸文库中筛选而来的。这一技术是基于文库中的寡核苷酸单链能折叠成三维空间立体结构，与靶标高亲和力、高特异性地结合的特性建立起来的。

适配子（Aptamer，又称核酸适体），它是通过模拟自然进化过程的指数富集配体***进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）筛选得到的具有识别功能的新型核酸分子，其本质为RNA或单链NDA（single stranded DNA，ssDNA）片段，这些片段在遇到靶标分子时，可形成口袋、发卡、G-四聚体等各自独特的三维结构与靶分子结合，类似于抗体特异性识别相应抗原表位的过程。与抗体相比，适配子与靶标的亲和力更高，甚至强于其天然配体，解离常数（kd）多在pmol/L-nmol/L之间；适配子能够分别出靶分子结构上细微的差别，甚至可以区分1个甲基或1个羟基的差别，形成了识别的高度特异性，而且适配子筛选周期更短，一般一个SELEX需要8~15个循环，约2个月时间。更为重要的是适配子便于修饰，可以在合成时精确、定点、随意连接其他功能基团和分子，如巯基、氨基和荧光素、生物素、酶等。由于适配子为单核苷酸序列，一旦筛选出，就可以快速源源不断的人工合成相同的适配子，几乎不存在适配子制备的批间误差，真正实现高效、快速、低成本的合成，摒弃了传统的复杂、重复、难控的抗体制备的动物实验。因此，适配子的问世是生物诊断领域又一次革命性的新突破。迄今筛选到的凝血酶、茶碱、抗血管内皮因子等适配子已在诊断中彰显出广阔的应用前景。基于适配子技术，发展高特异性和高灵敏度的检测新方法也称为当前生命科学领域一个非常活跃的研究探索方向，但是针对高尔基体膜蛋白GP73适配子的筛选及其用于肝癌早期诊断的研究在国内外尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种特异性和灵敏度较高、成本较低的高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子；同时，本发明还提供了所述适配子的制备方法及其用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子，其核苷酸序列为：5'-ACGCTCGGATGCCACTACAGTTGGTTTTTTTTTGTTATTTAGAGTAAAAACCTTGTGTGTAGTGACTCATGGACGTGCTGGTGAC-3'。

所述高尔基涂膜蛋白GP73核酸适配子中，两端分别为序列固定的20个碱基，中间45个碱基是与GP73某个空间位点结合的关键结构。本发明所述高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子的序列能够很好的同GP73结合，并运用于临床实验。目前监测GP73方法的原理主要基于抗原抗体反应，但抗体的制备需要动物实验，抗体自身保存使用的条件较为苛刻，具有很多不稳定因素，本发明所述的高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子刚好弥补了这些不稳定因素，而且制备方法和成本较抗体低的多，可为后期临床的广泛使用打下坚实的基础。

本发明还提一种如上所述高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子的制备方法，所述方法包括以下步骤：

（1）随机ssDNA文库的构建：构建人工合成的随机ssDNA文库，文库中所有寡核苷酸分子的两端为固定相同序列，中间为随机序列，随机序列的长度为20-110nt，文库中不同寡核苷酸分子的容量为10¹⁴-10¹⁵；

（2）将步骤（1）构建的ssDNA文库直接用于筛选，筛选过程包括：靶标的固定、文库与靶标共同孵育、洗涤并弃去未结合的适配子、洗脱并收集结合靶标的适配子、PCR扩增收集的适配子、PCR得到双链DNA转变成ssDNA进行下轮筛选；或者将步骤（1）构建的ssDNA文库反转录成RNA文库，然后用于筛选，筛选过程包括：靶标的固定、文库与靶标共同孵育、洗涤并弃去未结合的适配子、洗脱并收集结合靶标的适配子、将收集到的适配子反转录成ssDNA、PCR扩增收集的适配子、PCR得到双链DNA转变成ssDNA进行下轮筛选；

（3）重复步骤（2）进行8-15轮，即可筛选到高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子。

适配子的SELEX筛选过程中，首先要构建人工合成的随机ssDNA文库，文库中所有寡核苷酸分子的两端为固定相同序列，中间为随机序列，随机序列的长短一般在20-110nt，所以文库中不同寡核苷酸分子的容量可达到10¹⁴-10¹⁵，构成了具有丰富分子构象的多样性文库，理论上包括了几乎能与自然界所有分子相结合的适配子。ssDNA文库可直接用于筛选，也可反转录成RNA文库后用于筛选，两者的区别在于ssDNA较RNA更为稳定，但RNA文库的构象较ssDNA更为丰富，实验中可根据具体的实验要求选择不同的文库。

SESEX整个过程以ssDNA文库为例，包括靶标的固定、文库与靶标共同孵育、洗涤并弃去未结合的适配子、洗脱并收集结合靶标的适配子、PCR扩增收集的适配子（若选择RNA文库，先要将收集到的适配子反转录成ssDNA，再进行PCR扩增）、PCR得到的双链DNA转变成ssDNA（该ssDNA为初始文库中的单链，不是其反链）进行下轮筛选。重复上述步骤进行8-15轮，即可筛选到与靶标高亲和力和特异性的适配子。此时，将最后一轮筛选所得的PCR产物进行克隆测序，分析适配子的序列，并进行特异性和亲和力的鉴定，进一步分离出有价值的适配子。

作为本发明所述高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子的制备方法的优选实施方式，所述步骤（1）中构建的ssDNA文库为全长85bp的单链DNA文库：5'-ACGCTC GGA TGC CAC TAC AG-45n-CTC ATG GAC GTG CTG GTG AC-3'，两端分别为序列固定的20个碱基，中间45个碱基为随机序列，整个文库容量为454。

另外，本发明还提供了所述高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子在制备诊断或治疗肝细胞癌药物中的用途。

本发明所述高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子与现有的抗原抗体技术相比，所述适配子不需要难控复杂的动物实验，只需要在普通实验室即可完成，因为实验过程中不需要将蛋白作为抗原注入动物体内，只需要以蛋白为靶标，经过重复筛选即可获得。实验周期较短，从筛选到克隆测序分析完成，1~2个月即可完成，而动物实验最快也要5个月才能完成。筛选获得适配子后，只需要按照适配子的序列，即可源源不断的合成相同的适配子，只要技术适当，可以避免批间差异的产生，这一点是抗体制备过程中无法控制避免的。而且筛选的适配子可以进行各种修饰，且保持时间长，使用条件不苛刻，更加广泛地应用于其他方面。

附图说明

图1为本发明所述高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子的SELEX筛选过程示意图。

图2为ssDNA次级文库筛选过程示意图。

图3为PCR扩增所得dsDNA电泳图；

图3中，M：东盛lowDNA marker；1：PCR循环数为5时，dsDNA电泳结果；2：PCR循环数为8时，dsDNA电泳结果；3：PCR循环数为12时，dsDNA电泳结果；4：PCR循环数为16时，dsDNA电泳结果；5：PCR循环数为20时，dsDNA电泳结果；6：PCR循环数为30时，dsDNA电泳结果。

图4为1、3、5、6、8、10轮筛选文库与重组GP73结合率的直方图；

图4中，横坐标表示不同筛选轮数所得的文库；纵坐标表示在405nm处的吸光度。

图5为正常肝组织和肝癌组织在低倍镜和高倍镜下的光镜观察图；

图5中，A：正常肝组织，箭头表示在低倍镜下观察到的胆管中有棕红色物质；B：正常肝组织，箭头表示在高倍镜下观察胆管中的棕红色物质；C：肝癌组织，箭头分别表示低倍镜下胆管中和广泛肝组织中的红棕色物质；D：肝癌组织，箭头表示在高倍镜下，观察胆管中和广泛肝组织中的红棕色物质。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子的筛选

1、随机ssDNA文库与相应引物的合成：

设计合成全长为85bp的单链DNA（ssDNA）文库：5'-ACGCTCGGATGCCACTACAG-45n-CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3'，两端分别为序列固定的20个碱基，以便设计相应的PCR引物，中间45个碱基为随机序列，整个文库容量达到了454；上游引物5'-ACG CTC GGA TGC CAC TAC AG-3'，下游引物5'-GT CACCAG CAC GTC CAT GAG-3'；上游标记引物5'-DIG（地高辛）-ACG CTC GGATGC CAC TAC AG-3'，下游标记引物5'-Biotin(生物素）-GT CAC CAG CAC GTCCAT GAG-3'。

2、GP73蛋白适配子的筛选：

（1）GP73蛋白以每孔200ng的量包被于96孔板上（包被液为0.05mol/LNaHCO3，PH9.6的缓冲液），4℃包被过夜，设立空白对照孔；次日弃去孔中液体，用PBS-T洗涤3次，于吸水纸上拍干，蛋白包被孔和空白对照孔均以3%BSA200μL37℃封闭2h。

（2）将10μM的ssDNA文库随机与一定量结合缓冲液SHCMK液混合（注意调整ssDNA文库量，在第一轮的筛选中，文库量为2000pmol,经过筛选轮数的增加，文库量逐渐减少），混合后的文库先与3%BSA封闭的空白对照孔37℃结合40min，反筛去与空白孔结合的ssDNA，然后将混合液转移到蛋白包被孔，37℃结合40min，用冲洗缓冲液（SHCMK液+0.05%Tween20）洗六次，洗去未结合的ssDNA,再加洗脱缓冲液（20mmol/L Tris-HCL，4mol/L异硫氰酸胍，1mmol/DTT，PH8.3）于80℃作用10min，洗脱下与目的蛋白结合的ssDNA,经DNA纯化试剂盒，将ssDNA溶解于50微升TE缓冲液中。

（3）以上述纯化所得的ssDNA为模板，用上游引物和生物素下游标记引物进行PCR扩增，扩增体系如下：

（4）取100μL磁珠悬液于1.5ml的EP管中，然后将EP管放在磁力架上2min，磁珠在磁场的作用下吸附于EP管的一侧，用移液管吸出管中液体弃去，将EP管从磁力架上去下，用1×B&W以100μL重悬EP管中的磁珠，重复上述步骤三次，即将磁珠清洗三次后，用2×B&W50μL重悬EP管中的磁珠，再以等倍的体积加入步骤（3）中经DNA纯化试剂盒纯化后的生物素标记的dsDNA，37℃水浴20min，使dsDNA与标记有亲和素的磁珠充分结合，最后此时用150mM的NAOH100μL使dsDNA解链变性成ssDNA，带有生物素的单链和亲和素相连结合在磁珠上，而文库链处于游离状态，再利用磁力架，分离磁珠和游离的溶液，就可获得文库ssDNA作为次级文库，如附图2所示。

（5）再以每孔180ng的GP73重组蛋白包被于96孔板上，4℃包被过夜，次日3%BSA37℃封闭2h。调整（4）中分离得到的次级文库含量为1500pmol，与终浓度为0.15mg/LtRNA在结合缓冲液SHCMK液充分混合，将混合液转移到蛋白包被孔，37℃结合40min，用冲洗缓冲液洗六次，洗去未结合的ssDNA,再加洗脱缓冲液，于80℃作用10min，洗脱下与目的蛋白结合的ssDNA,经DNA纯化试剂盒，将ssDNA溶解于20微升TE缓冲液中。

（6）后续步骤同（3）（4），此为第二轮筛选所得的次级文库。由于高亲和力适配子的含量在文库中很低，故在最初几轮中应该使用较高含量的pET-32a(+)-GP73重组蛋白，以保证尽可能多地捕捉到相应的适配子，随后的筛选中，由于高亲和力的适配子经过PCR扩增得到富集，其浓度足以与高含量的低亲和力适配子竞争，此时降低pET-32a(+)-GP73重组蛋白包被量，以加强筛选的严谨性，tRNA是非特异性竞争剂，与适配子竞争结合目的蛋白，随着筛选轮数的增加，tRNA浓度也不断增大，有利于从随机文库中筛选出高亲和力的适配子。如此循环，随着筛选严谨度的不断增加，低亲和力序列逐渐被淘汰。经过大约6～12轮筛选后，测定每轮所得文库与GP73结合率，当结合率达到饱和时，停止筛选，筛选过程如附图1所示，具体筛选内容见表1。

表1

实施例2文库与目的蛋白结合率的测定

（1）将1、3、5、6、8、10轮筛选所得的次级ssDNA文库用地高辛标记的上游引物和生物素标记的下游引物进行PCR扩增，扩增体系如下：

（2）扩增出的dsDNA除非文库链上标记生物素以外，文库链也标记上了地高辛，dsDNA经DNA纯化试剂盒纯化后，利用亲和素磁珠和磁力架（步骤同实施例1中的（4））即可分离出地高辛标记的文库链。

（3）以每孔200ng的重组蛋白包被96孔板，共包被12个孔，每2个孔为一组，每组都设立空白对照孔和梅毒蛋白对照孔。调节1、3、5、6、8、10轮所得地高辛标记的文库浓度为40ng/μL，使文库含量一致，分别加入每组的的板孔中，37℃温育2小时，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液（pH7.4PBS-T）洗涤3次，每次3min；洗板拍干后于各反应孔中，加入新鲜稀释的碱性磷酸酶标记的地高辛抗体（经滴定后的稀释度为1:10000）200μL，37℃孵育0.5-1小时，PBS-T洗涤3次，最后一遍用ddH2O洗涤，DEA（二乙醇氨）缓冲液平衡5min；弃去孔中溶液拍干后，于各反应孔中加入临时配制的200μL 1mg/mL的PNPP，30℃45min显色,于各反应孔中加入1M氢氧化钠100μL终止反应,在ELISA检测仪上，于405nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。

克隆测序

（1）经结合率的分析，以6、8、10轮所获得的ssDNA为模板，用正常未标记的上下引物将ssDNA扩增成dsDNA,扩增体系如下：

（2）将6、8、10轮扩增获得的dsDNA产物分别同pMD19-T载体相连，连接体系如下：

16℃，连接过夜。

（3）次日，分别将6、8、10轮的将连接产物全量（10μl）加入至制备好的装有DH5α感受态细胞的3支EP管中，冰中放置30min，42℃加热90秒钟后，再在冰中放置3min，每支管中加入500μl LB培养基，37℃振荡培养1h，4100rpm转速离心10min，收集菌体，分别以200μl的LB重悬菌体，然后将重悬菌液均匀的涂抹在3块含Amp的LB固体平板上，做好标记37℃过夜培养。

（4）第二天，分别在6、8、10轮的平板上挑取30-50个菌株做连接产物的菌液PCR鉴定。

（5）在上述3个平板中，每个平板随机选取30株阳性菌株送往英骏公司测序。

（6）根据测序结果，运用使用RNA Structure软件对所得序列进行一级结构同源性分析和二级机构的预测。

实验结果

ssDNA到dsDNAPCR循环数的摸索

以第一轮筛选纯化所得的ssDNA为模板，用上游引物和生物素下游标记引物进行PCR扩增成dsDNA，不同PCR循环数下产生dsDNA电泳结果，由图4可知，在PCR循环数为5时即可见85bp的文库条带（泳道1），此时产物量不高，文库条带亮度较弱，随着PCR循环数的增加，产物量逐渐增加（泳道2、3），但是到循环数为16时，在文库条带上方出现了非特异性条带（泳道4、5、6），此时选择循环数为12（泳道3）时的PCR产物为后续实验所用，既保证了产物达到最大，又不会产生非特异性条带，详见附图3。

1、3、5、6、8、10轮筛选文库与重组GP73结合率检测

随着筛选轮数的增加，与GP73结合的文库得到了富集，从第一轮的0.060-0.057上升到了第十轮的0.655-0.612，结果见表2和图4。

表2

由1、3、5、6、8、10轮筛选文库与重组GP73结合率直方图（附图4）可知，随着筛选轮数的增加，各组文库与重组GP73的结合率增大，到第6、8、10这三轮，增幅不明显，说明文库与GP73的结合率趋于饱和，此时停止筛选，选择第6、8、10轮的文库进行克隆测序，分析。

第6、8、10轮文库的测序分析

取6、8、10轮的阳性克隆的菌液样品各30株，共90株送英骏公司测序，测序结果为，在第10轮中，出现了两对相同的序列，其余都为单一序列，结果如下：

第10轮筛选结果：

Aptamer10-2和Aptamer10-3序列一致

Aptamer10-2：

ACGCTCGGATGCCACTACAGTTGGTTTTTTTTTGTTATTTAGAGTAAAAACCTTGTGTGTAGTGACTCATGGACGTGCTGGTGAC

Aptamer10-3：

ACGCTCGGATGCCACTACAGTTGGTTTTTTTTTGTTATTTAGAGTAAAAACCTTGTGTGTAGTGACTCATGGACGTGCTGGTGAC

实施例3本发明所述高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子在临床免疫组化中的初步应用

肝癌组织及正常肝组织切片由广州医学院附属第一医院提供，肝脏组织切片经60℃烤片30分钟脱水处理后，进行脱蜡处理（二甲苯Ⅰ15分钟、二甲苯Ⅱ10分钟、无水乙醇Ⅰ2分钟、无水乙醇Ⅱ2分钟、95%酒精2分钟、90%酒精2分钟），再在微波中使用柠檬酸盐进行修复（中火10分钟、冷却20分钟，TBST洗5分钟），修复后用3%H₂O₂处理15分钟再用TBST封闭30分钟，封闭后再加生物素化的aptamer10-2,37℃孵育2小时，孵育后TBST洗3次，每次3分钟，洗涤后加入亲和素标记的-HRP，（1：500稀释）37℃孵育2小时，再用TBST洗涤3次，加入HRP-羊抗兔IgG，（1：5000稀释）37℃孵育2小时，抗洗涤后加入DBA显色，水终止反应后加入苏木素染色2分钟，用流水终止显色，再经盐酸酒精分化后在流水中冲洗15分钟，结果经光镜观察，如附图5所示。

结果

选择正常肝脏组织胆管切片和肝癌组织病理切片，观察适配子aptamer10-2识别GP73的情况，从下图可看出，低倍镜下，正常组织A中，细胞核都为蓝色，只有在箭头所指的胆管部位才成红棕色，表明适配子能和正常组织胆管中的GP73结合，在肝癌组织C中，出胆管成红棕色外，肝细胞组织都成红棕色，说明GP73在肝癌组织中广泛存在，同时也证明适配子可以和该组织中的GP73结合，高倍镜观察正常组织B和肝癌组织D中，能更清楚的看到GP73的分布，这说明所筛选的适配子aptamer10-2有良好的识别人体组织GP73的功能。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (2)

1.一种高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子，其特征在于，其核苷酸序列为：5'-ACGCTCGGATGCCACTACAGTTGGTTTTTTTTTGTTATTTAGAGTAAAAACCTTGTGTGTAGTGACTCATGGACGTGCTGGTGAC-3'。

2.如权利要求1所述高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子在制备诊断或治疗肝细胞癌药物中的用途。

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