CN107058235A - 一种b细胞筛选方法及其在单克隆抗体制备中的应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种B细胞筛选方法及其在单克隆抗体制备中的应用。该B细胞筛选方法包括如下步骤：S11、在Protein A蛋白基因的N端加上分泌表达的信号肽序列，在C端加上跨膜蛋白基因序列，得到融合外源基因；S12、将所述融合外源基因转染已经免疫完成的B细胞，作为待筛选细胞；S13、向所述待筛选细胞中加入标记荧光的抗原，使用流式细胞仪将带有荧光的细胞分选收集，得到阳性B细胞。本发明将抗体分子集合在细胞表面，利用流式细胞仪的快速精密的分选功能，提前对待融合细胞进行筛选，大大改进传统方法的成功率，准确率，更是解决后期对单克隆抗体细胞株的检测问题。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种B细胞筛选方法及其在单克隆抗体制备中的应用。
背景技术
单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤(hybridoma)抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。杂交瘤细胞的制备是生物学领域中常用的技术手段，常规方法中对融合后的细胞株的检测，鉴定费时费力，成功率不高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于：杂交瘤细胞的制备过程中对融合细胞株的检测费时费力、成功率不高。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：提供一种B细胞筛选方法，包括如下步骤：
S11、在Protein A蛋白基因的N端加上分泌表达的信号肽序列，在C端加上跨膜蛋白基因序列，得到融合外源基因；
S12、将所述融合外源基因转染已经免疫完成的B细胞，作为待筛选细胞；
S13、向所述待筛选细胞中加入标记荧光的抗原，使用流式细胞仪将带有荧光的细胞分选收集，得到阳性B细胞。
在本发明提供的B细胞筛选方法中，所述步骤S11中，设计上游引物和下游引物，在N端加上分泌表达的信号肽序列，在C端加上跨膜蛋白基因序列，将这三段序列相连，以金黄色葡萄菌的DNA为模板，采用所述上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到所述融合外源基因。
在本发明提供的B细胞筛选方法中，所述上游引物和下游引物设计如下：
PROTEIN-BAMH I-F:
5’-CCAGGATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGCGGCCAATGCTGCGCAACACGATGAA-3’；
PROTEIN-XHOI-R:
5’-CCGCTCGAGTCAGACACAGAAGAAGATGCCTAGCCCAATGAAAAGCAGGAGGCCGGCGACGCCCCCCAGCACAATCAGGGCGCCCCCCAGCACAATCAG-3’。
在本发明提供的B细胞筛选方法中，所述步骤S12中，将所述融合外源基因与慢病毒载体相连，得到慢病毒表达质粒，转染已经免疫完成的B细胞。
在本发明提供的B细胞筛选方法中，所述慢病毒表达质粒与慢病毒辅助质粒共转染已经免疫完成的B细胞。
在本发明提供的B细胞筛选方法中，取免疫后动物的脾脏，分离得到的脾细胞即为所述已经免疫完成的B细胞。
在本发明提供的B细胞筛选方法中，所述步骤S13中，分泌表达的Protein A蛋白通过跨膜蛋白挂在细胞膜上，抗体分子同时被Protein A蛋白吸附后被聚集在细胞膜表面，标记荧光的抗原与抗体结合，形成Protein A蛋白+目标抗体分子+抗原的复合体，这种复合体与B细胞相连，由于抗原分子带有荧光信号，采用流式细胞仪的分选收集阳性B细胞。
本发明还提供一种B细胞筛选方法在单克隆抗体制备中的应用，将上述方法中筛选得到的阳性B细胞与骨髓瘤细胞融合，用于制备单克隆抗体。
本发明还提供一种单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
S21、在Protein A蛋白基因的N端加上分泌表达的信号肽序列，在C端加上跨膜蛋白基因序列，得到融合外源基因；
S22、将所述融合外源基因转染已经免疫完成的B细胞，作为待筛选细胞；
S23、向所述待筛选细胞中加入标记荧光的抗原，使用流式细胞仪将带有荧光的细胞分选收集，得到阳性B细胞；
S24、将所述阳性B细胞与骨髓瘤细胞融合，所得杂交瘤细胞用于制备单克隆抗体。
在本发明提供的单克隆抗体的制备方法中，所述步骤S24中，所述阳性B细胞与骨髓瘤细胞融合后，通过稀释法培养得到单克隆细胞株，取其分泌的抗体。
实施本发明，具有如下有益效果：本发明通过设计分泌表达Protein A蛋白，并在Protein A蛋白的N端加上跨膜区蛋白，转染已免疫完成的B细胞后，Protein A蛋白自然通过跨膜蛋白与细胞膜连接，同时将免疫产生的抗体分子聚集在细胞表面，抗体更容易被识别和检测，同时流式细胞仪是细胞生物学的常用仪器，它能够快速有效对细胞进行分析和分选，利用这个特点筛选阳性细胞，将大大提高实验效率。
附图说明
图1为实施例2中流式细胞仪筛选得到的阳性B细胞。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明内容做具体说明。
本发明创新点在于，将抗体分子集合在细胞表面，利用流式细胞仪的快速精密的分选功能，提前对待融合细胞进行筛选，大大改进传统方法的成功率，准确率，更是解决后期对单克隆抗体细胞株的检测问题。
在本发明B细胞筛选方法的一个较佳实施例中，包括如下步骤：
S11、在Protein A蛋白基因的N端加上分泌表达的信号肽序列，在C端加上跨膜蛋白基因序列，得到融合外源基因；
S12、将所述融合外源基因转染已经免疫完成的B细胞，作为待筛选细胞；
S13、向所述待筛选细胞中加入标记荧光的抗原，使用流式细胞仪将带有荧光的细胞分选收集，得到阳性B细胞。
利用Protein A蛋白能与抗体接合的特性，将Protein A蛋白以跨膜表达的形式表达在B细胞膜表面，单抗分子形成时从B细胞内分泌出来，正好被Protein A蛋白截获，通过已标记荧光的抗原与抗体分子结合，这样形成Protein A蛋白+目标单克隆抗体分子+抗原的复合体，这种复合体与B细胞相连，由于抗原分子带有的荧光信号，可以采用流式细胞仪的分析分选功能，提前筛选，将带有荧光的细胞收集，从而得到阳性B细胞。本发明中B细胞筛选方法将单克隆抗体的制备筛选过程提前进行，利用流式细胞的分选，直接筛选出阳性细胞，再进行融合，简化实验操作，提高实验效率。
在本发明B细胞筛选方法的另一个较佳实施例中，在上述实施例的基础上，所述步骤S11中，设计上游引物和下游引物，在N端加上分泌表达的信号肽序列，在C端加上跨膜蛋白基因序列，将这三段序列相连，以金黄色葡萄菌的DNA为模板，采用所述上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到所述融合外源基因。特别需要说明的是，其它能够将这三段序列相连的方式其完全适用于本发明，例如全基因合成该融合外源基因，使得Protein A蛋白基因的N端加上分泌表达的信号肽序列，在C端加上跨膜蛋白基因序列。优选的，所述上游引物和下游引物设计如下：
PROTEIN-BAMH I-F:
5’-CCAGGATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGCGGCCAATGCTGCGCAACACGATGAA-3’；
PROTEIN-XHOI-R:
5’-CCGCTCGAGTCAGACACAGAAGAAGATGCCTAGCCCAATGAAAAGCAGGAGGCCGGCGACGCCCCCCAGCACAATCAGGGCGCCCCCCAGCACAATCAG-3’。
在本发明B细胞筛选方法的另一个较佳实施例中，在上述实施例的基础上，所述步骤S12中，将所述融合外源基因与慢病毒载体相连，得到慢病毒表达质粒，转染已经免疫完成的B细胞。优选的，所述慢病毒表达质粒与慢病毒辅助质粒共转染已经免疫完成的B细胞。已经免疫完成的B细胞直接动物组织中分离，例如取免疫后动物的脾脏，分离得到的脾细胞；当然，其它淋巴组织中分离得到的B细胞也完全适用于本发明，例如，从消化道粘膜下的淋巴小结中分离得到的B细胞。
本发明还提供一种上述B细胞筛选方法在单克隆抗体制备中的应用，将上述方法中筛选得到的阳性B细胞与骨髓瘤细胞融合，用于制备单克隆抗体。具体应用过程即为一种单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
S21、在Protein A蛋白基因的N端加上分泌表达的信号肽序列，在C端加上跨膜蛋白基因序列，得到融合外源基因；
S22、将所述融合外源基因转染已经免疫完成的B细胞，作为待筛选细胞；
S23、向所述待筛选细胞中加入标记荧光的抗原，使用流式细胞仪将带有荧光的细胞分选收集，得到阳性B细胞；
S24、将所述阳性B细胞与骨髓瘤细胞融合，所得杂交瘤细胞用于制备单克隆抗体。
优选的，所述阳性B细胞与骨髓瘤细胞融合后，通过稀释法培养得到单克隆细胞株，取其分泌的抗体。
实施例1
一、设计引物扩增Protein A基因序列，引物两端分别带有分泌信号肽及跨膜蛋白DNA片段，同时引入酶切位点，引物设计如下：
PROTEIN-BAMH I-F:
5’-CCAGGATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGCGGCCAATGCTGCGCAACACGATGAA-3’；
PROTEIN-XHOI-R:
5’-CCGCTCGAGTCAGACACAGAAGAAGATGCCTAGCCCAATGAAAAGCAGGAGGCCGGCGACGCCCCCCAGCACAATCAGGGCGCCCCCCAGCACAATCAG-3’。
在上游引物中引入BamH I酶切位点，下游引入Xho I，直接以金黄色葡萄菌菌液为模板，扩增Protein A基因。
二、慢病毒表达质粒的构建
以pLVX-puro慢病毒***构建，同时以BamH I及Xho I双酶切pLVX-puro和ProteinA，构建成pLVX-puro-Protein A慢病毒表达质粒，
三、Protein A慢病毒液的制备
将pLVX-puro-Protein A质粒和包装质粒pSPAX2,pCMV-VSV-G一起转染293T细胞中，24小时后，收集上清液，即为Protein A慢病毒液。
实施例2
以制备人糖蛋白Tamm-Horsfall(THP)单抗为例说明本发明完整的单克隆抗体的制备方法。
一、合成氨基酸序列
根据(NCBI)数据库中查找到THP蛋白序列，经过蛋白分析，选取THP抗原性较强的两段蛋白序列合成多肽，序列分别为，同时分两组合成，一组，直接合成多肽(标记为THP)，以PBS配制成2μg/μl贮存，另外一组在合成的多肽C端偶联荧光标签FITC(标记为THP-FITC)，以PBS配制成2μg/μl避光贮存，多肽THP将作为免疫原直接免疫小鼠产生抗体，多肽THP-FITC作为标记物进行免疫荧光检测。
二、小鼠免疫
采用BALB/c小鼠的常规免疫方法，第一针免疫采用完全佐剂乳化多肽，每只小鼠免疫50微克多肽，总共免疫三只小鼠，同时取无免疫的小鼠作为参照，第二针，第三针均采用不完全佐剂乳化多肽，每针免疫时间间隔二周，其中每免疫一针后均采用断尾法取血进行抗体检测。
三、小鼠脾细胞的制备
取免疫后的小鼠，摘眼球法采血，置于4℃冰箱静止过夜，第二分离血清作为抗体阳性对照，同时通过颈脱位致死小鼠。浸泡于75％酒精中5分钟消毒处理，于超净台上剪开腹部，取出脾脏置于含有血清的1460培养基中，剥去周围的***，用无菌注射器往脾脏里注入培养基，使脾脏涨开，将脾细胞放于400目的筛网上，用注射器的内芯挤压脾脏，使脾细胞通过筛网过滤，待用。
四、Protein A慢病毒液感染细胞
在制备好的小鼠脾细胞加入Protein A慢病毒液感染细胞，继续培养24小时，去尽培养基，更换新鲜培养基。
五、小鼠脾细胞的免疫荧光反应
在经过Protein A慢病毒感染的小鼠脾细胞中以1比500的比例加入多肽THP-FITC，同时以无免疫小鼠脾细胞同样处理作为阴性对照，于二氧化碳培养箱中反应2小时，收集细胞，以1000r/min离心5分钟，以PBS洗涤3次，重悬细胞于1ml PBS中，准备通过流式细胞仪筛选。
六、流式细胞仪的筛选
将制备好的小鼠脾细胞通过流式细胞仪的筛选，收集阳性细胞，以1640培养基培养，图1为筛选得到的阳性细胞。
七、细胞融合
将阳性细胞与骨髓杂交瘤细胞SP2/0融合，2周后通过稀释法得到单克隆细胞株。
八、单克隆抗体株的检定
培养单克隆细胞株，取其分泌的抗体检测，检测结果显示有THP单抗表达。
以上实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
Claims (10)
1.一种B细胞筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
S11、在Protein A蛋白基因的N端加上分泌表达的信号肽序列，在C端加上跨膜蛋白基因序列，得到融合外源基因；
S12、将所述融合外源基因转染已经免疫完成的B细胞，作为待筛选细胞；
S13、向所述待筛选细胞中加入标记荧光的抗原，使用流式细胞仪将带有荧光的细胞分选收集，得到阳性B细胞。
2.根据权利要求1所述的B细胞筛选方法，其特征在于，所述步骤S11中，设计上游引物和下游引物，在N端加上分泌表达的信号肽序列，在C端加上跨膜蛋白基因序列，将这三段序列相连，以金黄色葡萄菌的DNA为模板，采用所述上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到所述融合外源基因。
3.根据权利要求2所述的B细胞筛选方法，其特征在于，所述上游引物和下游引物设计如下：
PROTEIN-BAMHI-F:
5’-CCAGGATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGCGGCCAATGCTGCGCAACACGATGAA-3’；
PROTEIN-XHOI-R:
5’-CCGCTCGAGTCAGACACAGAAGAAGATGCCTAGCCCAATGAAAAGCAGGAGGCCGGCGACGCCCCCCAGCACAATCAGGGCGCCCCCCAGCACAATCAG-3’。
4.根据权利要求1所述的B细胞筛选方法，其特征在于，所述步骤S12中，将所述融合外源基因与慢病毒载体相连，得到慢病毒表达质粒，转染已经免疫完成的B细胞。
5.根据权利要求4所述的B细胞筛选方法，其特征在于，所述慢病毒表达质粒与慢病毒辅助质粒共转染已经免疫完成的B细胞。
6.根据权利要求4所述的B细胞筛选方法，其特征在于，取免疫后动物的脾脏，分离得到的脾细胞即为所述已经免疫完成的B细胞。
7.根据权利要求1所述的B细胞筛选方法，其特征在于，所述步骤S13中，分泌表达的Protein A蛋白通过跨膜蛋白挂在细胞膜上，抗体分子同时被Protein A蛋白吸附后被聚集在细胞膜表面，标记荧光的抗原与抗体结合，形成Protein A蛋白+目标抗体分子+抗原的复合体，这种复合体与B细胞相连，由于抗原分子带有荧光信号，采用流式细胞仪的分选收集阳性B细胞。
8.一种B细胞筛选方法在单克隆抗体制备中的应用，其特征在于，将权利要求中筛选得到的阳性B细胞与骨髓瘤细胞融合，用于制备单克隆抗体。
9.一种单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S21、在Protein A蛋白基因的N端加上分泌表达的信号肽序列，在C端加上跨膜蛋白基因序列，得到融合外源基因；
S22、将所述融合外源基因转染已经免疫完成的B细胞，作为待筛选细胞；
S23、向所述待筛选细胞中加入标记荧光的抗原，使用流式细胞仪将带有荧光的细胞分选收集，得到阳性B细胞；
S24、将所述阳性B细胞与骨髓瘤细胞融合，所得杂交瘤细胞用于制备单克隆抗体。
10.根据权利要求9所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤S24中，所述阳性B细胞与骨髓瘤细胞融合后，通过稀释法培养得到单克隆细胞株，取其分泌的抗体。
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