CN114651065A - 导入用于提高蛋白质生产性的单个条形码***的信号肽超高速筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及如下的组合物，即，用于在各种信号肽中筛选将靶蛋白有效分泌到细胞外的最佳信号肽。并且，本发明涉及如下的筛选方法，即，用于筛选通过在宿主细胞中表达靶蛋白来将靶蛋白有效分泌到细胞外的特定信号肽。若利用本发明的组合物和/或筛选方法，则可通过为每个上述信号肽制备的条形码序列超高速筛选最适合靶蛋白的信号肽，因此，可最大化重组蛋白的生产收率。

Description

导入用于提高蛋白质生产性的单个条形码***的信号肽超高 速筛选方法
技术领域
本发明涉及包含条形码序列的组合物，用于在各种信号肽中筛选将靶蛋白有效分泌到宿主细胞外的特定信号肽。
背景技术
随着全世界生物科学技术的发展，对于蛋白质的结构及功能的研究一直积极进行，随着重组药物市场的爆发式增长，包括对于疾病靶点具有特异性、副作用小的治疗用抗体在内，以往以小分子药物为主的全球制药市场的版权正被颠覆。
重组蛋白药物是指针对难以利用基因重组技术从活体获得的治疗用蛋白成分，通过微生物或动物细胞***大量生产的药物。可调节重组蛋白在细胞中表达或分泌到细胞外。当在细胞中表达时，因蛋白质的过表达而在细胞中经常聚集成非活性状态的不溶性块，即便并非如此，也提供诸多降低生产性的因素，例如，破碎细胞的不便及与存在于细胞中的诸多蛋白质进行分离的纯化工序上的困难等。相反，若将生成的蛋白质分泌到细胞外，则可轻易避免随上述情况而发生的困难。并且，由于蛋白质的细胞外分泌只有在蛋白质在转录后被正确折叠及修饰时才可能发生，因此，具有如下优点，即，当生产治疗用蛋白质时，可获得具有精确三级结构的活化形态的可溶性蛋白质。因此，以能够分泌到细胞外的方式生产重组蛋白有利于蛋白质的生产收率及蛋白质的质量管理(quality control)。因此，在制备重组蛋白药物的过程中，需要能够将重组蛋白有效分泌到细胞外的最佳步骤。
信号肽位于分泌蛋白或膜蛋白的N末端，作为起到分泌蛋白或膜蛋白的靶向(targeting)信号作用的氨基酸序列，当前已知的真核生物信号肽种类多样，有4000种～5000多种。在生产靶蛋白的过程中，靶蛋白的细胞外分泌率可能因应用的信号肽而异，与此相关的报告有通过筛选适合靶蛋白的信号肽来优化靶蛋白细胞外分泌的研究(ActaBiochim Biophys Sin(Shanghai)(2011)43(2)：96-102，Signal peptide replacementsenhance expression and secretion of hepatitis C virus envelopeglycoproteins.Biochem Biophys Res Commun.2010Jan 1；391(1)：931-5，Signalpeptide design for improving recombinant protein secretion in the baculovirusexpression vector system.)。
因此，当开发蛋白质药物时，在上述4000种以上的信号肽中，若超高速筛选最适合靶蛋白表达的信号肽并将其导入靶蛋白中，则可以人为地诱导重组蛋白药物产量的最大化。
以上，作为背景技术来说明的事项仅用于增进对本发明背景的理解，不应被视为承认这些事项对应于本发明技术领域的本技术领域的普通技术人员已知的现有技术。
发明内容
技术问题
本发明人致力于寻找一种可以超高速搜索能够将靶蛋白高效分泌到细胞外且最适合靶蛋白分泌的信号肽的方法。结果确认到，若通过组合特定种类的氨基酸来为每个上述信号肽制备条形码序列并将其文库化后，在宿主细胞中表达并利用宿主细胞的培养液对靶蛋白进行定量，则可筛选出能够将靶蛋白有效分泌到外的最佳信号肽，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供如下的组合物，即，用于在各种信号肽(signalpeptide)中筛选将靶蛋白(target protein)有效分泌到宿主细胞外的特定信号肽(signalpeptide)。
本发明的再一目的在于，提供筛选方法，用于筛选通过在宿主细胞中表达靶蛋白来将靶蛋白有效分泌到细胞外的特定信号肽。
本发明的其他目的及优点可通过以下本发明的具体说明、发明要求保护范围及附图变得进一步明确。
解决问题的方案
根据本发明的一方面，本发明提供如下的组合物，即，用于在各种信号肽(signalpeptide)中筛选将靶蛋白(target protein)有效分泌到宿主细胞外的特定信号肽(signalpeptide)。
本发明人致力于寻找一种可以超高速搜索能够将靶蛋白高效分泌到细胞外且最适合靶蛋白分泌的最佳信号肽的方法，结果发现，若通过组合特定种类的氨基酸来为每个上述信号肽制备条形码序列并将其应用于靶蛋白，则可筛选出能够将靶蛋白有效分泌到外部的最佳信号肽。
在本说明书中，术语“信号肽”或“signal peptide”是指与分泌到细胞外的分泌性蛋白的N末端(前端)结合而通过细胞膜的肽。通常，上述信号肽由10个至30个氨基酸组成，在通过膜的过程中，被特异蛋白酶(protease)切割并去除，只允许上述分泌蛋白分泌到细胞外。据目前所知的存在于真核细胞中的信号肽共有4137种(Uniprot，2017.06)。
分泌到细胞外的分泌性蛋白分别具有固有信号肽，但预计分别具有不同的信号肽，以表达细胞种类、表达蛋白质的作用或表达适量的蛋白质。
在本说明书中，术语“靶蛋白”或“target protein”是指利用适当的宿主细胞高效生产的蛋白质，在开发生物药物时，若将对靶蛋白的最佳信号肽导入重组蛋白，则可以人为地诱导上述靶蛋白产量的最大化。
根据本发明的优选实例，上述组合物包含含有信号肽标签(SP-tag，Signalpeptide tag)的多肽或编码上述多肽的核酸分子。
在本说明书中，术语“信号肽标签”、“Signal peptide tag”或“SP-tag”作为包含由每个信号肽的条形码互不相同的3个以上的氨基酸组成的条形码序列(Barcodingsequence)的标签，是指可直接或通过连接肽结合在靶蛋白的C末端(后端)的肽标签。
根据本发明的优选实例，上述3个以上的氨基酸选自由亮氨酸(L，Leucine)、脯氨酸(P，Proline)、丙氨酸(A，Alanine)、色氨酸(W，Tryptophan)、酪氨酸(Y，Tyrosine)、苏氨酸(T，Threonine)、丝氨酸(S，Serine)、谷氨酸(E，Glutamate)及天冬氨酸(D，Aspartate)组成的组中。
在组合上述9种氨基酸中的3个来生成密码子的情况下，总共可以对729种(9×9×9)信号肽进行条形码化，在组合4个来生成密码子的情况下，可对6561种(9×9×9×9)信号肽进行条形码化，在组合5个来生成密码子的情况下，可对59049种(9×9×9×9×9)信号肽进行条形码化。考虑到当前已知真核生物的信号肽种类为4137种，上述条形码序列优选为3个至8个，更优选为3个至5个。
根据本发明的优选实例。上述条形码序列可由上述9种氨基酸中的3个相同氨基酸组成。
例如，可选自由LLL、PPP、AAA、WWW、YYY、TTT、SSS、EEE及DDD组成的组中。
根据本发明的优选实例，上述条形码序列可由上述9种氨基酸中的2个相同的氨基酸与其他1个氨基酸组成。
例如，以LLP、PPA、AAW、WWY、YYT、TTS、SSE、EED及DDL等相同氨基酸连续重复的形式组成序列，或者，还能够以LDL、PEP、ASA、WTW、YLY、TPT、SAS、EWE及DYD等相同氨基酸之间***有其他氨基酸的形式组成序列。
根据本发明的优选实例，上述条形码序列可由上述9种氨基酸中的3个互不相同的氨基酸组成。
例如，能够以LPA、PAW、AWY、WYT、YTS、TSE、SED、EDL及DLP等互不相同的氨基酸排列的形式组成序列。
根据本发明的优选实例，上述条形码序列可由上述9种氨基酸中的4个相同氨基酸组成。
根据本发明的优选实例，上述条形码序列可由上述9种氨基酸中的部分相同的氨基酸与部分不同的氨基酸相组合的4个氨基酸组成。
根据本发明的优选实例，上述条形码序列可由上述9种氨基酸中的5个相同的氨基酸组成。
根据本发明的优选实例，上述条形码序列可由上述9种氨基酸中的部分相同的氨基酸与部分不同的氨基酸相组合的5个氨基酸组成。
根据本发明的优选实例，上述条形码序列包括下述序列表中序列1或由序列表中序列1组成。
[L]1[L]2[L]3(序列表中序列1)
在上述序列表中序列1中的[L]1、[L]2或[L]3可被选自由P、A、W、Y、T、S、E及D组成的组中的氨基酸取代。
根据本发明的优选实例，上述条形码序列包括下述序列表中序列2或由序列表中序列2组成。
[L]1[L]2[L]3[L]4(序列表中序列2)
在上述序列表中序列2中的[L]1、[L]2、[L]3或[L]4可被选自由P、A、W、Y、T、S、E及D组成的组中的氨基酸取代。
根据本发明的优选实例，上述条形码序列可包括下述序列表中序列3或由序列表中序列3组成。
[L]1[L]2[L]3[L]4[L]5(序列表中序列3)
在上述序列表中序列3中的[L]1、[L]2、[L]3、[L]4或[L]5可被选自由P、A、W、Y、T、S、E及D组成的组中的氨基酸取代。
根据本发明的一实施例，将上述9种氨基酸选定为条形码序列的理由如下。
①首先，从20种氨基酸中除去作为胰蛋白酶切割位点的K及R来选定18种氨基酸。
②接着，通过以下实验从上述18种氨基酸中除去亲水指数(hydropathy index)较高或较低的V、F、G、C、H及N等6种来选定12种氨基酸。首先，逐个区分氨基酸并通过液相色谱质谱联用法(LC-MS)分析来确认表达量是否相同。在通过液相色谱质谱联用法(LC-MS)分析V、F、G、C、H及N的情况下，因确认到相对较高或相对较低的值而将其从上述氨基酸中除去(并且，上述H还存在对His tag产生影响的可能性及产生电荷变化的隐患)。
③进一步地，在上述12种氨基酸中排除蛋白质消化(digestion)过程中有可能发生氧化修饰(oxidation modificatio)的M来共选定11种氨基酸。
④最后，在其中排除具有相似质量(Similar Mass)的I、Q、N、L、E及D中的I及Q(N在步骤②中排除)并仅使用L、E及D来最终设计9种L、P、A、W、Y、T、S、E及D的条形码序列。
根据本发明的优选实例，上述信号肽标签在上述条形码序列的N末端(前端)还包括蛋白质水解切割位点(proteolytic cleavage site)，使得条形码序列可被上述蛋白质切割。
在本说明书中，术语“蛋白质水解切割位点”或“proteolytic cleavage site”作为要切割的蛋白质或肽内所包含的位点，是指特定蛋白质可识别上述位点来切割蛋白质或肽的待切割位点。
在本技术领域中，已知有各种蛋白质水解切割位点，优选地，包括胰蛋白酶切割位点(trypsin cleavage site)、凝血酶切割位点(thrombin cleavage site)、肠激酶切割位点(enterokinase cleavage site)、因子Xa切割位点(Factor Xa cleavage site)、胶原酶切割位点(collagenase cleavage site)及烟草蚀纹病毒蛋白酶切割位点(TEV proteasecleavage site)，但不限于此。
根据本发明的优选实例，上述蛋白质水解切割位点为被胰蛋白酶切割的胰蛋白酶切割位点。
胰蛋白酶作为紧邻赖氨酸(Lysine)或精氨酸(Arginine)切割的蛋白水解酶，上述蛋白质水解切割位点可选自由K及R组成的组中。
上述蛋白质水解切割位点可直接或通过连接肽与条形码序列相连接，可通过本技术领域中公知的各种连接肽连接，优选使用甘氨酸(Glycine)。
根据本发明的一实施例，选定G作为连接肽，这是因为，若P位于K旁，则无法完美实现胰蛋白酶切割，在作为酸性残基(Acidic residue)的D及E的情况下，因水解速度被抑制而产生漏切割(misscleavage)，因此，P、D及E并不适合，通过除去用于条形码序列的L、P、A、W、Y、T、S、E及D来考虑稳定的切割。
根据本发明的优选实例，上述连接肽包含1个以上的G。
根据本发明的优选实例，包含信号肽标签的多肽还包含亲和标签(Affinitytag)，位于上述条形码序列末端，用于在宿主细胞培养液中分离并纯化条形码序列。
在本说明书中，术语“亲和标签”或“Affinity tag”是指与感兴趣的分子(molecule of interest)相结合，并且利用亲和标签受体(affinity tag receptor)分离并纯化感兴趣的分子(例如，条形码序列)的标签，可将本技术领域中公知的各种亲和标签用于本发明的实现。
上述亲和标签可选自由His标签(His-tag，Histidine tag(组氨酸标签))、myc标签(myc-tag)、FLAG标签(FLAG-tag)、SUMO标签(SUMO-tag，small ubiquitin-likemodifier tag(小分子泛素样修饰物标签))、CYD标签(CYD-tag，covalent yetdissociable NorpD peptide tag)、HPC标签(HPC-tag，heavy chain of protein C tag)、CBP标签(CBP-tag，calmodulin binding peptide tag(钙调蛋白结合肽标签))及HA标签(HA-tag，hemagglutinin-tag(血凝素标签))组成的组中，优选为由2个至15个氨基酸组成的His标签。
并且，本发明的信号肽标签可由以下式1表示：
式1
胰蛋白酶切割位点-连接肽-条形码序列-连接肽-亲和标签-胰蛋白酶切割位点。
并且，本发明的信号肽标签可由以下式2表示：
式2
赖氨酸(Lysine)或精氨酸(Arginine)-甘氨酸(Glycine)-条形码序列-甘氨酸(Glycine)-亲和标签-赖氨酸(Lysine)或精氨酸(Arginine)。
更优选地，本发明的信号肽标签可由以下式3表示：
式3
赖氨酸(Lysine)-甘氨酸(Glycine)-条形码序列-甘氨酸(Glycine)-亲和标签-精氨酸(Arginine)。
当作为胰蛋白酶切割位点的R(精氨酸)***于肽的C末端时，可确保肽电离稳定性。
根据本发明的一实施例，在作为亲和标签的His tag的情况下，因末端H存在电荷变化的隐患而在C末端***用于确保电离稳定性的R(精氨酸)。除此之外，在通过内标(internal standard)合成同位素标记肽(isotope labeled peptide)的过程中也使用R(精氨酸)，以确保定量(参考：合成15N、13C标记的精氨酸残基)。
根据本发明的优选实例，包含上述信号肽标签的多肽在信号肽标签的N末端(前端)结合有靶蛋白。
根据本发明的优选实例，包含上述信号肽标签的多肽在上述靶蛋白的N末端(前端)结合有信号肽。
根据本发明的再一方面，本发明提供的载体包含编码多肽的核酸分子，上述多肽包含信号肽标签。
本发明的核酸分子可以为分离的或重组的，包含单链和双链的DNA和RNA及与此相对应的互补序列。在天然生成来源中分离的核酸的情况下，“分离的核酸”是指从存在于核酸分离的个体基因组的周围遗传序列中分离的核酸。在从模板酶促或化学合成的核酸，例如PCR产物、cDNA分子或寡核苷酸的情况下，通过这种步骤生成的核酸可被理解为分离的核酸分子。分离的核酸分子表示呈单独片段形式或作为较大的核酸构建体的组分的核酸分子。当核酸与其他核酸序列配置成功能关系时，它是“可操作地连接”的。例如，当前序列或分泌前导(leader)的DNA被表达成作为分泌多肽之前形态的前蛋白(preprotein)时，可操作地连接到多肽的DNA，当启动子或增强子影响多肽序列的转录时，可操作地连接到编码序列，或者，当核糖体结合位点被配置成促进翻译时，可操作地连接到编码序列。通常，“可操作地连接”是指待连接的DNA序列相邻定位，在分泌前导的情况下，是指相邻存在于相同前导框架内。然而，增强子无需相邻定位。连接是在便利的限制酶位点通过连接来实现的。若不存在这种位点，则通过常规方法使用合成寡核苷酸接头或连接肽。
在本说明书中，术语“载体”是指为了导入能够复制核酸序列的细胞而能够使核酸序列***的载体。核酸序列可以为外源(exogenous)或异源(heterologous)。作为载体，可例举出质粒、粘粒和病毒(例如噬菌体)，但不限于此。本技术领域的普通技术人员可通过标准重组技术构建载体(Maniatis，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1988；及Ausubel et al.，In:CurrentProtocols in Molecular Biology，John，Wiley&Sons，Inc，NY，1994等)。
在本说明书中，术语“表达载体”是指包含能够对转录基因产物中的至少一部分进行编码的核酸序列的载体。在某些情况下，RNA分子随后被翻译成蛋白质、多肽或肽。表达载体可包含各种调控序列。除了用于调节转录及翻译的调控序列之外，载体及表达载体还可包含提供其他功能的核酸序列。
如上所述，信号肽标签包含按照信号肽以特定氨基酸加密编码的条形码序列，将对包含信号肽标签的多肽进行编码的核酸序列以“信号肽-靶蛋白-信号肽标签”形式制备并***于载体后，可使得其在适当的宿主细胞中表达。在此情况下，若上述信号肽向宿主细胞的细胞膜有效分泌“靶蛋白-信号肽标签”，则可通过确认信号肽标签内的条形码序列来轻易确认有效分泌上述靶蛋白的信号肽类型。
根据本发明的另一方面，本发明提供筛选方法，用于筛选通过在宿主细胞中表达靶蛋白来将靶蛋白有效分泌到宿主细胞外的特定信号肽，其包括如下步骤：
步骤1)，为各种信号肽制备载体来构建文库；
步骤2)，利用上述载体转化宿主细胞；
步骤3)，从转化的上述宿主细胞中表达包含信号肽标签的多肽；以及
步骤4)，对包含分泌到转化的上述宿主细胞外的信号肽标签的多肽、信号肽标签或信号肽标签所包含的条形码序列进行定量。
在本说明书中，术语“宿主细胞”是指包含真核生物及原核生物，并且能够复制上述载体或能够表达由载体编码的基因的任何可转化生物。
在本说明书中，术语“转化”以包含转染(transfection)、转导(transduction)或转化(transformation)的含义来使用。宿主细胞可被上述载体转染(transfected)、转导(transduced)或转化(transformed)，这意味着外源的核酸分子递送或导入宿主细胞中的过程。
优选地，本发明的宿主细胞可以为细菌(bacteria)细胞、酵母菌(yeast)、动物(CHO细胞等)或人类细胞(HeLa细胞、HEK293细胞、BHK细胞、COS7细胞、COP5细胞、A549细胞、NIH3T3细胞、MDCK细胞、WI38细胞等)，但不限于此。
根据本发明的优选实例，本发明的步骤3)(从转化的上述宿主细胞中表达包含信号肽标签的多肽)还可包括步骤3-1)，表达包含信号肽标签的多肽后，利用亲和标签进行分离及纯化。
并且，上述步骤3)还包括步骤3-2)，用胰蛋白酶处理包含上述信号肽标签的多肽，可通过胰蛋白酶切割有效分离靶蛋白和条形码序列。
在执行步骤3)之后，上述步骤3-1)及步骤3-2)可单独执行或按照顺序或相反的顺序执行。
上述步骤4)中对包含信号肽标签的多肽、信号肽标签或信号肽标签所包含的条形码序列进行定量的方法有蛋白质芯片分析、免疫测定法、配体结合试验、基质解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF，Matrix Desorption/Ionization Time of Flight MassSpectrometry)分析、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF，SulfaceEnhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)分析、放射免疫分析(RIA，radioimmunoassay)、放射免疫扩散(radioimmunodiffusion)、双向免疫扩散法、火箭免疫电泳、免疫组织化学(immunohistochemistry)分析、免疫细胞化学(immunocytochemistry)分析、免疫沉淀(immunoprecipitation)、补体结合分析法、二维电泳分析、液相色谱-质谱(LCMS，liquid chromatography-Mass Spectrometry)分析、液相色谱串联质谱联用法(LC-MS/MS，liquid chromatography-Mass Spectrometry/MassSpectrometry)、蛋白质印迹法(westernblot)及酶联免疫吸附试验(ELISA，enzyme linkedimmunosorbentassay)等，但不限于此。
根据本发明的一实施例，在对包含信号肽标签的多肽、信号肽标签或信号肽标签所包含的条形码序列进行定量的方法中，比较通过蛋白质印迹法定量的情况与通过液相色谱串联质谱联用法超高速定量的情况。在此情况下，即使利用上述条形码序列并通过液相色谱串联质谱联用法超高速定量，表达量最高的3种信号肽与通过蛋白质印迹法进行定量的情况相同，从而验证利用液相色谱串联质谱联用法超高速定量的效用性。
当利用液相色谱串联质谱联用法(LC-MS/MS)超高速定量肽时，在最多包含20个氨基酸的情况下，考虑到确保定量层面上的简易性，优选地，上述信号肽标签的长度在总共20个氨基酸以内，更优选地，在以下式1中，连接肽为1个～3个氨基酸，条形码序列为3个～5个氨基酸，亲和标签由2个至10个氨基酸组成，使得总长度在20个氨基酸以内构成，这适合于通过液相色谱串联质谱联用法进行定量。
发明的效果
将本发明的特征及优点概括如下。
第一，本发明提供组合物，该组合物用于在各种信号肽中筛选将靶蛋白有效分泌到细胞外的最佳信号肽。
第二，本发明提供筛选方法，该筛选方法用于筛选通过在宿主细胞中表达靶蛋白来将靶蛋白有效分泌到细胞外的特定信号肽。
第三，若利用本发明的组合物和/或筛选方法，则可通过为每个上述信号肽制备的条形码序列超高速筛选最适合靶蛋白的信号肽，从而可以最大化重组蛋白的生产收率。
附图说明
图1为利用信号肽标签(SP-tag，Signal peptide tag)识别相应信号肽(signalpeptide)的原理的示意图。
图2为示出利用信号肽标签增加蛋白质产量的信号肽筛选方法的示意图。
图3为示出表达信号肽-靶蛋白-信号肽标签的载体的构建例示图。
图4为示出由1200种信号肽和信号肽标签构建文库的例示图。
图5为示出设计信号肽标签的方法的图。
图6为示出分别具有18种氨基酸的18种信号肽标签蛋白质表达纯化结果的图。
图7为示出包含18种氨基酸中的每一个的信号肽标签的相对定量结果的图。
图8为示出利用10种信号肽载体验证文库构建方法的结果图。
图9为示出利用液相色谱串联质谱联用法筛选最佳信号肽的方法的验证实验示意图。
图10为示出对液相色谱串联质谱联用法和蛋白质印迹法(western blot)的实验结果进行比较分析的结果图。
图11为示出通过液相色谱串联质谱联用法和蛋白质印迹法(western blot)的结果来测序信号肽的结果图。
图12为示出9种信号肽标签表达量的液相色谱串联质谱联用法峰(LC-MS/MSpeak)曲线图。
图13为示出利用信号肽标签和液相色谱串联质谱联用法筛选信号肽的结果图。
图14为示出基于峰面积(Peak area)和强度(intensity)的相对定量峰类型的图。
图15为示出筛选的10种信号肽的表格。
图16为示出使用基于试样中不存在的同位素标记肽(isotope labeled peptide)的国际标准肽(EQVTNVGGAVVTGVTAVAQK)校正16个组的多重反应监测(MRM)分析结果的值的图。
图17为示出适合阿柏西普(Aflibercept)表达的信号肽筛选结果的图。
图18为示出通过蛋白质印迹法(western blot)和OCTET来定量比较从液相色谱串联质谱联用法分析结果导出的结构中前24种及后24种个体(individual)表达的结果的图。
图19为示出通过蛋白质印迹法(western blot)和OCTET的分析来获得的二次命中(hit)的信号肽的表格。
具体实施方式
以下，通过实施例进一步详细说明本发明。这些实施例仅用于进一步具体说明本发明，对于本技术领域的普通技术人员显而易见的是，根据本发明的主旨，本发明的范围并不限定于这些实施例。
实施例
实验材料及实验方法
1.用于条形码序列(Barcoding sequence)的氨基酸的选定
为了在液相色谱串联质谱联用法中实现有效且等效的电离及检测，选定用于条形码序列的氨基酸。将标签(tag)融合(fusion)在一种靶蛋白c-末端(terminal)来制备18种克隆(clone)，上述标签分别包含总共20种氨基酸中除去被胰蛋白酶(trypsin)切割的K(赖氨酸)和R(精氨酸)的18种氨基酸中的一个。
利用重叠PCR(SET15-R500，Solgent)创建靶基因并用限制酶AscI(R0558S，NewEngland Biolabs)/XhoI(R0146S，New England Biolabs)处理载体(vector)和基因。将载体和PCR产物与DNA连接混合物(DNA ligation mixture，6023，Takara)进行混合后，在常温条件下进行10分钟的连接反应，随后，转化(transformation)到DH5α(CP010，Enzynomics)并克隆。在FreeStyle 293-F细胞(R79007，ThermoFisher Scientific)中表达18种质粒(plasmid)并经过3天后回收细胞培养液。利用Ni-NTA resin(05893801001，Roche)并通过His亲和层析(His affinity chromatography)分离并纯化存在于细胞培养液的靶蛋白。预处理1ug的18种蛋白质后，通过液相色谱串联质谱联用法进行定量来计算并比较峰面积值。
2.信号肽和信号肽标签载体构建
合成1200种信号肽标签的引物(primer)(Cosmogenetech，Republic of Korea)，并使用重叠PCR(SET15-R500，Solgent)制备信号肽标签基因。用限制酶AscI(R0558S，NewEngland Biolabs)/XhoI(R0146S，New England Biolabs)处理载体(Vector)和PCR产物并进行DNA连接(ligation)(6023，Takara)。将连接混合物(Ligation mixture)转化(transformation)到DH5α(CP010，Enzynomics)并克隆。
3.靶蛋白文库制备协议的验证
用限制酶AscI(R0558S，New England Biolabs)/XhoI(R0146S，New EnglandBiolabs)分别处理具有10种信号肽的10种载体和1种靶蛋白基因，并对10种载体(vector)和***片段(insert)进行DNA连接(6023，Takara)。随后，将连接混合物转化到DH5α(CP010，Enzynomics)来制备微型文库(mini-library)。为了确认微型文库(mini-library)的多样性，通过再次转化(re-transfromation)挑选(picking)100个菌落(colony)来执行测序(sequencing)(Solgent，Republic of Korea)。
4.信号肽筛选验证
分别克隆具有9种信号肽标签的载体和1种靶蛋白基因来制备9种菌落。使9种菌落在FreeStyle 293-F细胞(R79007，ThermoFisher Scientific)中混合或单独表达，经过3天后确保细胞培养液。为了检测存在于细胞培养液中的靶蛋白，使用anti-6x his antibody(ab18184，Abcam)执行蛋白质印迹法。并且，利用Ni-NTA resin(05893801001，Roche)执行His亲和层析来实现预处理后，实施液相色谱串联质谱联用法来获得峰面积值。对蛋白质印迹法结果和液相色谱串联质谱联用法结果进行比较分析。
5.利用多重反应监测(MRM，Multiple reaction monitoring)的定量
多重反应监测通过与具有纳米电子喷雾接口的混合三重四极杆/离子阱质谱仪(6500QTRAP，AB SCIEX，USA)相连接的纳米LC***(nanoACQUITY UPLC System Nano-LC，Waters)执行。在正离子MRM模式下运行上述质谱仪，将Q1 and Q3设置为提供不同的前体/产物离子对。
LC缓冲***如下：流动相A，2％乙腈/0.1％甲酸(Fisher Scientific，Cat#LS118-4)及流动相B，98％乙腈/0.1％甲酸(Fisher Scientific，Cat#LS120-212)。分离肽并以300nl/min的流速在45分钟内以5％至95％B的线性浓度梯度从流动相B中洗脱。总LC分析时间为60分钟，分别使用捕集阱(
Figure GDA0003652604500000141
5μm，180μm×20mm，2G，V/M，Cat#186006527)和分析柱(
Figure GDA0003652604500000142
1.7μm，100μm×100，Cat#186003546)。
代表性的设备设置如下：离子喷雾(IS)电压为2.3kV，接口加热器的温度为300℃，GS1(雾化器气体)设置为15及帘式气体设置为20。通过对各个肽的优化值执行线性回归分析及手动调整来确定去簇电压(DP)及碰撞能量(CE)MS系数。在多重反应监测实验中，对于Q1 and Q3分别以0.2/0.7Da(FWHM)的分辨率、20ms的扫描时间、0.002m/z的扫描宽度执行。当执行多重反应监测时，设置每次转换的扫描时间为20ms、转换扫描之间的间隔为1ms。选择多重反应监测转换来监测最高强度的碎片离子。
6.试样预处理(蛋白质溶液内酵素水解)
为了多重反应监测分析而对蛋白质执行如下处理。通过双环酸(PierceTMBCAProtein Assay Kit，Thermo ScientificTM，23225)分析法对试样蛋白质进行定量。在37℃的温度条件下，用6M的尿素(GE Healthcare，PN 17-1319-01)、50mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、pH8.0(Invitrogen，AM9855G)及30mM的二硫苏糖醇(DTT，Sigma-Aldrich，PND0632-10G)对100μg的蛋白质试样进行60分钟的变性后，在常温的暗室中，用50mM的碘乙酰胺(IAA，Sigma-Aldrich，PN I1149-25G)进行30分钟的烷基化反应。利用50mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、pH8.0将尿素稀释15倍后，以酶与蛋白质浓度为1：50(w/w)的比例添加胰蛋白酶/水稻种子(Promega，PN V0571)并在37℃的温度条件下培养过夜(Overnight)。
通过添加最终浓度为1％的甲酸(SIGMA Aldrich，F0507)来停止胰蛋白酶分解，并从OASIS试剂盒(Waters，PN WAT094225)中去除盐。上述试剂盒在使用前用含有0.1％甲酸的3ml水和3ml甲醇来平衡化。使用后，用3ml的0.1％甲酸清洗后，用1ml的60％ACN、0.1％甲酸进行洗脱。将洗脱的试样在高速真空条件下进行干燥后冷冻。在进行多重反应监测分析前，将试样以0.2μg/μl浓度溶解在0.1％甲酸中来使用。
7.信号肽标签设计
信号肽标签由切割位点、条形码序列、多组氨酸标签组成。可用于信号肽标签的氨基酸至少为14个～20个(在液相色谱质谱联用法分析的情况下，可确保多达20个氨基酸进行定量)，本发明人通过以下方式采用14个氨基酸。为了在维持14个氨基酸的肽长度的同时设计1200种肽质量(peptide mass)值存在差异的肽，具有信号肽标签作用的肽被设计为没有定量差异。
(1)条形码序列选定
①为了多重反应监测分析，蛋白质肽最大长度为20个氨基酸，最小长度为8个氨基酸，不包括胰蛋白酶切割位点的R或K。即，首先，在20种氨基酸除去K及R来选定18种氨基酸。
②随后，通过以下实验从上述18种氨基酸中除去亲水指数(hydropathy index)较高或较低的V、F、G、C、H及N等6种来选定12种氨基酸。首先通过逐个区分氨基酸并通过液相色谱质谱联用法分析来确认表达量是否相同。在通过液相色谱质谱联用法分析V、F、G、C、H及N的情况下，因确认到相对较高或相对较低的值而将其从上述氨基酸中除去(并且，上述H还存在对His tag产生影响的可能性及产生电荷变化的隐患)。
③进一步地，在上述12种氨基酸中排除蛋白质消化(digestion)过程中有可能发生氧化修饰(oxidation modificatio)的M来共选定11种氨基酸。
④最后，在其中排除具有相似质量(Similar Mass)的I、Q、N、L、E及D中的I及Q(N在步骤②中排除)并仅使用L、E及D来最终设计(design)由L、P、A、W、Y、T、S、E及D等9种组成的五位数的条形码序列。
(2)切割位点及多组氨酸标签设计
在切割位点设计中，为了胰蛋白酶切割而在前侧***赖氨酸(K)，为了确保肽电离稳定性和定量而在最后侧***精氨酸(R)。
并且，为了防止发生KP、KD、KE连续序列，在K后方***G，这是因为，若P位于K旁，则无法完美实现胰蛋白酶切割，在作为酸性残基(Acidic residue)的D及E的情况下，因水解速度被抑制而产生漏切割。并且，选定G的理由如下：①首先除去P、D、E，②除去用作条形码序列的L、P、A、W、Y、T、S、E及D，③考虑到稳定的切割位点而选定G。
His tag附有用于仅分离纯化靶蛋白的6×Histidine tag。
实验结果
1.利用信号肽标签(SP-tag)寻找相应信号肽的方法
在细胞中被翻译(translation)的位于蛋白质的N末端(N-terminus)的信号肽在蛋白质分泌层面上起着非常重要的作用。在重组蛋白的生产过程中，可通过嫁接各种信号肽促进细胞外分泌来增加产量。本发明提供用于寻找适合生产蛋白质的最佳信号肽的超高速搜索方法。由于位于蛋白质N末端(N-terminus)的信号肽在细胞中被切割(cleavage)，因此在分泌的蛋白质中并不存在信号肽。取而代之，提供在蛋白质C末端(C-terminus)连接信号肽标签并鉴定其来识别与此相对应的信号肽的方法(图1)。
如图2的示意图所示，增加蛋白质产量的信号肽筛选方法如下：
1)构建靶蛋白文库：通过将靶蛋白克隆到具有各种信号肽和与此相对应的不同分子量的信号肽标签的载体中来构建靶蛋白文库。
2)靶蛋白文库的表达：向动物细胞转染(transfection)靶蛋白文库后，经过数日后收集含有分泌蛋白的细胞培养液。在此情况下，分泌的蛋白质的量因信号肽种类而异，这可通过与各个信号肽相对应的信号肽标签进行区分。
3)增加蛋白质产量的信号肽的筛选：利用液相色谱串联质谱联用法在含有生产的蛋白质的细胞培养液中鉴定各种信号肽标签并实施相对定量。可利用相对定量值对鉴定的信号肽标签进行排序(ranking)并识别相应的信号肽来找到增加蛋白质产量的最佳信号肽。
2.构建具有信号肽及信号肽标签的文库
利用限制酶ASC I-XbaI/NheI在信号肽与信号肽标签之间克隆靶蛋白来制备包含[信号肽-靶蛋白-信号肽标签]形态的载体(图3)。
并且，如图4所示，将与各个信号肽相对应的1200种信号肽标签克隆到具有1200种信号肽的载体中来构建文库。作为用于文库构建的1200种信号肽，使用已知的人分泌蛋白信号肽(表1)。
表1
Figure GDA0003652604500000171
Figure GDA0003652604500000181
Figure GDA0003652604500000191
Figure GDA0003652604500000201
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Figure GDA0003652604500000321
Figure GDA0003652604500000331
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Figure GDA0003652604500000431
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Figure GDA0003652604500000611
构建文库的1200种人信号肽
3.可区分1200种信号肽的信号肽标签设计
信号肽标签被设计成由条形码序列和多组氨酸标签组成，产生1200种以上的多样性(图5)。为了与1200种信号肽一一对应，提供由五位数氨基酸组成的条形码序列。而且，为了确保后续实验的精确度，附上用于仅从细胞培养液中分离纯化靶蛋白的6×Histidinetag。当执行液相色谱串联质谱联用法时，为了进行有效的胰蛋白酶切割(Trypsincleavage)而在两末端***赖氨酸(K)和精氨酸(R)。通过在蛋白质-条形码序列-多组氨酸标签之间***甘氨酸作为连接肽氨基酸来设计。
为了选定用于条形码序列的氨基酸，除了作为胰蛋白酶切割位点的K和R外，确认总共18种氨基酸。对包含18种氨基酸中的每个氨基酸的18种信号肽标签的蛋白质进行表达并纯化(图6)。
通过液相色谱串联质谱联用法识别等量的18种蛋白质来筛选适合相对定量的氨基酸(图7)。利用等量蛋白质的相对定量结果显示，在18种氨基酸中，6种(V、F、G、C、H及N)氨基酸的值相对较高或相对较低，因此，在定量层面上并不适合。由于12种氨基酸(I、L、P、A、W、Y、P、T、S、E、Q及D)的峰面积(Peak area)值相似，因此，并不影响定量。即，与氨基酸种类无关，仅由量即可确定峰面积值，从而判断为适合于相对定量。结果，为了设计条形码序列，第一次筛选出12种氨基酸。
4.设计五位数的条形码序列来构建具有不同分子量的1200种信号肽标签文库
为了在液相色谱串联质谱联用法中进行有效识别，1200种信号肽标签应具有不同的分子量。因此，当设计条形码序列时，使所有序列之间的分子量相差2以上。在筛选的12种氨基酸中，I和L、E及Q、D和N的分子量相同或相差约1，因此排除I、Q及N而仅使用L、E及D。总共利用9种氨基酸(L、P、A、W、Y、T、S、E及D)设计五位数的条形码序列来构建文库(表2)。
表2
Figure GDA0003652604500000621
Figure GDA0003652604500000631
Figure GDA0003652604500000641
Figure GDA0003652604500000651
Figure GDA0003652604500000661
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Figure GDA0003652604500000681
Figure GDA0003652604500000691
Figure GDA0003652604500000701
Figure GDA0003652604500000711
Figure GDA0003652604500000721
Figure GDA0003652604500000731
Figure GDA0003652604500000741
Figure GDA0003652604500000751
Figure GDA0003652604500000761
由五位数氨基酸组成的条形码序列
5.确认有效构建目标文库的方法
由于无法逐一克隆由1200种载体组成的文库，因此，测试有效构建目标文库的方法。将一种靶蛋白克隆到具有10种信号肽的载体中(表3)。在混合状态下对等量的10种载体执行连接-转化-质粒提取(ligation-transformation-plasmid prep)。为了确认信号肽在质粒内的分布，分别在100个菌落中提取质粒来执行对于相应信号肽的测序(表4)。
表3
序号 信号肽 序列
1 肾连蛋白 MDFLLALVLVSSLYLQA
2 神经肽B MARSATLAAAALALCLL
3 神经营养因子-4 MLPLPSCSLPILLLFLL
4 中性粒细胞防御素1 MRTLAILAAILLVALQA
5 催产素 MAGSSLACCLLGLLALT
6 胰腺α淀粉酶 MKFFLLLFTIGFCWAGR
7 聚吡咯 MAAARLCLSLLLLSTCV
8 胃蛋白酶 MKWLLLLGLVALSECGR
9 脑啡肽原A MARFLTLCTWLLLLGPG
10 抵抗素 MKALCLLLLPVLGLLVS
用于文库制备测试的10种信号肽
表4
Figure GDA0003652604500000771
在100个菌落中提取的质粒测序结果
对97个质粒进行测序，10种信号肽标签全部得到确认，确认其分布均匀，占7％～12％(图8)。由此确认到，即使为了有效构建文库而通过混合等量的载体来形成文库，也可构建与信号肽种类无关地维持多样性的文库。
6.验证增加重组蛋白产量的信号肽筛选方法
为了验证通过文库表达并利用液相色谱串联质谱联用法定量的方法的效用性，与通过单独表达并利用蛋白质印迹定量的方法进行比较(图9)。将***靶蛋白的9种信号肽/信号肽标签克隆混合并转染到动物细胞中后，经过数日后利用液相色谱串联质谱联用法对分泌到细胞培养液的信号肽标签蛋白进行相对定量并排序。与此同时，将9种信号肽标签载体单独转染到9个不同的烧瓶后，经过数日后用蛋白质印迹确认分泌到细胞培养液的信号肽标签蛋白的表达并相对比较表达量(图10)。
利用文库表达方式的液相色谱串联质谱联用法结果显示，在峰曲线图中，8号、1号及5号表现出最高的表达量，3号及6号紧随其后(图10至图12)。2号、4号、7号及9号因显著低下的表达量而无法测序。而且，通过单独表达来执行蛋白质印迹的结果显示，1号、8号及5号的表达量为前三位，依次测量7号、6号、9号、4号、3号及2号(图10及图11)。本发明的目的在于筛选最能增加蛋白质产量的信号肽，因此，鉴于上述两种实验中的前三位的结果一致，确认到利用信号肽标签文库的信号肽筛选方法的效用性。
7.利用信号肽标签的最佳信号肽筛选测试
通过将靶蛋白人血管内皮生长因子(hVEGF，human vascular endothelialgrowth factor)克隆到包含信号肽/信号肽标签的文库来构建靶蛋白文库。使该文库在HEK293细胞中表达，经过3天后，收集细胞培养液并利用多组氨酸标签对表达的蛋白质进行分离纯化。用胰蛋白酶处理蛋白质试样后，使用液相色谱串联质谱联用法计算峰面积值并对信号肽标签进行相对定量(图13)。
观察液相色谱串联质谱联用法结果的峰曲线图，可确认表达的高低、锐度(sharpness)、噪音(noise)强度根据表达高低存在明显差异(图14)。具有高表达量的信号肽标签明显区分为单峰(single peak)，相反，具有低表达量的信号肽标签无法与噪音信号进行区分。在图13中，可以筛选与确认到高表达量的10种信号肽标签相对应的信号肽(图15)。
8.合成用于信号肽标签定量的标准肽
为了开发用于筛选1200种信号肽的多重反应监测分析法，合成使用基于1200个条形码序列的内标合成同位素标记肽(合成15N、13C标记的精氨酸残基)(JPT PeptideTechnologies，柏林，德国)。在进行多重反应监测分析前，将1200个标准肽(内标)以100fmol/μl浓度添加于蛋白质表达混合物来使用，在进行多重反应监测分析的过程中，通过保留时间(RT，retention time)准确区分非特异峰(non-specific peak)和靶峰(targetpeak)。并且，为了最大限度地减少分析各个组时产生的误差，合成基于内标合成同位素标记肽(合成15N、13C标记的精氨酸残基)的国际标准肽(EQVTNVGGAVVTGVTAVAQK)。国际标准肽使用不存在于试样的肽序列，并且，在进行多重反应监测分析前，以50fmol/μl浓度添加于蛋白质表达混合物来使用。
表5
Figure GDA0003652604500000791
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Figure GDA0003652604500000951
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Figure GDA0003652604500000971
Figure GDA0003652604500000981
Figure GDA0003652604500000991
化学合成的信号肽标签肽列表
10.利用阿柏西普目标文库增加产量的信号肽筛选
将阿柏西普作为模型靶蛋白克隆到包含信号肽/信号标签的文库来构建靶蛋白文库。使该文库在HEK293细胞中表达，经过3天后，收集细胞培养液并利用多组氨酸标签对表达的蛋白质进行分离纯化。用胰蛋白酶处理蛋白质试样后，利用液相色谱串联质谱联用法计算峰面积值并对信号肽标签进行相对定量。为了有效分析用于信号肽筛选而设计的1200个条形码肽和合成的1200个(总共2400个肽)标准肽，通过总共分成16个组(每组150个靶蛋白)来进行多重反应监测分析。各个组(150个靶蛋白)由75个条形码肽和75和标准肽组成。并且，为了最大限度地减少16个组之间的差异而一并分析国际标准肽来进行用于减少各组之间差异的标准化(normalization)(图16)。确认16个组的***稳定性的结果显示，变异系数(CV，coefficient of variation)稳定在17.26％(图16)。通过液相色谱串联质谱联用法分别对16个组(条形码肽&标准肽：2400个)进行分析并通过曲线图显示基于国际标准校正的峰面积值，将具有高值的峰选定为一次命中(hit)(图17)。为了验证筛选***并筛选二次命中，单独表达(individualexpression)与前24种和后24种相对应的质粒并通过蛋白质印迹比较其表达量(图18)。相对于定量分析，使用OCTET设备对单独表达的试样进行定量来进行双重比较(图18)。由此，筛选出分别与确认到高表达量的14种信号肽标签相匹配的14种信号肽(图19)。
以上，虽然详细说明了本发明的特定部分，但是，本技术领域的普通技术人员应当理解的是，这种具体说明的技术仅为优选实例，本发明的范围不限于此。因此，本发明的实际范围应基于发明要求保护范围与其等同技术方案加以定义。
<110> 五松尖端医疗产业振兴财团
忠南大学校产学协力团
<120> 导入用于提高蛋白质生产性的单个条形码***的信号肽超高速筛选方法
<130> HP9504
<150> KR 10-2019-0108722
<151> 2019-09-03
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Barcoding Sequence 3
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)
<223> 1st Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu
or Asp
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)
<223> 2nd Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu
or Asp
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)
<223> 3rd Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu
or Asp
<400> 1
Leu Leu Leu
1
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Barcoding Sequence 4
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)
<223> 1st Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu
or Asp
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)
<223> 2nd Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu
or Asp
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)
<223> 3rd Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu
or Asp
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)
<223> 4th Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu
or Asp
<400> 2
Leu Leu Leu Leu
1
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Barcoding Sequence 5
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)
<223> 1st Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu
or Asp
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)
<223> 2nd Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu
or Asp
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)
<223> 3rd Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu
or Asp
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)
<223> 4th Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu
or Asp
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)
<223> 5th Leu may be substituted with Pro, Ala, Trp, Tyr, Thr, Ser, Glu
or Asp
<400> 3
Leu Leu Leu Leu Leu
1 5

Claims (20)

1.一种组合物，用于在各种信号肽中筛选将靶蛋白有效分泌到宿主细胞外的特定信号肽，其特征在于，
上述组合物包含含有信号肽标签的多肽或编码上述多肽的核酸分子，
上述信号肽标签包含由每个信号肽的条形码互不相同的3个以上的氨基酸组成的条形码序列，
上述3个以上的氨基酸选自由亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸及天冬氨酸组成的组中。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，上述信号肽标签还包含蛋白质水解切割位点，上述蛋白质水解切割位点位于上述条形码序列的N末端，使得条形码序列能够被蛋白质切割。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，上述蛋白质水解切割位点选自由胰蛋白酶切割位点、凝血酶切割位点、肠激酶切割位点、因子Xa切割位点、胶原酶切割位点及烟草蚀纹病毒蛋白酶切割位点组成的组中。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，上述蛋白质水解切割位点为胰蛋白酶切割位点。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，上述胰蛋白酶切割位点选自由赖氨酸及精氨酸组成的组中。
6.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，上述蛋白质水解切割位点通过连接肽与条形码序列相连接。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，上述连接肽包含一个以上的甘氨酸。
8.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，包含上述信号肽标签的多肽在上述条形码序列的C末端还包含亲和标签，上述亲和标签用于在宿主细胞培养液中分离及纯化条形码序列。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，上述亲和标签选自由His标签、myc标签、FLAG标签、SUMO标签、CYD标签、HPC标签、CBP标签及HA标签组成的组中。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，上述亲和标签为由2个至15个组氨酸组成的His标签。
11.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，上述信号肽标签由以下式1表示：
式1：胰蛋白酶切割位点-连接肽-条形码序列-连接肽-亲和标签-胰蛋白酶切割位点。
12.根据权利要求11所述的组合物，其特征在于，上述信号肽标签由以下式2表示：
式2：赖氨酸或精氨酸-甘氨酸-条形码序列-甘氨酸-亲和标签-赖氨酸或精氨酸。
13.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，在包含上述信号肽标签的多肽中，靶蛋白结合在信号肽标签的N末端。
14.根据权利要求13所述的组合物，其特征在于，在包含上述信号肽标签的多肽中，信号肽结合在上述靶蛋白的N末端。
15.一种载体，其特征在于，包含编码多肽的核酸分子，上述多肽包含根据权利要求1至14中任一项所述的信号肽标签。
16.一种筛选方法，用于筛选通过在宿主细胞中表达靶蛋白来将上述靶蛋白分泌到宿主细胞外的特定信号肽，其特征在于，包括：
步骤1)，为各种信号肽制备根据权利要求15所述的载体来构建文库；
步骤2)，利用上述载体转化宿主细胞；
步骤3)，从转化的上述宿主细胞中表达包含信号肽标签的多肽；以及
步骤4)，对包含分泌到转化的上述宿主细胞外的信号肽标签的多肽、信号肽标签或信号肽标签所包含的条形码序列进行定量。
17.根据权利要求16所述的筛选方法，其特征在于，上述宿主细胞选自由CHO细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、BHK细胞、COS7细胞、COP5细胞、A549细胞、NIH3T3细胞、MDCK细胞及WI38细胞组成的组中。
18.根据权利要求16所述的筛选方法，其特征在于，上述步骤3)还包括步骤3-1)，表达包含信号肽标签的多肽后，利用亲和标签进行分离及纯化。
19.根据权利要求16所述的筛选方法，其特征在于，上述步骤3)还包括步骤3-2)，用胰蛋白酶处理包含上述信号肽标签的多肽。
20.根据权利要求16所述的筛选方法，其特征在于，在上述步骤4)中，利用液相色谱串联质谱联用法进行定量。
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