CN107058200A - 制备l‑抗坏血酸‑2‑葡萄糖苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株制备L‑抗坏血酸‑2‑葡萄糖苷的方法。重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株的保藏号为：CCTCC M 2016496，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。本发明采用基因重组和定点突变技术，构建重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株。以发酵所得菌体细胞为生物催化剂，在柠檬酸三钠缓冲液体系中，以蔗糖和L‑抗坏血酸为原料制备AA‑2G。本发明直接采用蔗糖为糖基供体，原料易溶于水，而且价廉易得。同时产物单一，反应产物主要为AA‑2G，收率高达65%，不需额外添加糖化酶处理，生产成本低。

Description

制备L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的方法

（一）技术领域

本发明涉及生物催化剂制备L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的技术领域，具体涉及一种制备L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的方法。

（二）背景技术

L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷,即2-O-α-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗坏血酸（2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbid acid，AA-2G），是由日本林原生物化学研究所与冈山大学药学系年共同发现的一种的L-抗坏血酸（即维生素C）的葡萄糖苷衍生物（J. Biochem. 107,222-227 (1990)；Agric. Biol. Chem., 54 (7),1697-1703（1990）；US5084563（1992））。它具有抗坏血酸的生理活性，同时由于L-抗坏血酸的2位C上的羟基以α-1，4糖苷键与葡萄糖相连接形成稳定的稳定的糖苷键，显著降低L-抗坏血酸的还原性，稳定性大大提高。目前，AA-2G主要应用于化妆品行业，具有抗UV、抑制黑色素等美白功效作用。

日本学者最早发现AA-2G时，是采用来源于根霉属或毛霉属的a-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.20，α-Glucosidase）作为催化剂剂，但是AA-2G产物浓度极低，后来发现使用源自嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）的环麦芽糊精葡聚糖转移酶（EC2.4.1.19，Cyclomaltodextrin Glucanotransferase，简称CGTase）作为催化剂，以环糊精和L-抗坏血酸为原料制备AA-2G，转化率提高至45%（Agric. Biol. Chem., 55 (7), 1751-1756, 1991）。后来陆续报道一些其他糖基转移酶也能以相应糖基供体（如麦芽糖、低聚糊精、淀粉等）和L-抗坏血酸及钠盐为原料来生物催化合成AA-2G。所以，目前所报道的AA-2G生物催化用酶主要有α-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.20，α-Glucosidase）（US3763009（1973））、环麦芽糊精葡聚糖转移酶（EC 2.4.1.19，Cyclomaltodextrin Glucanotransferase，简称CGTase）（US5084563（1992）、US5137723（1992）、和US5407812（1995）、US9265781B2（2016））、α-淀粉酶（EC 3.2.1.1，α-Amylase）、蔗糖磷酸化酶（EC 2.4.1.7，Sucrose phosphorylas）（Biotechnol Lett29:611–615，2007）、葡聚糖蔗糖酶（EC 2.4.1.5，Dextransucrase）（Microbiological Research 165：384-391，2010）、α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶（US20060216792（2006）、US8759030（2014）和CN201510179664（2015））等6类酶。

目前AA-2G工业化生产上采用CGTase为生物催化剂，但是采用路线还存在以下不足之处：

一是生产所用的CGTase酶为商业化酶制剂，而不是采用最为直接的CGTase发酵液或者含CGTase酶 的菌体细胞，究其原因是目前CGTase发酵酶活力普遍不高，酶活力低无法满足制备AA-2G的酶活要求；另外，若采用CGTase发酵液或菌体为催化剂，则需要经菌体破碎、浓缩等操作步骤达到制备AA-2G的酶活要求。

二是除生成目标产物AA-2G外，还会生成一系列的二糖、三糖、四糖以及五糖等多糖基衍生物，还需额外添加a-糖化酶进行水解多糖基衍生物转化成目标产物AA-2G，增加工艺步骤。

三是糖基供体环糊***溶性差、价格高等缺陷，不利于转化，原料成本高。

四是生成10%左右的AA-5G（5-O-α-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗坏血酸）和AA-6G（6-O-α-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗坏血酸）混合副产物（US5272136（1993），US5468850（1995）），不利于后续分离纯化。尽管后来美国专利US20060216792（2006）和US8759030（2014）报道了为了避免CGTase催化反应中形成AA-5G和AA-6G副产物，采用来源于球状节杆菌（Arthrobacter globiformis A19）α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶为催化剂制备AA-2G，但酶源不易获得。

基于上述存在不足之处，我们使用蔗糖磷酸酶作为生物催化剂来制备AA-2G，因为采用蔗糖磷酸酶作为催化剂，有以下优势潜力：

一是蔗糖磷酸化酶（SPase）分布广泛，存在于绝大多数细菌等微生物中，发酵酶活高，不需采用商业用酶制剂或者菌体破壁、浓缩处理，可以直接使用发酵液或菌体作为生物催化剂。

二是蔗糖磷酸化酶采用蔗糖为糖基供体，原料易溶于水，而且价廉易得。

三是产物单一，反应产物主要为AA-2G和果糖，不需额外添加糖化酶处理。

四是反应条件温和，反应温度为30-37℃，热能耗较低。

（三）发明内容

本发明基于目前AA-2G工业化生产上存在的不足之处，以及目前所报道的采用蔗糖磷酸化酶制备AA-2G的不成熟现况，提供了一种制备L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的方法，其采用定点突变技术，构建新的蔗糖磷酸化酶高产工程菌株，采用该重组工程菌株生物催化制备AA-2G，产物单一，收率高，不需额外添加糖化酶处理，生产成本低。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株，其特殊之处在于：重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株的保藏号为：CCTCC M 2016496，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。

蔗糖磷酸化酶DNA人工序列：

TAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCAGCAGCCATCA 50

TCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTA 100

GCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGAAAAACAAAGT 150

GCAGCTCATCACATACGCCGATCGTCTCGGCGATGGCACTCTTAGCTCGA 200

TGACCGACATCCTGCGCACCCGCTTCGACGGCGTGTATGACGGCGTGCAT 250

ATCCTGCCGTTCTTCACTCCGTTCGATGGTGCGGATGCAGGCTTCGACCC 300

GATCGACCATACCAAAGTCGACGAACGTCTCGGCAGCTGGGACGACGTC 350

GCCGAACTCTCCAAGACCCACAACATCATGGTCGACGCCATCGTCAACCA 400

CATGAGTTGGGAATCCAAGCAGTTCCAAGACGTGCTTGAAAAAGGTGAG 450

GAATCCGAGTATTACCCGATGTTCCTGACCATGAGCTCCGTCTTCCCGAA 500

CGGCGCCACCGAAGAAGACCTGGCCGGCATCTACCGCCCGCGCCCGGGC 550

CTGCCGTTCACCCACTACAAGTTCGCCGGCAAGACGCGCTTGGTCTGGGT 600

GAGCTTCACCCCGCAGCAGGTGGACATCGACACTGATTCCGCCAAGGGTT 650

GGGAATACCTGATGTCGATCTTCGATCAGATGGCCGCCAGCCACGTGCGC 700

TACATCCGTCTCGACGCCGTGGGCTACGGCGCCAAGGAAGCCGGCACCA 750

GCTGCTTCATGACCCCCAAGACCTTTAAGCTCATCTCCCGTCTGCGCGAG 800

GAGGGCGTCAAGCGCGGCCTTGAAATCCTCATCGAGGTTCACAGCTACTA 850

CAAGAAGCAGGTGGAAATCGCCTCCAAGGTGGACCGCGTCTACGATTTC 900

GCCCTGCCGCCGCTGCTTCTGCACTCGCTGTTCACCGGTCACGTCGAACC 950

CGTGGCCCACTGGACCGAGATCCGCCCGAACAACGCCGTCACCGTGCTC 1000

GATACGCACGATGGCATCGGCGTGATCGACATCGGCTCCGACCAGCTCG 1050

ACCGCTCCCTCAAGGGCCTCGTGCCCGACGAGGACGTCGACAACCTGGTC 1100

AACACCATCCATGCCAACACCCACGGCGAATCCCAGGCCGCCACCGGTG 1150

CCGCCGCGTCCAACCTCGACCTCTACCAGGTCAACTCCACGTACTACTCG 1200

GCCCTCGGCTGCAACGACCAGCACTACTTGGCCGCCCGCGCCGTGCAGTT 1250

CTTCCTGCCGGGCGTGCCGCAGGTCTACTACGTGGGCGCGCTCGCCGGCC 1300

GCAACGACATGGAACTGCTGCGCCGCACCAACAACGGCCGCGACATCAA 1350

CCGCCACTACTACTCCACCGCCGAAATCGATGAAAACCTCGAACGCCCG 1400

GTGGTCAAGGCCCTGAACGCCCTGGCCAAGTTCCGCAACGAACTGCCTGC 1450

ATTCGATGGCGAGTTCAGCTACGAGGTCGATGGCGACACGTCCATCACCT 1500

TCCGCTGGACCGCCGCCGACGGCACGTCCACGGCCGCCCTCACCTTCGAG 1550

CCCGGACGCGGCCTCGGCACAGACAACGCCACCCCGGTTGCCAGCCTTGC 1600

CTGGAGCGATGCCGCCGGCGACCACGAAACCCGCGATCTGCTCGCCAACC 1650

CGCCGATTGCCGATATCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCAC 1700

CACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAA 1738。

蔗糖磷酸化酶PRT序列：

MKNKVQLITY ADRLGDGTLS SMTDILRTRF DGVYDGVHIL PFFTPFDGAD AGFDPIDHTKVDERLGSWDD VAELSKTHNI MVDAIVNHMS WESKQFQDVL 100

EKGEESEYYP MFLTMSSVFP NGATEEDLAG IYRPRPGLPF THYKFAGKTR LVWVSFTPQQVDIDTDSAKG WEYLMSIFDQ MAASHVRYIR LDAVGYGAKE 200

AGTSCFMTPK TFKLISRLRE EGVKRGLEIL IEVHSYYKKQ VEIASKVDRV YDFALPPLLLHSLFTGHVEP VAHWTEIRPN NAVTVLDTHD GIGVIDIGSD 300

QLDRSLKGLV PDEDVDNLVN TIHANTHGES QAATGAAASN LDLYQVNSTY YSALGCNDQHYLAARAVQFF LPGVPQVYYV GALAGRNDME LLRRTNNGRD 400

INRHYYSTAE IDENLERPVV KALNALAKFR NELPAFDGEF SYEVDGDTSI TFRWTAADGTSTAALTFEPG RGLGTDNATP VASLAWSDAA GDHETRDLLA 500

NPPIADID 508。

一种重组蔗糖磷酸化酶的大肠菌株工程菌株制备L-抗坏血酸葡萄糖苷（AA-2G）的方法，采用以下步骤：

A、将源自长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶编码基因进行克隆表达，构建重组蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，采用以下步骤：

A1、蔗糖磷酸化酶克隆菌株的构建，包括以下步骤：

A1.1、将冻存的长双歧杆菌进行复苏培养传代2次，以该菌液为DNA模板，并以NCBI上长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶基因序列为模板设计一对引物，然后进行PCR、琼脂凝胶分离纯化回收获得目标基因DNA片段。

A1.2、将获得的目标基因DNA片段和pet 28a(+)质粒构建双酶切反应体系，经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，再经凝胶回收，最后经DNA连接构建重组质粒。

A1.3、将将构建重组质粒转化到大肠杆菌Trans5α感受态细胞中形成转化克隆菌株pet28 a(+)-spase，再经验证获得目标重组质粒。

A2、蔗糖磷酸化酶表达菌株的构建，包括以下步骤：

A2.1、将含目标重组质粒的阳性克隆菌株于LB培养基中进行培养，再经提取获得目标重组质粒。

A2.2、将提取获得的目标重组质粒与感受态的大肠杆菌BL21(DE3)表达载体进行转化，经平板分离获得克隆菌落，再经PCR验证获得目标蔗糖磷酸化酶表达菌株pet28 a(+)-spase-BL21(DE3)，

A3、采用PCR定点突变技术，其步骤包括突变位点氨基酸的突变引物设计，然后进行突变质粒克隆菌株的构建、突变质粒表达菌株的构建，再经PCR验证获得定点突变阳性表达菌株，该菌株于2016年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2016496，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072，名称为大肠杆菌pct28a（+）-spase，Escherichia coli pet28a（+）-spase。

B、将采用重组蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌工程菌株进行发酵生产所得蔗糖磷酸化酶为生物催化剂，以蔗糖为糖基供体，L-抗坏血酸为糖基受体，进行生物催化制备AA-2G，采用以下步骤：

B1、将获得重组蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌工程菌株接入种子培养基进行培养，然后转接入诱导培养基进行蔗糖磷酸化酶发酵生产获得含重组蔗糖磷酸化酶的催化剂。

B2、将含重组蔗糖磷酸化酶的催化剂与缓冲液进行混合，然后加入蔗糖和L-抗坏血酸原料，再调节反应体系pH值，最后在一定转化温度下进行生物催化合成AA-2G。

进一步：

步骤A1蔗糖磷酸化酶克隆菌株构建中：

将冻存的长双歧杆菌进行复苏培养传代n次，以该菌液为DNA模板，以NCBI上长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶基因序列为模板设计一对引物：

正向引物(spase-bam-F):

5’ CGCGGATCCATGAAAAACAAAGTGCAGCTCATC 3’

反向引物(spase-hind-R):

5’ CCCAAGCTTGTCGATATCGGCAATCGG 3’

然后进行PCR反应，反应条件为：92-98℃预变性0.5-2min，然后20-40个循环（92-98℃5-15S，49℃～64℃10-15S，68-75℃18-25S），68-75℃再延伸3-7min；

PCR反应完毕后，经进行凝胶回收、验证和纯化PCR反应后的产物以及pet 28a(+)质粒的DNA溶液组成BamHⅠ和HindⅢ双酶切反应体系进行酶切修饰，酶切条件为32-42℃温度下酶切反应2-7min，然后进行回收酶切产物，然后与含DNA连接酶的溶液混合均匀，再10-20℃循环水浴中反应过夜；

DNA过夜连接完毕后，将10μl连接产物全部加入45-55μl刚融化的大肠杆菌Trans5α感受态细胞中，混匀后置于冰上冰浴20-50min；然后将其快速转移至恒温水浴锅中，35-45℃热激80-95sec；随后取出转化混合物置于冰上1-3min后，于超净台中加入480-520μl无菌的无抗LB培养基，放至32-42℃、100-300rpm恒温摇床中复苏0.5-2小时；分别取80-120μl复苏后的菌液均匀地涂布在两个卡那霉素抗性的LB固体培养基的培养平板上，32-42℃恒温培养10-24h；在转化后的两个平板上各挑单克隆菌落，至1ml卡那抗性的LB液体培养基中，32-42℃、100-300rpm恒温摇5-12h，以该菌液作为PCR模板进行PCR验证，进行验证阳性克隆获得蔗糖磷酸化酶克隆菌株pet28 a(+)-spase；

步骤A2蔗糖磷酸化酶表达菌株pet28 a(+)-spase-BL21(DE3)的构建中，

选取阳性克隆菌液，接种于5ml卡那抗性的LB液体培养基中，32-42℃、100-300rpm恒温摇菌8-20h后提取重组质粒，然后分别取,0.5-1.5μl重组质粒和0.5-1.5μl pet28a(+)质粒加入两管50μl刚融化的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞（购自百捷生物公司）中，混匀后置于冰上冰浴10-25min；随后将其快速转移至恒温水浴锅中，38-45℃热激10-30S，再从恒温水浴锅中取出转化混合物置于冰上1-3min后，于超净台中分别加入480-520μl无菌的无抗LB培养基，放至32-42℃、100-300rpm恒温摇床中复苏30-60min；取180-220μl复苏后的菌液均匀地涂布在含90-110μg/ml的卡那霉素的LB固体培养基培养平板上，32-42℃恒温培养箱中培养8-20h，观察实验组和对照组的培养平板的菌落情况，若pet 28a(+)质粒转化的平板上的菌落生长情况良好则可说明实验操作无误差，挑取实验组平板上的n个单克隆菌落至n个1ml卡那抗性的LB液体培养基中，于32-42℃、100-300rpm恒温摇菌8-20h后进行菌液PCR验证获得阳性表达菌株pet28 a(+)-spase-BL21(DE3)。

步骤B1重组菌株进行摇瓶发酵生产蔗糖磷酸化酶

将pet28 a(+)-spase-BL21(DE3) 表达菌株斜面菌体接入装有50ml种子培养基的500ml三角瓶，种子培养基组成为酵母浸粉1-3%、蛋白胨0.2-0.7%、氯化钠 0.05-0.15%、七水硫酸镁0.002-0.007%、磷酸二氢钾 0.02-0.07%、磷酸氢二钠 0.10-0.20%、蔗糖 0.18-0.32%、氯化钙 0.001-0.003%、7水硫酸锌 0.0005-0.0015%、七水硫酸亚铁 0.001-0.003%。然后在温度28-36℃、转速150-300rpm条件下振荡培养14-25小时至菌液OD600nm达到20～25后，然后按接种比为0.8-1.2%比例接入装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中进行发酵生产蔗糖磷酸化酶。发酵培养基组成为酵母浸粉2.0-4.0%、蛋白胨 0.20-0.30%、氯化钠0.4-0.6%、七水硫酸镁0.005-0.015%、磷酸二氢钾0.20-0.30%、磷酸氢二钠 0.48-0.60%、氯化钙 0.005-0.015%、蔗糖 0.28-0.41%、甘油 0.20-0.30%、乳糖 0.10-0.20%。在发酵温度为28-36℃、转速150-300rpm条件下振荡培养36-52小时，然后通过离心机4000转5-20min离心收集含蔗糖磷酸化酶的菌体浆状物，该浆状物即可作为生物催化剂。

步骤B1重组菌株进行10L罐发酵生产蔗糖磷酸化酶

将pet28 a(+)-spase-BL21(DE3) 表达菌株斜面菌体接入装有300ml种子培养基的2000ml三角瓶，然后在温度28-36℃、转速150-300rpm条件下振荡培养15-35小时至菌液OD600nm达到20～25后，然后按接种比为4-6%比例接入装有6L实施例3所提到发酵培养基的10L罐中进行放大发酵生产蔗糖磷酸化酶。在发酵温度为28-36℃、转速400-600rpm、罐压0.03-0.06MPa、通气量为7-8.5L/（min.L）条件下通气搅拌培养18-28小时，发酵液OD600nm达到35～45，然后开始流加1200ml补料培养基，补料培养基组成为酵母浸粉4.0-6.0%、蛋白胨0.5-1.5%、甘油7-13%、乳糖1.8-3.1%、蔗糖 45-55%、磷酸二氢钾 0.3-0.7%、氯化钙 0.1-0.3%，流加速度75-85ml/min，连续流加10-20小时，调节发酵液至pH4-7.0。流加完毕，继续发酵培养24-35小时后，终止发酵。然后通过离心机4000转5-20min离心收集含蔗糖磷酸化酶的菌体浆状物，该浆状物即可作为生物催化剂。

步骤B2中，所用缓冲体系为柠檬酸三钠缓冲体系，其中，柠檬酸三钠浓度为20～60mM，pH值为4.0～6.5，蔗糖浓度为60～120g/L，L-抗坏血酸浓度15～30g/L。

本发明的有益效果：本发明采用基因重组和定点突变技术，将来自长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶编码基因通过pet28 a(+)质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株（保藏号：CCTCC M 2016496）。以发酵所得菌体细胞为生物催化剂，在柠檬酸三钠缓冲液体系中，以蔗糖和L-抗坏血酸为原料制备AA-2G。本发明直接采用蔗糖为糖基供体，原料易溶于水，而且价廉易得。同时产物单一，反应产物主要为AA-2G，收率高达65%，不需额外添加糖化酶处理，生产成本低。

（四）具体实施方式

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

实施例1、蔗糖磷酸化酶克隆菌株pet28 a(+)-spase的构建

将冻存的长双歧杆菌进行复苏培养传代2次，以该菌液为DNA模板。以NCBI上长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶基因序列为模板设计一对引物：

正向引物(spase-bam-F): 5’ CGCGGATCCATGAAAAACAAAGTGCAGCTCATC 3’

反向引物(spase-hind-R): 5’ CCCAAGCTTGTCGATATCGGCAATCGG 3’

然后进行PCR反应，反应条件：95℃ 预变性1min，然后30个循环（95℃10S，49℃～64℃12S，72℃ 22S），72℃ 再延伸5min。

蔗糖磷酸化酶的定点突变实验采用设计不同的突变引物并进行上述的PCR反应。

PCR反应完毕后，经进行凝胶回收、验证和纯化PCR反应后的产物以及pet 28a(+)质粒的DNA溶液组成BamHⅠ和HindⅢ（购于Takara生物技术有限公司）双酶切反应体系进行酶切修饰，酶切条件为37℃温度下酶切反应5min，然后进行回收酶切产物，然后与含DNA连接酶的溶液混合均匀，再16℃循环水浴中反应过夜。

DNA过夜连接完毕后，将10μl连接产物全部加入50μl刚融化的大肠杆菌Trans5α感受态细胞（购自百捷生物公司）中，混匀后置于冰上冰浴30min；然后将其快速转移至恒温水浴锅中，42℃热激90sec；随后取出转化混合物置于冰上2min后，于超净台中加入500μl无菌的无抗LB培养基，放至37℃、200rpm恒温摇床中复苏1小时；分别取100μl复苏后的菌液均匀地涂布在两个卡那霉素抗性的LB固体培养基的培养平板上，37℃恒温培养16h；在转化后的两个平板上各挑单克隆菌落，至1ml卡那抗性的LB液体培养基中，37℃、200rpm恒温摇8h，以该菌液作为PCR模板进行PCR验证，进行验证阳性克隆获得蔗糖磷酸化酶克隆菌株pet28 a(+)-spase。

实施例2、蔗糖磷酸化酶克隆菌株pet28 a(+)-spase的构建

将冻存的长双歧杆菌进行复苏培养传代2次，以该菌液为DNA模板。以NCBI上长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶基因序列为模板设计一对引物：

正向引物(spase-bam-F): 5’ CGCGGATCCATGAAAAACAAAGTGCAGCTCATC 3’

反向引物(spase-hind-R): 5’ CCCAAGCTTGTCGATATCGGCAATCGG 3’

然后进行PCR反应，反应条件：92℃预变性2min，然后40个循环（92℃10S，49℃～64℃10S ，68℃25S），68℃ 再延伸7min。

蔗糖磷酸化酶的定点突变实验采用设计不同的突变引物并进行上述的PCR反应。

PCR反应完毕后，经进行凝胶回收、验证和纯化PCR反应后的产物以及pet 28a(+)质粒的DNA溶液组成BamHⅠ和HindⅢ（购于Takara生物技术有限公司）双酶切反应体系进行酶切修饰，酶切条件为32℃温度下酶切反应7min，然后进行回收酶切产物，然后与含DNA连接酶的溶液混合均匀，再10℃循环水浴中反应过夜。

DNA过夜连接完毕后，将10μl连接产物全部加入45μl刚融化的大肠杆菌Trans5α感受态细胞（购自百捷生物公司）中，混匀后置于冰上冰浴50min；然后将其快速转移至恒温水浴锅中，35℃热激80sec；随后取出转化混合物置于冰上3min后，于超净台中加入480μl无菌的无抗LB培养基，放至32℃、300rpm恒温摇床中复苏2小时；分别取80μl复苏后的菌液均匀地涂布在两个卡那霉素抗性的LB固体培养基的培养平板上，32℃恒温培养24h；在转化后的两个平板上各挑单克隆菌落，至1ml卡那抗性的LB液体培养基中，32℃、300rpm恒温摇12h，以该菌液作为PCR模板进行PCR验证，进行验证阳性克隆获得蔗糖磷酸化酶克隆菌株pet28a(+)-spase。

实施例3、蔗糖磷酸化酶克隆菌株pet28 a(+)-spase的构建

将冻存的长双歧杆菌进行复苏培养传代2次，以该菌液为DNA模板。以NCBI上长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶基因序列为模板设计一对引物：

正向引物(spase-bam-F): 5’ CGCGGATCCATGAAAAACAAAGTGCAGCTCATC 3’

反向引物(spase-hind-R): 5’ CCCAAGCTTGTCGATATCGGCAATCGG 3’

然后进行PCR反应，反应条件：98℃ 预变性0.5min，然后20个循环（98℃15S，49℃～64℃ 15S，75℃18S），75℃ 再延伸3min。

蔗糖磷酸化酶的定点突变实验采用设计不同的突变引物并进行上述的PCR反应。

PCR反应完毕后，经进行凝胶回收、验证和纯化PCR反应后的产物以及pet 28a(+)质粒的DNA溶液组成BamHⅠ和HindⅢ（购于Takara生物技术有限公司）双酶切反应体系进行酶切修饰，酶切条件为42℃温度下酶切反应2min，然后进行回收酶切产物，然后与含DNA连接酶的溶液混合均匀，再20℃循环水浴中反应过夜。

DNA过夜连接完毕后，将10μl连接产物全部加入55μl刚融化的大肠杆菌Trans5α感受态细胞（购自百捷生物公司）中，混匀后置于冰上冰浴20min；然后将其快速转移至恒温水浴锅中，45℃热激95sec；随后取出转化混合物置于冰上1min后，于超净台中加入520μl无菌的无抗LB培养基，放至42℃、100rpm恒温摇床中复苏0.5小时；分别取120μl复苏后的菌液均匀地涂布在两个卡那霉素抗性的LB固体培养基的培养平板上，42℃恒温培养10h；在转化后的两个平板上各挑单克隆菌落，至1ml卡那抗性的LB液体培养基中，42℃、100rpm恒温摇5h，以该菌液作为PCR模板进行PCR验证，进行验证阳性克隆获得蔗糖磷酸化酶克隆菌株pet28a(+)-spase。

实施例4、蔗糖磷酸化酶表达菌株pet28 a(+)-spase-BL21(DE3)的构建

选取阳性克隆菌液，接种于5ml卡那抗性的LB液体培养基中，37℃、200rpm恒温摇菌14h后提取重组质粒。然后分别取1μl重组质粒和1μl pet28a(+)质粒加入两管50μl刚融化的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞（购自百捷生物公司）中，混匀后置于冰上冰浴15min；随后将其快速转移至恒温水浴锅中，42℃热激20S，再从恒温水浴锅中取出转化混合物置于冰上2min后，于超净台中分别加入500μl无菌的无抗LB培养基，放至37℃、200rpm恒温摇床中复苏45min；取200μl复苏后的菌液均匀地涂布在含100μg/ml的卡那霉素的LB固体培养基培养平板上，37℃恒温培养箱中培养12h。观察实验组和对照组的培养平板的菌落情况，若pet28a(+)质粒转化的平板上的菌落生长情况良好则可说明实验操作无误差。挑取实验组平板上的12个单克隆菌落至12个1ml卡那抗性的LB液体培养基中，于37℃、200rpm恒温摇菌14h后进行菌液PCR验证获得阳性表达菌株pet28 a(+)-spase-BL21(DE3)。

对阳性表达酶蛋白的氨基酸序列进行测定，其氨基酸序列见附录1。

实施例5、蔗糖磷酸化酶表达菌株pet28 a(+)-spase-BL21(DE3)的构建

选取阳性克隆菌液，接种于5ml卡那抗性的LB液体培养基中，32℃、300rpm恒温摇菌20h后提取重组质粒。然后分别取0.5μl重组质粒和0.5μl pet28a(+)质粒加入两管50μl刚融化的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞（购自百捷生物公司）中，混匀后置于冰上冰浴10min；随后将其快速转移至恒温水浴锅中，38℃热激30S，再从恒温水浴锅中取出转化混合物置于冰上3min后，于超净台中分别加入520μl无菌的无抗LB培养基，放至32℃、300rpm恒温摇床中复苏60min；取180μl复苏后的菌液均匀地涂布在含90μg/ml的卡那霉素的LB固体培养基培养平板上，32℃恒温培养箱中培养20h。观察实验组和对照组的培养平板的菌落情况，若pet28a(+)质粒转化的平板上的菌落生长情况良好则可说明实验操作无误差。挑取实验组平板上的12个单克隆菌落至12个1ml卡那抗性的LB液体培养基中，于32℃、300rpm恒温摇菌20h后进行菌液PCR验证获得阳性表达菌株pet28 a(+)-spase-BL21(DE3)。

对阳性表达酶蛋白的氨基酸序列进行测定，其氨基酸序列见附录1。

实施例6、蔗糖磷酸化酶表达菌株pet28 a(+)-spase-BL21(DE3)的构建

选取阳性克隆菌液，接种于5ml卡那抗性的LB液体培养基中，42℃、100rpm恒温摇菌8h后提取重组质粒。然后分别取1.5μl重组质粒和1.5μl pet28a(+)质粒加入两管50μl刚融化的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞（购自百捷生物公司）中，混匀后置于冰上冰浴25min；随后将其快速转移至恒温水浴锅中，45℃热激10S，再从恒温水浴锅中取出转化混合物置于冰上1min后，于超净台中分别加入480μl无菌的无抗LB培养基，放至42℃、100rpm恒温摇床中复苏30min；取220μl复苏后的菌液均匀地涂布在含110μg/ml的卡那霉素的LB固体培养基培养平板上，42℃恒温培养箱中培养8h。观察实验组和对照组的培养平板的菌落情况，若pet28a(+)质粒转化的平板上的菌落生长情况良好则可说明实验操作无误差。挑取实验组平板上的12个单克隆菌落至12个1ml卡那抗性的LB液体培养基中，于42℃、100rpm恒温摇菌14h后进行菌液PCR验证获得阳性表达菌株pet28 a(+)-spase-BL21(DE3)。

对阳性表达酶蛋白的氨基酸序列进行测定，其氨基酸序列见附录1。

实施例7、重组菌株进行摇瓶发酵生产蔗糖磷酸化酶

将pet28 a(+)-spase-BL21(DE3) 表达菌株斜面菌体接入装有50ml种子培养基的500ml三角瓶，种子培养基组成为酵母浸粉2.0%、蛋白胨0.5%、氯化钠 0.1%、七水硫酸镁0.005%、磷酸二氢钾 0.05%、磷酸氢二钠 0.15%、蔗糖 0.25%、氯化钙 0.002%、7水硫酸锌0.001%、七水硫酸亚铁 0.002%。然后在温度32℃、转速220rpm条件下振荡培养20小时至菌液OD600nm达到20～25后，然后按接种比为1%比例接入装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中进行发酵生产蔗糖磷酸化酶。发酵培养基组成为酵母浸粉3.0%、蛋白胨 0.25%、氯化钠0.5%、七水硫酸镁0.01%、磷酸二氢钾 0.25%、磷酸氢二钠 0.54%、氯化钙 0.01%、蔗糖0.35%、甘油 0.25%、乳糖 0.15%。在发酵温度为32℃、转速220rpm条件下振荡培养48小时，然后通过离心机4000转10min离心收集含蔗糖磷酸化酶的菌体浆状物，该浆状物即可作为生物催化剂。

实施例8、重组菌株进行摇瓶发酵生产蔗糖磷酸化酶

将pet28 a(+)-spase-BL21(DE3) 表达菌株斜面菌体接入装有50ml种子培养基的500ml三角瓶，种子培养基组成为酵母浸粉1.0%、蛋白胨0.7%、氯化钠 0.05%、七水硫酸镁0.007%、磷酸二氢钾 0.02%、磷酸氢二钠 0.20%、蔗糖 0.18%、氯化钙 0.003%、7水硫酸锌0.0005%、七水硫酸亚铁 0.003%。然后在温度28℃、转速300rpm条件下振荡培养14小时至菌液OD600nm达到20～25后，然后按接种比为0.8%比例接入装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中进行发酵生产蔗糖磷酸化酶。发酵培养基组成为酵母浸粉2.0%、蛋白胨 0.30%、氯化钠 0.4%、七水硫酸镁0.015%、磷酸二氢钾 0.20%、磷酸氢二钠 0.60%、氯化钙 0.005%、蔗糖0.41%、甘油 0.20%、乳糖 0.20%。在发酵温度为28℃、转速300rpm条件下振荡培养36小时，然后通过离心机4000转20min离心收集含蔗糖磷酸化酶的菌体浆状物，该浆状物即可作为生物催化剂。

实施例9、重组菌株进行摇瓶发酵生产蔗糖磷酸化酶

将pet28 a(+)-spase-BL21(DE3) 表达菌株斜面菌体接入装有50ml种子培养基的500ml三角瓶，种子培养基组成为酵母浸粉3.0%、蛋白胨0.2%、氯化钠 0.15%、七水硫酸镁0.002%、磷酸二氢钾 0.07%、磷酸氢二钠 0.10%、蔗糖 0.32%、氯化钙 0.001%、7水硫酸锌0.0015%、七水硫酸亚铁 0.001%。然后在温度36℃、转速150rpm条件下振荡培养25小时至菌液OD600nm达到20～25后，然后按接种比为1.2%比例接入装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中进行发酵生产蔗糖磷酸化酶。发酵培养基组成为酵母浸粉4.0%、蛋白胨 0.20%、氯化钠 0.6%、七水硫酸镁0.005%、磷酸二氢钾 0.30%、磷酸氢二钠 0.48%、氯化钙 0.015%、蔗糖0.28%、甘油 0.30%、乳糖 0.10%。在发酵温度为36℃、转速150rpm条件下振荡培养52小时，然后通过离心机4000转5min离心收集含蔗糖磷酸化酶的菌体浆状物，该浆状物即可作为生物催化剂。

实施例10、重组菌株进行10L罐发酵生产蔗糖磷酸化酶

将pet28 a(+)-spase-BL21(DE3) 表达菌株斜面菌体接入装有300ml实施例7所提到种子培养基的2000ml三角瓶，然后在温度32℃、转速220rpm条件下振荡培养20小时至菌液OD600nm达到20～25后，然后按接种比为5%比例接入装有6L实施例7所提到发酵培养基的10L罐中进行放大发酵生产蔗糖磷酸化酶。在发酵温度为32℃、转速500rpm、罐压0.05MPa、通气量为7.5L/（min.L）条件下通气搅拌培养24小时，发酵液OD600nm达到35～45，然后开始流加1200ml补料培养基，补料培养基组成为酵母浸粉5.0%、蛋白胨 1.0%、甘油10%、乳糖2.5%、蔗糖 50%、磷酸二氢钾 0.5%、氯化钙 0.2%，流加速度80ml/min，连续流加15小时，流加中通过20%氨水来调节发酵液至pH6.5。流加完毕，继续发酵培养30小时后，终止发酵。然后通过离心机4000转10min离心收集含蔗糖磷酸化酶的菌体浆状物，该浆状物即可作为生物催化剂。

实施例11、重组菌株进行10L罐发酵生产蔗糖磷酸化酶

将pet28 a(+)-spase-BL21(DE3) 表达菌株斜面菌体接入装有300ml实施例7所提到种子培养基的2000ml三角瓶，然后在温度28℃、转速150rpm条件下振荡培养15小时至菌液OD600nm达到20～25后，然后按接种比为4%比例接入装有6L实施例7所提到发酵培养基的10L罐中进行放大发酵生产蔗糖磷酸化酶。在发酵温度为28℃、转速400rpm、罐压0.03MPa、通气量为8.5L/（min.L）条件下通气搅拌培养18小时，发酵液OD600nm达到35～45，然后开始流加1200ml补料培养基，补料培养基组成为酵母浸粉4.0%、蛋白胨1.5%、甘油7%、乳糖3.1%、蔗糖45%、磷酸二氢钾 0.7%、氯化钙 0.1%，流加速度85ml/min，连续流加20小时，流加中通过20%氨水来调节发酵液至pH4.5。流加完毕，继续发酵培养35小时后，终止发酵。然后通过离心机4000转5min离心收集含蔗糖磷酸化酶的菌体浆状物，该浆状物即可作为生物催化剂。

实施例12、重组菌株进行10L罐发酵生产蔗糖磷酸化酶

将pet28 a(+)-spase-BL21(DE3) 表达菌株斜面菌体接入装有300ml实施例7所提到种子培养基的2000ml三角瓶，然后在温度36℃、转速150rpm条件下振荡培养35小时至菌液OD600nm达到20～25后，然后按接种比为6%比例接入装有6L实施例7所提到发酵培养基的10L罐中进行放大发酵生产蔗糖磷酸化酶。在发酵温度为36℃、转速400rpm、罐压0.06MPa、通气量为7L/（min.L）条件下通气搅拌培养18小时，发酵液OD600nm达到35～45，然后开始流加1200ml补料培养基，补料培养基组成为酵母浸粉6.0%、蛋白胨 0.5%、甘油13%、乳糖1.8%、蔗糖 55%、磷酸二氢钾 0.3%、氯化钙 0.3%，流加速度75ml/min，连续流加10小时，流加中通过20%氨水来调节发酵液至pH7。流加完毕，继续发酵培养24小时后，终止发酵。然后通过离心机4000转20min离心收集含蔗糖磷酸化酶的菌体浆状物，该浆状物即可作为生物催化剂。

实施例13、重组菌株进行10L罐发酵生产蔗糖磷酸化酶

将pet28 a(+)-spase-BL21(DE3) 表达菌株斜面菌体接入装有300ml实施例8所提到种子培养基的2000ml三角瓶，然后在温度32℃、转速220rpm条件下振荡培养20小时至菌液OD600nm达到20～25后，然后按接种比为5%比例接入装有6L实施例8所提到发酵培养基的10L罐中进行放大发酵生产蔗糖磷酸化酶。其他与实施例10相同。

实施例14、重组菌株进行10L罐发酵生产蔗糖磷酸化酶

将pet28 a(+)-spase-BL21(DE3) 表达菌株斜面菌体接入装有300ml实施例8所提到种子培养基的2000ml三角瓶，然后在温度28℃、转速150rpm条件下振荡培养15小时至菌液OD600nm达到20～25后，然后按接种比为4%比例接入装有6L实施例8所提到发酵培养基的10L罐中进行放大发酵生产蔗糖磷酸化酶。其他与实施例11相同。

实施例15、重组菌株进行10L罐发酵生产蔗糖磷酸化酶

将pet28 a(+)-spase-BL21(DE3) 表达菌株斜面菌体接入装有300ml实施例8所提到种子培养基的2000ml三角瓶，然后在温度36℃、转速150rpm条件下振荡培养35小时至菌液OD600nm达到20～25后，然后按接种比为6%比例接入装有6L实施例8所提到发酵培养基的10L罐中进行放大发酵生产蔗糖磷酸化酶。其他与实施例12相同。

实施例16、重组菌株进行10L罐发酵生产蔗糖磷酸化酶

将pet28 a(+)-spase-BL21(DE3) 表达菌株斜面菌体接入装有300ml实施例9所提到种子培养基的2000ml三角瓶，然后在温度32℃、转速220rpm条件下振荡培养20小时至菌液OD600nm达到20～25后，然后按接种比为5%比例接入装有6L实施例9所提到发酵培养基的10L罐中进行放大发酵生产蔗糖磷酸化酶。其他与实施例10相同。

实施例17、重组菌株进行10L罐发酵生产蔗糖磷酸化酶

将pet28 a(+)-spase-BL21(DE3) 表达菌株斜面菌体接入装有300ml实施例9所提到种子培养基的2000ml三角瓶，然后在温度28℃、转速150rpm条件下振荡培养15小时至菌液OD600nm达到20～25后，然后按接种比为4%比例接入装有6L实施例9所提到发酵培养基的10L罐中进行放大发酵生产蔗糖磷酸化酶。其他与实施例11相同。

实施例18、重组菌株进行10L罐发酵生产蔗糖磷酸化酶

将pet28 a(+)-spase-BL21(DE3) 表达菌株斜面菌体接入装有300ml实施例9所提到种子培养基的2000ml三角瓶，然后在温度36℃、转速150rpm条件下振荡培养35小时至菌液OD600nm达到20～25后，然后按接种比为6%比例接入装有6L实施例9所提到发酵培养基的10L罐中进行放大发酵生产蔗糖磷酸化酶。其他与实施例12相同。

实施例19、生物催化合成AA-2G

称取10g实施例7所收集的菌体浆状物，加80ml 50mM柠檬酸三钠溶液将菌体浆状物重新分散制成菌体悬浮液，然后依次加入7.5克蔗糖和2克L-抗坏血酸，一边加入一边搅拌使原料溶解完全，再用50mM柠檬酸三钠溶液定容至100ml，再用0.5M盐酸调节pH值5.5，然后转入250ml三角瓶，用三层玻璃纸封口，再置于振荡器中进行反应，反应温度为35℃、转速120rpm，反应24h，取样测定转化液中AA-2G浓度为22.3g/L,转化率58%。AA-2G的测定方法采用HPLC法，测定条件如下：

流动相：50mM 磷酸二氢钾溶液（pH 3.0，用三氟乙酸调节）：甲醇=95：5；流速：0.4ml/min；色谱柱：kromasil 100-5C18(250×4.6mm)；波长：238nm；柱温：25℃。

实施例20、生物催化合成AA-2G

称取10g实施例7所收集的菌体浆状物，加80ml 20mM柠檬酸三钠溶液将菌体浆状物重新分散制成菌体悬浮液，然后依次加入6.0克蔗糖和1.5克L-抗坏血酸，一边加入一边搅拌使原料溶解完全，再用20mM柠檬酸三钠溶液定容至100ml，再用0.5M盐酸调节pH值6.5，然后转入250ml三角瓶，用三层玻璃纸封口，再置于振荡器中进行反应，反应温度为28℃、转速220rpm，反应30h，取样测定转化液中AA-2G,转化率56%。AA-2G的测定方法采用HPLC法，测定条件如下：

流动相：50mM 磷酸二氢钾溶液（pH 3.0，用三氟乙酸调节）：甲醇=95：5；流速：0.4ml/min；色谱柱：kromasil 100-5C18(250×4.6mm)；波长：238nm；柱温：25℃。

实施例21、生物催化合成AA-2G

称取10g实施例7所收集的菌体浆状物，加80ml 60mM柠檬酸三钠溶液将菌体浆状物重新分散制成菌体悬浮液，然后依次加入12.0克蔗糖和3克L-抗坏血酸，一边加入一边搅拌使原料溶解完全，再用60mM柠檬酸三钠溶液定容至100ml，再用0.5M盐酸调节pH值4.0，然后转入250ml三角瓶，用三层玻璃纸封口，再置于振荡器中进行反应，反应温度为42℃、转速200rpm，反应15h，取样测定转化液中AA-2G转化率64%。AA-2G的测定方法采用HPLC法，测定条件如下：

流动相：50mM 磷酸二氢钾溶液（pH 3.0，用三氟乙酸调节）：甲醇=95：5；流速：0.4ml/min；色谱柱：kromasil 100-5C18(250×4.6mm)；波长：238nm；柱温：25℃。

实施例22、生物催化合成AA-2G

称取10g实施例8所收集的菌体浆状物，其他与实施例20相同。

实施例23、生物催化合成AA-2G

称取10g实施例9所收集的菌体浆状物，其他与实施例21相同。

实施例24、生物催化合成AA-2G

称取300g实施例10所收集的菌体浆状物，加2L 50mM柠檬酸三钠溶液将菌体浆状物重新分散制成菌体悬浮液，然后依次加入300克蔗糖和75克L-抗坏血酸，一边加入一边搅拌使原料溶解完全，再用50mM柠檬酸三钠溶液定容至3L，再用0.5M盐酸调节pH值5.5，然后转入5L生物催化反应釜，反应温度为35℃、转速120rpm条件下进行生物催化制备AA-2G。转化过程，为了保持反应体系pH能够维持在5.5，采用0.5M盐酸或0.5M氢氧化钠溶液来调节。若转化体系pH值高于5.5时，采用0.5M盐酸溶液来调节；若低于5.5时，则采用0.5M氢氧化钠溶液来调节。转化24h时，取样测定转化液中AA-2G浓度为31.2g/L,转化率约65%。

实施例25、生物催化合成AA-2G

称取300g实施例10所收集的菌体浆状物，加2L 20mM柠檬酸三钠溶液将菌体浆状物重新分散制成菌体悬浮液，然后依次加入180克蔗糖和45克L-抗坏血酸，一边加入一边搅拌使原料溶解完全，再用20mM柠檬酸三钠溶液定容至3L，再用0.5M盐酸调节pH值6.5，然后转入5L生物催化反应釜，反应温度为28℃、转速100rpm条件下进行生物催化制备AA-2G。转化过程，为了保持反应体系pH能够维持在6.5，采用0.5M盐酸或0.5M氢氧化钠溶液来调节。若转化体系pH值高于6.5时，采用0.5M盐酸溶液来调节；若低于6.5时，则采用0.5M氢氧化钠溶液来调节。转化30h时，取样测定转化液中AA-2转化率约64%。

实施例26、生物催化合成AA-2G

称取300g实施例10所收集的菌体浆状物，加2L 60mM柠檬酸三钠溶液将菌体浆状物重新分散制成菌体悬浮液，然后依次加入360克蔗糖和90克L-抗坏血酸，一边加入一边搅拌使原料溶解完全，再用60mM柠檬酸三钠溶液定容至3L，再用0.5M盐酸调节pH值4.0，然后转入5L生物催化反应釜，反应温度为41℃、转速200rpm条件下进行生物催化制备AA-2G。转化过程，为了保持反应体系pH能够维持在4.0，采用0.5M盐酸或0.5M氢氧化钠溶液来调节。若转化体系pH值高于4.0时，采用0.5M盐酸溶液来调节；若低于4.0时，则采用0.5M氢氧化钠溶液来调节。转化15h时，取样测定转化液中AA-2G转化率约71%。

实施例27、生物催化合成AA-2G

称取300g实施例11所收集的菌体浆状物，其他与实施例25相同。

实施例28、生物催化合成AA-2G

称取300g实施例12所收集的菌体浆状物，其他与实施例26相同。

实施例29、生物催化合成AA-2G

称取300g实施例13所收集的菌体浆状物，其他与实施例24相同。

实施例30、生物催化合成AA-2G

称取300g实施例14所收集的菌体浆状物，其他与实施例25相同。

实施例31、生物催化合成AA-2G

称取300g实施例15所收集的菌体浆状物，其他与实施例26相同。

实施例32、生物催化合成AA-2G

称取300g实施例16所收集的菌体浆状物，其他与实施例24相同。

实施例30、生物催化合成AA-2G

称取300g实施例17所收集的菌体浆状物，其他与实施例25相同。

实施例31、生物催化合成AA-2G

称取300g实施例18所收集的菌体浆状物，其他与实施例26相同。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东格得生物科技有限公司

<120> 制备L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1727

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

taattttgtt taactttaag aaggagatat accatgggca gcagccatca tcatcatcat 60

cacagcagcg gcctggtgcc gcgcggcagc catatggcta gcatgactgg tggacagcaa 120

atgggtcgcg gatccatgaa aaacaaagtg cagctcatca catacgccga tcgtctcggc 180

gatggcactc ttagctcgat gaccgacatc ctgcgcaccc gcttcgacgg cgtgtatgac 240

ggcgtgcata tcctgccgtt cttcactccg ttcgatggtg cggatgcagg cttcgacccg 300

atcgaccata ccaaagtcga cgaacgtctc ggcagctggg acgacgtcgc cgaactctcc 360

aagacccaca acatcatggt cgacgccatc gtcaaccaca tgagttggga atccaagcag 420

ttccaagacg tgcttgaaaa aggtgaggaa tccgagtatt acccgatgtt cctgaccatg 480

agctccgtct tcccgaacgg cgccaccgaa gaagacctgg ccggcatcta ccgcccgcgc 540

ccgggcctgc cgttcaccca ctacaagttc gccggcaaga cgcgcttggt ctgggtgagc 600

ttcaccccgc agcaggtgga catcgacact gattccgcca agggttggga atacctgatg 660

tcgatcttcg atcagatggc cgccagccac gtgcgctaca tccgtctcga cgccgtgggc 720

tacggcgcca aggaagccgg caccagctgc ttcatgaccc ccaagacctt taagctcatc 780

tcccgtctgc gcgaggaggg cgtcaagcgc ggccttgaaa tcctcatcga ggttcacagc 840

tactacaaga agcaggtgga aatcgcctcc aaggtggacc gcgtctacga tttcgccctg 900

ccgccgctgc ttctgcactc gctgttcacc ggtcacgtcg aacccgtggc ccactggacc 960

gagatccgcc cgaacaacgc cgtcaccgtg ctcgatacgc acgatggcat cggcgtgatc 1020

gacatcggct ccgaccagct cgaccgctcc ctcaagggcc tcgtgcccga cgaggacgtc 1080

gacaacctgg tcaacaccat ccatgccaac acccacggcg aatcccaggc cgccaccggt 1140

gccgccgcgt ccaacctcga cctctaccag gtcaactcca cgtactactc ggccctcggc 1200

tgcaacgacc agcactactt ggccgcccgc gccgtgcagt tcttcctgcc gggcgtgccg 1260

caggtctact acgtgggcgc gctcgccggc cgcaacgaca tggaactgct gcgccgcacc 1320

aacaacggcc gcgacatcaa ccgccactac tactccaccg ccgaaatcga tgaaaacctc 1380

gaacgcccgg tggtcaaggc cctgaacgcc ctggccaagt tccgcaacga actgcctgca 1440

ttcgatggcg agttcagcta cgaggtcgat ggcgacacgt ccatcacctt ccgctggacc 1500

gccgccgacg gcacgtccac ggccgccctc accttcgagc ccggacgcgg cctcggcaca 1560

gacaacgcca ccccggttgc cagccttgcc tggagcgatg ccgccggcga ccacgaaacc 1620

cgcgatctgc tcgccaaccc gccgattgcc gatatcgaca agcttgcggc cgcactcgag 1680

caccaccacc accaccactg agatccggct gctaacaaag cccgaaa 1727

SEQUENCE LISTING

<110> 山东格得生物科技有限公司

<120> 一种重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株制备L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 508

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Asn Lys Val Gln Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Arg Leu Gly Asp

1 5 10 15

Gly Thr Leu Ser Ser Met Thr Asp Ile Leu Arg Thr Arg Phe Asp Gly

20 25 30

Val Tyr Asp Gly Val His Ile Leu Pro Phe Phe Thr Pro Phe Asp Gly

35 40 45

Ala Asp Ala Gly Phe Asp Pro Ile Asp His Thr Lys Val Asp Glu Arg

50 55 60

Leu Gly Ser Trp Asp Asp Val Ala Glu Leu Ser Lys Thr His Asn Ile

65 70 75 80

Met Val Asp Ala Ile Val Asn His Met Ser Trp Glu Ser Lys Gln Phe

85 90 95

Gln Asp Val Leu Glu Lys Gly Glu Glu Ser Glu Tyr Tyr Pro Met Phe

100 105 110

Leu Thr Met Ser Ser Val Phe Pro Asn Gly Ala Thr Glu Glu Asp Leu

115 120 125

Ala Gly Ile Tyr Arg Pro Arg Pro Gly Leu Pro Phe Thr His Tyr Lys

130 135 140

Phe Ala Gly Lys Thr Arg Leu Val Trp Val Ser Phe Thr Pro Gln Gln

145 150 155 160

Val Asp Ile Asp Thr Asp Ser Ala Lys Gly Trp Glu Tyr Leu Met Ser

165 170 175

Ile Phe Asp Gln Met Ala Ala Ser His Val Arg Tyr Ile Arg Leu Asp

180 185 190

Ala Val Gly Tyr Gly Ala Lys Glu Ala Gly Thr Ser Cys Phe Met Thr

195 200 205

Pro Lys Thr Phe Lys Leu Ile Ser Arg Leu Arg Glu Glu Gly Val Lys

210 215 220

Arg Gly Leu Glu Ile Leu Ile Glu Val His Ser Tyr Tyr Lys Lys Gln

225 230 235 240

Val Glu Ile Ala Ser Lys Val Asp Arg Val Tyr Asp Phe Ala Leu Pro

245 250 255

Pro Leu Leu Leu His Ser Leu Phe Thr Gly His Val Glu Pro Val Ala

260 265 270

His Trp Thr Glu Ile Arg Pro Asn Asn Ala Val Thr Val Leu Asp Thr

275 280 285

His Asp Gly Ile Gly Val Ile Asp Ile Gly Ser Asp Gln Leu Asp Arg

290 295 300

Ser Leu Lys Gly Leu Val Pro Asp Glu Asp Val Asp Asn Leu Val Asn

305 310 315 320

Thr Ile His Ala Asn Thr His Gly Glu Ser Gln Ala Ala Thr Gly Ala

325 330 335

Ala Ala Ser Asn Leu Asp Leu Tyr Gln Val Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser

340 345 350

Ala Leu Gly Cys Asn Asp Gln His Tyr Leu Ala Ala Arg Ala Val Gln

355 360 365

Phe Phe Leu Pro Gly Val Pro Gln Val Tyr Tyr Val Gly Ala Leu Ala

370 375 380

Gly Arg Asn Asp Met Glu Leu Leu Arg Arg Thr Asn Asn Gly Arg Asp

385 390 395 400

Ile Asn Arg His Tyr Tyr Ser Thr Ala Glu Ile Asp Glu Asn Leu Glu

405 410 415

Arg Pro Val Val Lys Ala Leu Asn Ala Leu Ala Lys Phe Arg Asn Glu

420 425 430

Leu Pro Ala Phe Asp Gly Glu Phe Ser Tyr Glu Val Asp Gly Asp Thr

435 440 445

Ser Ile Thr Phe Arg Trp Thr Ala Ala Asp Gly Thr Ser Thr Ala Ala

450 455 460

Leu Thr Phe Glu Pro Gly Arg Gly Leu Gly Thr Asp Asn Ala Thr Pro

465 470 475 480

Val Ala Ser Leu Ala Trp Ser Asp Ala Ala Gly Asp His Glu Thr Arg

485 490 495

Asp Leu Leu Ala Asn Pro Pro Ile Ala Asp Ile Asp

500 505

Claims (9)

1.一种重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株，其特征在于：重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株的保藏号为：CCTCC M 2016496，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。

2.一种重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

采用基因重组和定点突变技术，将源自长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶编码基因进行克隆表达，构建重组蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌工程菌株。

3.根据权利要求2所述的重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株的制备方法，其特征在于：

将来自长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶编码基因通过pet28 a(+)质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株。

4.根据权利要求3所述的重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

A1、蔗糖磷酸化酶克隆菌株的构建，包括以下步骤：

A1.1、将冻存的长双歧杆菌进行复苏培养传代n次，以该菌液为DNA模板，并以NCBI上长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶基因序列为模板设计一对引物，然后进行PCR反应，经琼脂凝胶分离纯化回收获得目标基因DNA片段；

A1.2、将获得的目标基因DNA片段和pet 28a(+)质粒构建双酶切反应体系，经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，再经凝胶回收，最后经DNA连接构建重组质粒；

A1.3、将构建重组质粒转化到大肠杆菌Trans5α感受态细胞中形成转化克隆菌株pet28a(+)-spase，再经验证获得目标重组质粒；

A2、蔗糖磷酸化酶表达菌株的构建，包括以下步骤：

A2.1、将含目标重组质粒的阳性克隆菌株于LB培养基中进行培养，再经提取获得目标重组质粒；

A2.2、将提取获得的目标重组质粒与感受态的大肠杆菌BL21(DE3)表达载体进行转化，经平板分离获得克隆菌落，再经PCR验证获得目标蔗糖磷酸化酶表达菌株pet28 a(+)-spase-BL21(DE3)；

A3、采用PCR定点突变技术，其步骤包括突变位点氨基酸的突变引物设计，然后进行突变质粒克隆菌株的构建、突变质粒表达菌株的构建，再经PCR验证获得定点突变阳性表达菌株，即重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株。

5.根据权利要求4所述的重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株的制备方法，其特征在于： 步骤A1蔗糖磷酸化酶克隆菌株构建中：

将冻存的长双歧杆菌进行复苏培养传代n次，以该菌液为DNA模板，以NCBI上长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶基因序列为模板设计一对引物：

正向引物(spase-bam-F):

5’ CGCGGATCCATGAAAAACAAAGTGCAGCTCATC 3’

反向引物(spase-hind-R):

5’ CCCAAGCTTGTCGATATCGGCAATCGG 3’

然后进行PCR反应，反应条件为：92-98℃ 预变性0.5-2min，然后20-40个循环（92-98℃5-15S，49℃～64℃10-15S，68-75℃18-25S），68-75℃再延伸3-7min；

PCR反应完毕后，经进行凝胶回收、验证和纯化PCR反应后的产物以及pet 28a(+)质粒的DNA溶液组成BamHⅠ和HindⅢ双酶切反应体系进行酶切修饰，酶切条件为32-42℃温度下酶切反应2-7min，然后进行回收酶切产物，然后与含DNA连接酶的溶液混合均匀，再10-20℃循环水浴中反应过夜；

DNA过夜连接完毕后，将10μl连接产物全部加入45-55μl刚融化的大肠杆菌Trans5α感受态细胞中，混匀后置于冰上冰浴20-50min；然后将其快速转移至恒温水浴锅中，35-45℃热激80-95sec；随后取出转化混合物置于冰上1-3min后，于超净台中加入480-520μl无菌的无抗LB培养基，放至32-42℃、100-300rpm恒温摇床中复苏0.5-2小时；分别取80-120μl复苏后的菌液均匀地涂布在两个卡那霉素抗性的LB固体培养基的培养平板上，32-42℃恒温培养10-24h；在转化后的两个平板上各挑单克隆菌落，至1ml卡那抗性的LB液体培养基中，32-42℃、100-300rpm恒温摇5-12h，以该菌液作为PCR模板进行PCR验证，进行验证阳性克隆获得蔗糖磷酸化酶克隆菌株pet28 a(+)-spase；

步骤A2蔗糖磷酸化酶表达菌株pet28 a(+)-spase-BL21(DE3)的构建中，

选取阳性克隆菌液，接种于5ml卡那抗性的LB液体培养基中，32-42℃、100-300rpm恒温摇菌8-20h后提取重组质粒，然后分别取,0.5-1.5μl重组质粒和0.5-1.5μl pet28a(+)质粒加入两管50μl刚融化的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞（购自百捷生物公司）中，混匀后置于冰上冰浴10-25min；随后将其快速转移至恒温水浴锅中，38-45℃热激10-30S，再从恒温水浴锅中取出转化混合物置于冰上1-3min后，于超净台中分别加入480-520μl无菌的无抗LB培养基，放至32-42℃、100-300rpm恒温摇床中复苏30-60min；取180-220μl复苏后的菌液均匀地涂布在含90-110μg/ml的卡那霉素的LB固体培养基培养平板上，32-42℃恒温培养箱中培养8-20h，观察实验组和对照组的培养平板的菌落情况，若pet 28a(+)质粒转化的平板上的菌落生长情况良好则可说明实验操作无误差，挑取实验组平板上的n个单克隆菌落至n个1ml卡那抗性的LB液体培养基中，于32-42℃、100-300rpm恒温摇菌8-20h后进行菌液PCR验证获得阳性表达菌株pet28 a(+)-spase-BL21(DE3)。

6.一种L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷（AA-2G）的制备方法，其特征在于：以重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株为生物催化剂。

7.根据权利要求6所述的L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷（AA-2G）的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

将采用重组蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌工程菌株进行发酵生产所得蔗糖磷酸化酶为生物催化剂，以蔗糖为糖基供体，L-抗坏血酸为糖基受体，进行生物催化制备AA-2G。

8.根据权利要求7所述的L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷（AA-2G）的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

B1、将获得重组蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌工程菌株接入种子培养基进行培养，然后转接入诱导培养基进行蔗糖磷酸化酶发酵生产获得含重组蔗糖磷酸化酶的催化剂；

B2、将含重组蔗糖磷酸化酶的催化剂与缓冲液进行混合，然后加入蔗糖和L-抗坏血酸原料，再调节反应体系pH值，最后在一定转化温度下进行生物催化合成AA-2G。

9.根据权利要求8所述的L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷（AA-2G）的制备方法，其特征在于：步骤B2中，所用缓冲体系为柠檬酸三钠缓冲体系，其中，柠檬酸三钠浓度为20～60mM，pH值为4.0～6.5，蔗糖浓度为60～120g/L，L-抗坏血酸浓度15～30g/L。