CN107044979A - 原血红素和β‑葡萄糖醛酸苷酶联合在支气管上皮细胞异质性增生检测中的应用及试剂盒 - Google Patents
原血红素和β‑葡萄糖醛酸苷酶联合在支气管上皮细胞异质性增生检测中的应用及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了原血红素和β‑葡萄糖醛酸苷酶联合在支气管上皮细胞异质性增生检测中的应用及试剂盒,属于液体活检病理学检测技术领域。本发明首次将原血红素和β‑葡萄糖醛酸苷酶作为联合标志物应用到支气管上皮细胞异质性增生检测领域中,令人惊喜的发现,相较于单独地以原血红素或β‑葡萄糖醛酸苷酶作为标志物进行检测,将原血红素和β‑葡萄糖醛酸苷酶作为联合标志物进行检测的敏感度、特异度以及约登指数均明显提高,因此,以原血红素和β‑葡萄糖醛酸苷酶作为联合标志物有助于提高对由支气管上皮细胞异质性增生引起的肺癌的诊断结果的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及液体活检病理学检测技术领域,具体而言,涉及原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶联合在支气管上皮细胞异质性增生检测中的应用及试剂盒。
背景技术
支气管上皮细胞异质性增生的结果是肺癌。据统计,我国肺癌发病率每年增长26.9%,肺癌已成为我国首位恶性肿瘤死亡原因,占全部恶性肿瘤死亡的22.7%,且由于空气污染等因素,发病率和死亡率仍在继续迅速上升。自2000年至2005年间,中国肺癌的发病人数估计增加12万人,其中,男性肺癌病人从2000年的26万人增加到2005年的33万人,同期女性肺癌患者从12万人增加到17万人,预计到2025年,我国肺癌病人将达到100万,成为世界第一肺癌大国。虽然近年来在肺癌的临床治疗方面有较大进展,但由于目前缺乏简便实用、行之有效的能为肺癌患者快速作出正确诊断的方法,等到病理诊断时多已为中晚期,失去了早诊早治的机会,以及肺癌自身的特点,故肺癌的5年相对生存率仍较低,一般低于15%。
肺癌可以预防的,美国、英国等自上世纪60年代开始实施控烟、改善大气环境等措施,80年代以来肺癌的发病率和死亡率都已呈下降趋势。只要坚持以预防为主,会带来肺癌的发病率和死亡率减少。英国、日本、美国的多项研究证明,90%的早早期肺癌手术后生存期>10年。尽可能筛查高危人群,早期发现,及时采取措施,可以防止肺癌在我国进一步发展。
肺癌初筛及早期诊断主要应用X线检查(透视、胸小片、胸正侧位片、断层片、CT片)、痰脱落细胞学检查、纤维支气管镜检查等。但目前尚缺乏证据证明这些筛查或早期诊断方法能降低肺癌的死亡率,因此不宜在普通人群中开展大规模的筛查。随着人类基因组计划的完成和蛋白质组研究的开始,许多相关的新技术和新方法不断出现,通过寻找理想的肿瘤标志物用于常见肿瘤的筛查、早诊、预后判断及指导个体治疗都已逐渐成为可能,从而达到预测个体患肺癌的风险度,并对患者进行早诊早治。
而目前检测支气管上皮细胞异质性增生的筛查方法比较繁琐,且相应的检测都是针对单个的标志物进行检测,检测结果的敏感度和特异度并不高,对肺癌的诊断结果不准确。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为联合标志物在制备支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒中的应用,将原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶同时作为联合标志物,用于检测支气管上皮细胞异质性增生,具有敏感度和特异度高的特点,有助于提高对由支气管上皮细胞异质性增生引起的肺癌的诊断结果的准确性。
本发明的另一目的在于提供一种支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒,该支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒以原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为标志物进行联合检测,可用于对由支气管上皮细胞异质性增生引起的肺癌的筛查、早诊、预后判断及指导个体治疗等领域,具有较高的敏感度和特异度。
本发明是这样实现的:
原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为联合标志物在制备支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒中的应用。
一种支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒,其以原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为标志物进行联合检测,该支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒包括:用于检测原血红素的原血红素检测试剂膜和用于检测β-葡萄糖醛酸苷酶的β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂膜。
本发明的原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶联合在支气管上皮细胞异质性增生检测中的应用及试剂盒的有益效果是:
相较于以单个的原血红素或β-葡萄糖醛酸苷酶作为标志物,本发明首次提出将原血红素或β-葡萄糖醛酸苷酶作为联合标志物,应用于检测支气管上皮细胞异质性增生的情况,令人惊喜的发现,相较于单独地以原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为标志物进行检测,将原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为联合标志物进行检测的敏感度(89%)、特异度(96%)以及约登指数(0.85)均明显提高,有助于提高对由支气管上皮细胞异质性增生引起的肺癌的诊断结果的准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1提供的原血红素比色板的结构示意图;
图2为本发明实施例1提供的β-葡萄糖醛酸苷酶比色板的结构示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶联合在支气管上皮细胞异质性增生检测中的应用及试剂盒进行具体说明。
原血红素是血红素家族的重要成员,是血红素在人体内的存在形式,是血红素结合蛋白的活性基。它由原卟啉IX与二价铁离子结合而成。据其分子结构和功能不同又分为原血红素a、b、c,在肿瘤发生过程中被释放,属于医学相关生物标志(medicine-relatedbiomarker)。致癌因素导致支气管上皮细胞糖代谢异常,肿瘤细胞的耗糖量是正常细胞的十倍,而且磷酸戊糖途径代谢活跃,称为“瓦博格氏效应”。在肿瘤细胞能量代谢电子传递过程中,其间芬顿氏反应产生的羟自由基、过氧自由基等对线粒体造成氧化损伤,改变细胞蛋白的极性量值,使位居线粒体基膜中血红素结合蛋白疏水核(又称血红素口袋)中的原血红素释放,导致痰液中原血红素含量增加,其释放量与细胞癌变程度呈正相关。原血红素具有过氧化物酶的作用,可以使过氧化物脱氧,进而使供氢体氧化成含显色集团的物质。用比色法测定痰液中原血红素含量,即可显示支气管上皮细胞是否存有异质性增生。
β-葡萄糖醛酸苷酶是支气管上皮细胞异质性增生过程中活性增强的一种生物标志物。它是由四个相同亚单位组成的糖蛋白,广泛存在于人体的各种组织及体液中,生理状态下具有参与细胞增生的作用,而在病理状态下,β-葡萄糖醛酸苷酶可以作用于葡萄糖醛酸甙的β一糖苷键,水解癌周***中的蛋白多糖及糖蛋白,破坏其网状结构的防御作用,有利于癌细胞的浸润与扩散。
有关肺癌β-葡萄糖醛酸苷酶活性增高的机制,一是为适应肿瘤生存引起的机体对酶代谢的改变,如癌细胞分泌β-葡萄糖醛酸苷酶增强,癌细胞膜对β-葡萄糖醛酸苷酶通透性改变,对该酶抑制剂的缺乏或增加;二是肿瘤组织浸润并且破坏周围正常组织,引起其它组织酶生成异常,或因肿瘤压迫梗阻引起该酶的大量释放,造成β-葡萄糖醛酸苷酶增高。
通过联合应用形态学细胞水平的免疫组化技术、亚细胞水平的免疫电镜技术和机能学的ELISA技术,对肺癌组织及痰液中β-葡萄糖醛酸苷酶进行的同步检测显示,β-葡萄糖醛酸苷酶在肺癌患者组织及痰液中增高,是由癌细胞自身的生物学特性决定的,缘于肿瘤细胞为适应其快速过度增殖和异常分化的自主性生长的生存方式而产生的自我调控,由其自身独特的生长方式决定并成为内因的。在最适温度与PH条件下,酚酞葡萄糖醛酸甙经β-葡萄糖醛酸苷酶催化水解,释放出游离酚酞。加碱性溶液终止反应,酚酞呈红色。观察酚酞指示的颜色变化,即可了解痰液中β-葡萄糖醛酸苷酶的活性,显示支气管上皮细胞是否存有恶变及其程度。
但是,以单个的原血红素a/b/c作为标志物检测支气管上皮细胞异质性增生的特异度比较低,而以单个的β-葡萄糖醛酸苷酶作为标志物检测支气管上皮细胞异质性增生的敏感度比较低。
鉴于此,一方面,本发明提供了原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为联合标志物在制备支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒中的应用。
进一步地,上述的支气管上皮细胞为支气管粘膜上皮细胞。
本发明首次提出将原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为联合标志物,用于检测支气管上皮细胞细胞异质性增生(例如支气管粘膜上皮细胞异质性增生)。
相较于单独地以原血红素或β-葡萄糖醛酸苷酶作为标志物,将原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为联合标志物,用于检测支气管上皮细胞异质性增生,这两种标志物的检测结果可相互印证,相互补充,从而弥补其各自的不足,因而具有更高的敏感度和特异度,有助于提高对由支气管上皮细胞异质性增生引起的肺癌的诊断结果的准确性。
另一方面,本发明还提供了一种支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒,以原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为标志物进行联合检测,该支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒包括:用于检测原血红素的原血红素检测试剂膜和用于检测β-葡萄糖醛酸苷酶的β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂膜。
本发明所提供的支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒可同时对支气管上皮细胞异质性增生的标志物原血红素和β葡萄糖醛酸苷酶进行同时联合检测,具有操作简单,检测结果准确的特点。其可用于对由支气管上皮细胞异质性增生引起的肺癌的筛查、早诊、预后判断及指导个体治疗等领域,具有较高的敏感度和特异度。
进一步地,上述支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒还包括样本前处理液,该样本前处理液由pH为6.8-7.8、浓度为0.05mol/L的Tris-Hcl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)缓冲液与EDTA(乙二胺四乙酸二钠)混合制得。
优选地,Tris-Hcl缓冲液的pH为7.4。
优选地,EDTA在样本前处理液的浓度为0.01-0.03mol/L,更优选地,EDTA在样本前处理液中的浓度为0.02mol/L。
进一步地,上述的原血红素检测试剂膜由以下方法制得:
(1)将聚乙烯吡咯烷酮与磷酸缓冲液混合,得到第一混合液;
(2)将原血红素空白试剂膜浸泡于上述第一混合液中,去除上述原血红素空白试剂膜的水分后,得到原血红素试剂膜半成品;
其中,去除上述原血红素空白试剂膜的水分为:淋去原血红素空白试剂膜上的多余试剂,烘干,得到原血红素试剂膜半成品,当然,也可按其他的方法将浸泡后的原血红素空白试剂膜的水分除去,其也属于本发明的保护范围。
(3)将上述原血红素试剂膜半成品浸泡于第二混合液中,去除上述原血红素试剂膜半成品的水分后,得到成品的原血红素检测试剂膜,上述第二混合液由3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、无水乙醇和过氧化羟基异丙苯混合制得。
其中,去除上述原血红素试剂膜半成品的水分为:淋去原血红素试剂膜半成品上多余的试剂,均匀地烘干即可。
优选地,上述的磷酸缓冲液的浓度为0.8-2mol/L、pH为3.2-6.8。
更优选地,上述的磷酸缓冲液的浓度为1.75mol/L、pH为4.5。
优选地,上述的第一混合液中的聚乙烯吡咯烷酮的浓度为7-9g/100ml。即每100ml第一混合液中含有聚乙烯吡咯烷酮7-9g。
更优选地,上述的第一混合液中的聚乙烯吡咯烷酮的浓度为8g/100ml。
优选地,上述的第二混合液按以下方法制得:
将0.5-1g的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺加入到500ml的无水乙醇中,然后加入1-2ml的过氧化羟基异丙苯后制得第二混合液。
更优选地,3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的加入量为0.75g,过氧化羟基异丙苯的加入量为1ml。
进一步地,上述β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂膜由以下方法制得:
(1)将聚乙烯吡咯烷酮、酚酞葡萄糖醛酸苷辛可尼丁盐与醋酸缓冲液混合,得到第三混合液;
(2)将β-葡萄糖醛酸苷酶空白试剂膜浸泡于上述第三混合液中,去除上述β-葡萄糖醛酸苷酶空白试剂膜的水分后,得到β-葡萄糖醛酸苷酶试剂膜半成品;
其中,去除上述β-葡萄糖醛酸苷酶空白试剂膜的水分为:淋去β-葡萄糖醛酸苷酶空白试剂膜上的多余试剂,避光条件下,28℃流动空气干燥2小时。
(3)将上述β-葡萄糖醛酸苷酶试剂膜半成品浸泡于甘氨酸缓冲液中,去除β-葡萄糖醛酸苷酶试剂膜半成品的水分,得到β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂膜。
其中,去除β-葡萄糖醛酸苷酶试剂膜半成品的水分为:淋去β-葡萄糖醛酸苷酶试剂膜半成品上多余的试剂,于40℃均匀地烘干。
优选地,醋酸缓冲液的浓度为0.1-0.3mol/L、pH为6.5-7.58,更优选地,醋酸缓冲液的浓度为0.2mol/L、pH为5.0。
优选地,上述第三混合液中的酚酞葡萄糖醛酸苷辛可尼丁盐的浓度为0.5-1g/100ml,更优选地,第三混合液中的酚酞葡萄糖醛酸苷辛可尼丁盐的浓度为0.79g/100ml。
优选地,第三混合液中的聚乙烯吡咯烷酮浓度为7-9g/100ml,更优选地,第三混合液中的聚乙烯吡咯烷酮浓度为8g/100ml。
优选地,甘氨酸缓冲液的浓度为0.2-0.3mol/L、pH为9-12。
更优选地,甘氨酸缓冲液的浓度为0.22mol/L、pH为10.5。
需要说明的是,本发明提供的原血红素检测试剂膜和β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂膜的制作方法并不限于上述的制作方法,在其他的实施例中,按其他的方法所制作得到的可用于检测的原血红素的原血红素检测试剂膜和可用于检测的β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂膜,只要将其用于同时应用于检测原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶,将二者作为联合标志物,用于检测支气管上皮细胞异质性增生例如支气管粘膜上皮细胞异质性增生则均属于本发明的保护范围。
还需要说明的是,在本发明的实施例中,上述制作方法中所用的原血红素空白试剂膜可为31ET滤纸;β-葡萄糖醛酸苷酶空白试剂膜也可为31ET滤纸,在其他的实施例中,原血红素空白试剂膜可和β-葡萄糖醛酸苷酶空白试剂膜也可以是其他的类型的滤纸,其并不限于31ET滤纸。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒,该试剂盒以原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为标志物进行联合检测。通过对原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶的检测结果,用于判断样本的支气管上皮细胞异质性增生情况。
本实施例提供的支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒,其包括用于检测原血红素的原血红素检测试剂膜和用于检测β-葡萄糖醛酸苷酶的β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂膜。
其中,本发明提供的原血红素检测试剂膜按如下方法制作:
1.1、制作磷酸缓冲液。缓冲液为1.75mol/L、PH值4.5磷酸盐缓冲液。
1.2、把定量聚乙烯吡咯烷酮K30加入上述溶液,得到第一混合液,搅拌至全溶;其中,聚乙烯吡咯烷酮K30用量为8g/100ml。
1.3、将裁切好的31ET滤纸(即原血红素空白试剂膜)在以上步骤制得的第一混合液中均匀浸泡至透,淋去多余试剂,烘干,为原血红素试剂膜半成品。
1.4、将定量3,3’,5,5’-四甲基联苯胺加入到无水乙醇500ml中,搅拌至完全溶解;其中,3,3’,5,5’-四甲基联苯胺为0.75g。
1.5、将定量过氧化羟基异丙苯加入到上述溶液中,得到第二混合液,搅拌至完全溶解;过氧化羟基异丙苯为1ml。
1.6、将步骤1.3制得的原血红素试剂膜半成品在步骤1.5制得的第二混合液中均匀浸泡至透,淋去多余试剂,均匀地烘干,即得原血红素检测试剂膜。
1.7、避光、干燥条件下保存。
本发明提供的β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂膜按如下方法制作:
2.1、取100ml 0.2mol/L pH 5.0的醋酸缓冲液。
2.2、将定量0.79g的酚酞葡萄糖醛酸苷辛可尼丁盐(PGA)溶于步骤2.1的醋酸缓冲液中混匀。
2.3、把定量聚乙烯吡咯烷酮K30加入上述溶液,得到第三混合液搅拌至全溶;聚乙烯吡咯烷酮K30为8g/100ml。
2.4、将裁切好的31ET滤纸(β-葡萄糖醛酸苷酶空白试剂膜)在步骤2.3制得的第三混合液中均匀浸泡至透,淋去多余试剂,得β-葡萄糖醛酸苷酶试剂膜半成品。
2.5、避光条件下,28℃流动空气干燥2小时。
2.6、取0.22mol/L、PH值为10.5的碱性甘氨酸缓冲液。
2.7、将步骤2.4制得的β-葡萄糖醛酸苷酶试剂膜半成品在步骤2.6制得的甘氨酸缓冲液中均匀浸泡至透,淋去多余试剂,40℃均匀地烘干,即得到β葡萄糖醛酸苷酶检测试剂膜。
2.8、避光、干燥条件下保存。
本发明提供的支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒参考如下步骤进行检测:
3.1、将来自某个体(肺癌患者、或非肺癌患者、或疑似肺癌患者)的痰液样本与样本前处理液(购买或配制)混合,得到样本混合液。采集标本以晨痰为佳,先应用清水、冷开水漱口,用力咳出呼吸道深部的痰(非后鼻部分泌物、非唾液),痰液直接吐入痰杯中,标本量应≥1ml。对于痰量少或无痰或咳痰困难者可用雾化吸入加温至45℃的10%NaCl水溶液(痰液粘稠难咳,阻塞气道的,需要用α-糜蛋白酶盐水溶液),使痰液易于排出后咳痰。痰液可呈黏液性、浆液性、脓性、黏液脓性或血性等多种性状。
3.2、取支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒中的原血红素检测试剂膜和β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂膜分别***至样本混合液中,根据显色结果,与相应的比色板相比较,判断出单个标物的情况。通常情况下,原血红素检测试剂膜呈现蓝色为阳性,即样本中含有原血红素,否则为阴性;β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂膜呈现红色为阳性,即样本中含有β-葡萄糖醛酸苷酶,否则为阴性。
具体地,原血红素检测结果判读标准参考图1,图1示出了原血红素比色板的颜色(蓝色)深浅所对应的判读结果(阴性、可疑阳性、阳性或强阳性),根据原血红素检测试剂膜的显色深浅与图1所示的原血红素比色板相比较,进而判读出样本中的原血红素结果(阴性、可疑阳性、阳性或强阳性)。β-葡萄糖醛酸苷酶检测检测结果判读标准可参考图2,图2示出了β-葡萄糖醛酸苷酶比色板的颜色(红色)深浅所对应的判读结果(阴性、可疑阳性、阳性或强阳性)。根据β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂膜的显色深浅与图2所示的β-葡萄糖醛酸苷酶比色板相比较,进而判读出样本中的β-葡萄糖醛酸苷酶结果(阴性、可疑阳性、阳性或强阳性)。
对该个体的支气管粘膜上皮细胞异质性增生的情况按表1的判读规则进行判读。
其中,样本前处理液参考下方法制作:称取Tris试剂6.05g,少许水溶解,水定容至500ml;3.6ml浓盐酸用蒸馏水定容到420ml;二者混合,再加入水80ml,共1000ml的Tris-Hcl缓冲液;取7.44g EDTA加入前述的1000ml Tris-Hcl缓冲液中,混合保存。
表1.采用本实施例提供的细胞异质性增生检测试剂盒对检测结果的判读规则
表1中的检测结果的临床意义如下:
支气管上皮细胞异质性增生判读结果为阳性是指:支气管上皮细胞存在异质性增生;
支气管上皮细胞异质性增生判读结果为阴性是指:支气管上皮细胞不存在异质性增生;
支气管上皮细胞异质性增生判读结果为可疑阳性是指:支气管上皮细胞可能存在异质性增生。
采用本实施例提供的支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒对样本的检测结果可供临床医生在对受检者进一步检查时参考。
本实施例提供的试剂盒以原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为标志物进行联合检测,可用于支气管上皮细胞的异质性增生进行判断,具有较高的敏感度和特异度,并可进一步对由支气管粘膜上皮细胞异质性增生引起的肺癌的进行筛查、早诊、预后判断及用于指导个体治疗等领域。
实施例2
本实施例提供了一种支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒,该试剂盒以原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为标志物进行联合检测。通过对原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶的检测结果,用于判断样本的细胞异质性增生情况。
本实施例提供的支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒,其包括用于检测原血红素的原血红素检测试剂膜、用于检测β-葡萄糖醛酸苷酶的β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂膜以及用于对样本进行处理的样本前处理液。
其中,原血红素检测试剂膜、β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂膜以及样本前处理液的制作方法可参考实施例1。
本实施例提供的支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒的效果同实施例1。
实施例3
本实施例提供了将原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为联合标志物用于检测支气管上皮细胞异质性增生的敏感度、特异度以及约登指数的验证。
灵敏度(sensitivity):又称敏感度,是指筛检方法能将实际有病的人正确地判定为患者的比例;特异度(specificity):是指筛检方法能将实际无病的人正确地判定为非患者的比例。
3.1敏感度验证
3.1.1标本来源:某医疗单位临床检验室收纳的肺癌病人痰液标本100份。肺癌均经胸部CT或MRI检查确诊。
3.1.2检测方法:采用实施例2提供的支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒对上述的100份样本进行原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶的联合检测,并按实施例1提供的判读规则进行判读。(需要说明的是,也可以采用其他的试剂盒或方法检测100份样本原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶,只要以原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为联合标志物用于对支气管上皮细胞的异质性增生进行检测即可),支气管上皮异质性增生的检测结果见表2。
表2.以原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为联合标志物与单独的以原血红素或β-葡萄糖醛酸苷酶作为标志物的检测肺癌样本的敏感度
标志物 | 强阳性 | 阳性 | 阴性 | 可疑阳性 | 敏感度(%) |
原血红素 | 35 | 53 | 11 | 1 | 89 |
β-葡萄糖醛酸苷酶 | 11 | 51 | 35 | 3 | 65 |
原血红素+β-葡萄糖醛酸苷酶 | 11 | 51 | 11 | 27 | 89 |
注:表中数据为相应检测结果的肺癌样本数。
表2显示了以原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为联合标志物与单独的以原血红素或β-葡萄糖醛酸苷酶作为标志物的检测肺癌样本的敏感度,从表2可知,单独地以原血红素作为标志物检测样本的敏感度明显高于单独地以β-葡萄糖醛酸苷酶作为标志物检测样本的敏感度(p<0.01);以原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为联合标志物检测样本的敏感度高于单独地以β-葡萄糖醛酸苷酶作为标志物检测样本的敏感度(p<0.01);以原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为联合标志物检测样本的敏感度与以原血红素作为标志物检测样本的敏感度差异并不显著(p>0.05)。
3.2特异度验证
3.2.1标本来源:与步骤3.1.1中的相同医疗单位临床检验室收纳的非肺癌患者痰标本100份。非肺癌患者为其它原因需要进行胸部CT或MRI检查,均除外肺癌者。
3.2.2检测方法:同步骤3.1.2。异质性增生的检测结果见表3。
表3.以原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为联合标志物与单独的以原血红素或β-葡萄糖醛酸苷酶作为标志物的检测非肺癌样本的特异度
标志物 | 强阳性 | 阳性 | 阴性 | 可疑阳性 | 特异度(%) |
原血红素 | 4 | 31 | 66 | 3 | 69 |
β-葡萄糖醛酸苷酶 | 0 | 1 | 93 | 6 | 99 |
原血红素+β-葡萄糖醛酸苷酶 | 0 | 4 | 66 | 30 | 96 |
注:表中数据为相应检测结果的非肺癌样本数。
表3显示了以原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为联合标志物与单独的以原血红素或β-葡萄糖醛酸苷酶作为标志物的检测非肺癌样本的特异度,从表3可看出,以原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为联合标志物检测样本的特异度明显高于单独地以原血红素作为标志物检测样本的特异度(p<0.01),并且以原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为联合标志物检测样本的特异度与单独地以β-葡萄糖醛酸苷酶作为标志物检测样本的特异度差异并不明显(p>0.05)。
3.3约登指数
3.3.1单独地以原血红素作为标志物检测的约登指数为0.58;
3.3.2单独地以β-葡萄糖醛酸苷酶作为标志物检测的约登指数为0.64;
3.3.3以原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为联合标志物检测的约登指数为0.85。
约登指数是指:敏感度与特异度之和减去1,其表示筛检方法发现真正的患者与非患者的总能力,指数越大说明筛查实验的效果越好,真实性越大。
由上述结果可知,以原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为联合标志物用于筛查支气管上皮细胞的异质性增生的效果更好,其真实性越大,相应地诊断结果也准确,大大地提高了对由支气管上皮细胞异质性增生引起的肺癌的诊断结果的准确性。
综上,本发明首次以原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为联合标志物用于检测支气管上皮细胞异质性增生情况,令人惊讶的结果是其敏感度达到89%、特异度达到96%、约登指数达到0.85,均明显高于单独地以原血红素或β-葡萄糖醛酸苷酶作为标志物的检测,且漏诊率和误诊率都非常低,符合筛查试剂的要求,适合于做大数据人群的由支气管上皮细胞异质性增生引起的肺癌筛查,有助于提高对由支气管上皮细胞异质性增生引起的肺癌的诊断结果的准确性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为联合标志物在制备支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述支气管上皮细胞为支气管粘膜上皮细胞。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒的检测样本为痰液。
4.一种支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒,其特征在于,其以原血红素和β-葡萄糖醛酸苷酶作为标志物进行联合检测,所述支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒包括:用于检测原血红素的原血红素检测试剂膜和用于检测β-葡萄糖醛酸苷酶的β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂膜。
5.根据权利要求4所述的支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒,其特征在于,所述支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒还包括样本前处理液,所述样本前处理液由pH为6.8-7.8、浓度为0.05mol/L的Tris-Hcl缓冲液与EDTA混合制得。
6.根据权利要求4或5所述的支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒,其特征在于,所述原血红素检测试剂膜由以下方法制得:
将聚乙烯吡咯烷酮与磷酸缓冲液混合,得到第一混合液;
将原血红素空白试剂膜浸泡于所述第一混合液中,去除所述原血红素空白试剂膜的水分后,得到原血红素试剂膜半成品;
将所述原血红素试剂膜半成品浸泡于第二混合液中,去除所述原血红素试剂膜半成品的水分后,得到成品的原血红素检测试剂膜,所述第二混合液由3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、无水乙醇和过氧化羟基异丙苯混合制得。
7.根据权利要求6所述的支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒,其特征在于,所述磷酸缓冲液的浓度为0.8-2mol/L、pH为3.2-6.8。
8.根据权利要求6所述的支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒,其特征在于,所述第一混合液中的聚乙烯吡咯烷酮的浓度为7-9g/100ml。
9.根据权利要求4或5所述的支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒,其特征在于,所述β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂膜由以下方法制得:
将聚乙烯吡咯烷酮、酚酞葡萄糖醛酸苷辛可尼丁盐与醋酸缓冲液混合,得到第三混合液;
将β-葡萄糖醛酸苷酶空白试剂膜浸泡于所述第三混合液中,去除所述β-葡萄糖醛酸苷酶空白试剂膜的水分后,得到β-葡萄糖醛酸苷酶试剂膜半成品;
将所述β-葡萄糖醛酸苷酶试剂膜半成品浸泡于甘氨酸缓冲液中,去除β-葡萄糖醛酸苷酶试剂膜半成品的水分,得到β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂膜。
10.根据权利要求9所述的支气管上皮细胞异质性增生检测试剂盒,其特征在于,所述醋酸缓冲液的浓度为0.1-0.3mol/L、pH为6.5-7.58,所述第三混合液中的酚酞葡萄糖醛酸苷辛可尼丁盐的浓度为0.5-1g/100ml,所述甘氨酸缓冲液的浓度为0.2-0.3mol/L、pH为9-12。
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