CN107022637B

CN107022637B - 一种与重度抑郁症相关的基因标志物

Info

Publication number: CN107022637B
Application number: CN201710409111.1A
Authority: CN
Inventors: 穆瑞斌
Original assignee: Pizhou Dongda Hospital
Current assignee: Pizhou Dongda Hospital
Priority date: 2017-06-02
Filing date: 2017-06-02
Publication date: 2019-06-07
Anticipated expiration: 2037-06-02
Also published as: CN107022637A

Abstract

本发明公开了一种与重度抑郁症相关的基因标志物，所述基因标志物为TOMM20L，TOMM20L在重度抑郁症患者中表达上调，通过检测TOMM20L基因的表达水平可以为抑郁症患者提供早期诊断，诊断更及时、特异和灵敏。同时本发明为重度抑郁症的机制研究提供了理论基础。

Description

一种与重度抑郁症相关的基因标志物

技术领域

本发明涉及生物医学领域，涉及一种与重度抑郁症相关的基因标志物，具体的所涉及的基因标志物为TOMM20L。

背景技术

抑郁症在临床上又称抑郁障碍，临床上有很多的表现症状，包括心境低落，情绪总是消沉，自卑悲观厌世，并且很大一部分患者出现***等行为；病情严重者可能会出现幻觉妄想等精神病性症状。抑郁症具有慢性、易复发、高患病率、高死亡率和社会功能受损等特点。针对疾病对经济带来的影响全世界范围内调研显示：排名前10位的导致患者能力缺失的疾病中就有5类精神类疾病，按照疾病负担来看，抑郁症排名第五，估计该病将成为继脑血管疾病后的对世界经济负担影响最大来源。

重度抑郁症一般由以下五个亚型组成：非典型抑郁(Atypical Depression)、产后抑郁(Postpartum Depression)、紧张性抑郁(Catatonic Depression)、忧郁型抑郁(Melancholic Depression)、季节性情感抑郁(Seasonal Affective Disorder)。目前还没有有效的生化或生理指标用于诊断重度抑郁症，对于疾病的判断主要还是依赖于医生与患者的家属进行交流以获得其临床信息以及量表评定。

目前对于重度抑郁症的致病原因尚不明确，，既往认为遗传因素、生物学因素、心理社会因素对抑郁症的发生有一定的影响。随着人类基因组计划的完成和分子遗传学的发展，基因的研究受到广泛重视。现代分子遗传学认为很多社会环境或自身经历等因素可引起基因表达的变化，导致某些特定的基因发生表观遗传改变，这些变化引起神经元的可塑性和功能异常，基于基因水平的重度抑郁症发病机理及生物标志物的研究逐步引起学者们的关注。寻找与重度抑郁症相关的基因用于重度抑郁症的临床诊断以及机制研究将具有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供与重度抑郁症相关的基因标志物，使用基因标志物来诊断疾病具有及时性、特异性和灵敏性，使患者在抑郁症早期就能知晓风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测TOMM20L基因表达水平的试剂在制备诊断重度抑郁症产品中的应用。

进一步，所述TOMM20L基因包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其片段、同系物、变体或衍生物。

进一步，所述试剂包括：

特异性识别TOMM20L基因的探针；或

特异性扩增TOMM20L基因的引物；或

特异性结合TOMM20L编码的蛋白的抗体或配体。

进一步，所述特异性扩增TOMM20L基因的引物对序列如SEQ IDNO.3和SEQ IDNO.4所示。

本发明提供了一种体外检测样本中TOMM20L表达水平的产品，其特征在于，所述产品包括制剂、芯片或试剂盒，其中所述产品通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术、蛋白免疫技术的方法检测TOMM20L基因或蛋白的表达水平。

进一步，所述芯片包括基因芯片、蛋白芯片，所述基因芯片包括用于检测TOMM20L基因转录水平的针对TOMM20L基因的寡核苷酸探针，所述蛋白芯片包括TOMM20L蛋白的特异性抗体或配体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测TOMM20L基因转录水平的试剂、或芯片，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测TOMM20L蛋白表达水平的试剂、或芯片。

本发明提供了上面所述的产品在制备诊断重度抑郁症工具中的应用。

本发明提供了一种诊断重度抑郁症的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

检测TOMM20L基因或蛋白表达水平的一种或多种试剂；和

选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

进一步，所述试剂盒包括通过RT-PCR法、qRT-PCR法、生物芯片检测法、DNA印迹法、原位杂交法、免疫印迹法检测TOMM20L基因或蛋白表达水平的试剂。

进一步，所述用qRT-PCR法检测TOMM20L基因表达水平的试剂包括如SEQ IDNO.3和SEQ IDNO.4所示的特异性扩增TOMM20L基因的引物序列。

进一步，所述用qRT-PCR法检测TOMM20L基因表达水平的试剂还包含SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增管家基因的引物对；所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。

进一步，所述扩增管家基因为GAPDH，扩增GAPDH的引物序列对如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

附图说明

图1是利用QPCR检测TOMM20L基因在重度抑郁症患者中的表达情况图；

图2是利用蛋白免疫检测TOMM20L蛋白在重度抑郁症患者中的表达情况图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量测序的方法，检测基因在重度抑郁症患者和正常人中的差异表达，发现其中具有明显表达差异的基因，探讨其与重度抑郁症的发生之间的关系，从而为抑郁症的早期检测寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了重度抑郁症患者中TOMM20L显著性上调，提示TOMM20L可作为检测指标应用于重度抑郁症的临床诊断。

TOMM20L基因和蛋白

在本发明的上下文中，“TOMM20L基因”包括人TOMM20L基因以及人TOMM20L基因的任何功能等同物的多核苷酸。TOMM20L基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中TOMM20L基因(NC_000014.9)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

优选地，TOMM20L基因的编码序列包括以下任一种DNA分子：

(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

在本发明的具体实施方案中，所述TOMM20L基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

本发明的TOMM20L基因可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达TOMM20L的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体所述载体包括病毒载体、真核表达载体。

病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。

真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEF Bos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301等。

在本发明的上下文中，TOMM20L基因表达产物包括人TOMM20L蛋白以及人TOMM20L蛋白的部分肽。所述TOMM20L蛋白的部分肽含有与重度抑郁症相关的功能域。

“TOMM20L蛋白”包括TOMM20L蛋白以及TOMM20L蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括TOMM20L蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人TOMM20L的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

优选地，TOMM20L蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。

(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。

在本发明的具体实施方案中，所述TOMM20L蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、***、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是TOMM20L蛋白的融合蛋白。对于与TOMM20L蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留TOMM20L蛋白的生物学活性即可。

本发明的TOMM20L蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留TOMM20L蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。

检测技术

本发明的TOMM20L使用本领域普通技术人员已知的多种核酸以及蛋白技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术。

本发明可在检测前或与检测同时地对核酸进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

通常，PCR使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；RT-PCR则将逆转录酶(RT)用于从mRNA制备互补的DNA(cDNA)，然后将cDNA通过PCR扩增以产生DNA的多个拷贝；TMA在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝，TMA任选地包括使用阻断，部分、终止部分和其他修饰部分，以改善TMA过程的灵敏度和准确度；LCR使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在热变性、杂交和连接的重复多个循环中通过DNA连接酶共价连接，以产生可检测的双链连接寡核苷酸产物；SDA使用以下步骤的多个循环：引物序列对与靶序列的相反链进行退火，在存在dNTPαS下进行引物延伸以产生双链半硫代磷酸化的(hemiphosphorothioated)引物延伸产物，半修饰的限制性内切酶识别位点进行的核酸内切酶介导的切刻，以及从切口3’端进行的聚合酶介导引的物延伸以置换现有链并产生供下一轮引物退火、切刻和链置换的链，从而引起产物的几何扩增。

本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

将Southern和Northern印迹分别用于检测特异性DNA或RNA序列。使从样本中提取的DNA或RNA断裂，在基质凝胶上通过电泳分离，然后转移到膜滤器上。使滤器结合的DNA或RNA与和所关注的序列互补的标记探针杂交。检测结合到滤器的杂交探针。该程序的一种变化形式是反向Northern印迹，其中固定到膜的底物核酸为分离的DNA片段的集合，而探针是从组织提取并进行了标记的RNA。

蛋白免疫技术包括夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。

根据本发明的免疫法可基于，例如，以下方法中的任一种。

免疫沉淀法是最简单的免疫测定方法；这种方法测量沉淀物的量，在试剂抗体已与样本一起孵育并与其中存在的靶抗原反应以形成不溶性团聚体之后形成所述沉淀。免疫沉淀反应可以是定性的或是定量的。

在颗粒免疫测定中，多种抗体与该颗粒连接，且所述颗粒能够同时结合很多抗原分子。这大大地加速了可见反应的速度。这允许生物标志物的快速且灵敏的检测。

在免疫比浊法(immunonephelometry)中，抗体和生物标志物上的靶抗原的相互作用引起免疫复合物的形成，所述免疫复合物太小而不能沉淀。但是，这些复合物将散射入射光，这可使用比浊计来测量。可在反应的几分钟之内测定抗原(即生物标志物)的浓度。

放射免疫测定(RIA)法使用放射性同位素例如I125来标记抗原或抗体。所使用的同位素发射γ射线，通常在除去非结合的(游离的)放射性标记之后测量所述射线。与其它的免疫测定相比较，RIA的主要优势在于更高的灵敏度、容易的信号检测和确认的、快速的测定。主要的劣势在于由放射物的使用引起的健康和安全风险和与维护许可放射物安全和处理程序相关的时间和费用。出于该原因，在常规临床实验室实践中，RIA已很大程度上被酶免疫测定所取代。

酶免疫测定(EIA)发展为放射免疫测定(RIA)的替代物。这些方法使用酶来标记抗体或靶抗原。EIA的灵敏度接近RIA的灵敏度，且不存在由放射性同位素引起的危险。用于检测的最广泛使用的EIA方法之一是酶联免疫吸附测定(ELISA)。ELISA方法可使用两种抗体，其一对于靶抗原是特异性的，而另一与酶偶联，酶底物的添加引起化学发光信号或荧光信号的产生。

荧光免疫测定(FIA)指使用荧光标记或酶标记的免疫测定，所述荧光标记或酶标记作用在底物上以形成荧光产物。荧光测量固有地比比色(分光光度法的)测量更加灵敏。因此，FIA方法具有比利用吸收(光密度)测量的EIA方法更高的分析灵敏度。

化学发光免疫测定使用化学发光标记，当其被化学能激发时产生光；使用光检测器测量发射。

因此，可使用熟知的方法进行根据本发明的免疫法。在本发明的生物标志物的检测中可使用任何直接(如使用传感器芯片)或间接的方法。

芯片、试剂盒

在本发明中芯片包括基因芯片、蛋白芯片；所述基因芯片包括固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于TOMM20L所示的部分或全部序列。所述蛋白芯片包括固相载体，以及固定在固相载体上的TOMM20L编码的蛋白的特异性抗体或配体。

所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。

这些探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

本发明的配体可包含能够特异性结合TOMM20L的肽、抗体或其片段、或适配体或寡核苷酸。抗体可为能够特异性结合该TOMM20L的单克隆抗体、多克隆抗体或其片段。

本发明中所述TOMM20L蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述TOMM20L蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)²、Fv等。只要所述片段能够保留与TOMM20L蛋白的结合能力即可。用于检测蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体，如所述的片段可以通过化学法从头合成或利用重组DNA技术合成。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测TOMM20L基因或蛋白的表达水平，包含用于TOMM20L检测和/或定量的本发明的配体、和/或芯片。任选的与试剂盒的说明书在一起。

试剂盒包括一种或多种无菌容器，这样的容器可以是盒、安瓿、瓶子、管形瓶、管、袋、小袋、泡罩包装、或本领域已知的其它合适的容器形式。这样的容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔、或适于容器药物的其它材料。

本发明中试剂盒或芯片可用于检测包括TOMM20L基因在内的多个基因(例如，与重度抑郁症相关的多个基因)的表达水平，将重度抑郁症的多个标志物同时进行检测，可大大提高重度抑郁症诊断的准确率。

在本发明中，术语“包括”用于指短语“包括但不限于”，并与短语“包括但不限于”可以互换使用。

在本发明中，“样本””是包含细胞或细胞物质的可从中获取核酸、多肽、或其它分析物的样本。生物样本的示例非限定性地包括：尿、血液、血清、血浆、脑脊髓液、胸膜液、支气管灌洗、痰、腹腔液、膀胱冲洗、分泌物(例如，乳腺分泌物)、口腔冲洗、拭子(例如，口腔拭子)、分离细胞、组织样本、触碰准备物、以及细针穿刺物。在本发明的具体实施例中，所述样本为血液。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与重度抑郁症相关的基因标志物

1、样品收集

各收集10例正常人血液和重度抑郁症患者血液样本，上述所有标本的取得均通过伦理委员会的同意。

重度抑郁症患者的入组标准：美国精神疾病诊断与统计手册第四版(DSM-Ⅳ)抑郁症的诊断标准，汉密尔顿抑郁量表>34分；无头部外伤史、中枢神经***感染或器质性精神障碍史。

排除标准：有滥用或依赖精神活性物质精神疾病病史且符合DSM-Ⅳ诊断标准；被诊断为精神发育迟滞的患者；目前罹患神经***或严重的心、肝、肾等其他器官***疾病者；除抑郁症外，目前存在或既往曾经被诊断有其他精神科疾病。

2、RNA样品的制备及质量分析

2.1 RNA样品的制备

(1)取血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10min，10,000rpm离心1min，吸弃上清，收集白细胞沉淀；

(2)加入TRIzol，室温放置5min，4℃12,000rpm离心10min，取上清；

(3)每1ml Trizol加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min，4℃12,000rpm离心10-15min，把水相小心的转移到新管中；

(4)在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min，4℃12,000rpm离心10min，弃上清；

(5)RNA沉淀中加入1ml 75％乙醇(用RNase-free水配制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀；

(6)4℃8,000rpm离心1-2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，室温放置2min晾干沉淀；

(7)沉淀中加入50μl RNase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存；

2.2 RNA样品的质量分析

利用Nanodrop2000对所提取的RNA浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。浓度≥200ng/μl，OD260/280介于1.8～2.2之间。

3、去除rRNA

使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。

4、构建cDNA文库

利用利用Illumina的Truseq RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作按说明书进行。

5、上机测序

使用Hiseq4000测序平台对cDNA文库进行测序，具体操作按说明书进行。

6、高通量转录组测序数据分析

对测序结果进行生物信息学分析，利用TopHat v1.3.1进行RNA-seq读段定位，通过Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度，利用cuffdiff检测差异表达，当FDR<0.05时，认为mRNA显著差异表达。

7、结果

RNA-seq结果显示，TOMM20L基因在重度抑郁症患者血液中的表达量显著高于正常人的表达量。

实施例2 QPCR测序验证TOMM20L基因的差异表达

1、根据高通量测序的检测结果选择TOMM20L基因进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择重度抑郁症患者血液和正常人血液各80例。

2、RNA提取步骤同实施例1。

3、逆转录：使用TAKARA公司的反转录试剂盒进行操作。具体步骤如下：

(1)取总RNA2μg进行逆转录，加入Oligo(dT)2μl，充分混匀；70℃水浴；5min后立即冰浴2-3min；

(2)构建25μl反应体系，其中包括5×逆转录缓冲液5μl，dNTP(2.5mM)5μl，RNasin40U/μl，M-MLV 200U/μl，补无核酶水至25μl；

(3)42℃水浴60min后，95℃水浴5min以灭活M-MLV，-20℃储存备用。

4、QPCR扩增

(1)引物设计

根据Genebank中TOMM20L基因和管家基因GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由生工合成。其中TOMM20L基因的引物对序列如下：正向引物序列为5’-TCCCAAGGTATTTGAGATG-3’(SEQ ID NO.3)；反向引物序列为5’-GCAGTCCTGTTCATTCAT-3’(SEQ ID NO.4)。GAPDH基因的引物序列对如下：正向引物序列为5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.5)；反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)。

(2)PCR反应体系：正向引物和反向引物各1μl，SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，模板2μl，加去离子水补足至25μl。

其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。

(3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×30个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、统计学方法

实验采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图1所示，与正常人血液相比，TOMM20L基因在重度抑郁症患者血液中的表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

实施例3蛋白免疫印迹实验检测TOMM20L蛋白的差异表达

采用western blot检测TOMM20L蛋白的差异表达，以GAPDH作为蛋白定量的内参，其中TOMM20L多克隆抗体购自abcam公司。

1、取血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10min，10,000rpm离心1min，吸弃上清，收集白细胞沉淀；

2、使用裂解液(RIPA)与PMSF配置成的蛋白裂解液裂解白细胞；

3、使用BCA法测定蛋白浓度，具体操作步骤参照CWBIO公司的BCA蛋白定量试剂盒上的说明进行；

4、SDS-PAGE进行凝胶电泳

5、统计学分析

根据凝胶图像中目的蛋白TOMM20L条带及内参GAPDH条带的灰度值，计算出比值，得到目的蛋白的相对表达量，重复三次。

6、结果

结果如图2所示，相比正常人，TOMM20L蛋白在重度抑郁症患者中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 邳州东大医院

<120> 一种与重度抑郁症相关的基因标志物

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 459

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

atgccctccg tccgctccct cctccgcctc ttggccgccg cggcggcctg tggcgccttc 60

gccttcctgg gctattgtat ttacctcaac cggaagcggc gcggggaccc cgcgttcaag 120

cgccgcctgc gggacaaaag aagagcagag cctcaaaagg ctgaggagca gggcacgcag 180

ttgtgggatc caacgaagaa taaaaagttg caagaacttt tcttgcaaga ggtacggatg 240

ggagaacttt ggttatctag aggagagcac agaatgggga ttcaacacct cggcaatgcc 300

cttttagtgt gcgagcaacc acgggaactt ctgaaagttt tcaaacacac tctccctccc 360

aaggtatttg agatgctgtt gcacaaaatt ccccttattt gccagcaatt tgaggcagac 420

atgaatgaac aggactgctt ggaggatgat cctgattga 459

<210> 2

<211> 152

<212> PRT

<213> 人源

<400> 2

Met Pro Ser Val Arg Ser Leu Leu Arg Leu Leu Ala Ala Ala Ala Ala

1 5 10 15

Cys Gly Ala Phe Ala Phe Leu Gly Tyr Cys Ile Tyr Leu Asn Arg Lys

20 25 30

Arg Arg Gly Asp Pro Ala Phe Lys Arg Arg Leu Arg Asp Lys Arg Arg

35 40 45

Ala Glu Pro Gln Lys Ala Glu Glu Gln Gly Thr Gln Leu Trp Asp Pro

50 55 60

Thr Lys Asn Lys Lys Leu Gln Glu Leu Phe Leu Gln Glu Val Arg Met

65 70 75 80

Gly Glu Leu Trp Leu Ser Arg Gly Glu His Arg Met Gly Ile Gln His

85 90 95

Leu Gly Asn Ala Leu Leu Val Cys Glu Gln Pro Arg Glu Leu Leu Lys

100 105 110

Val Phe Lys His Thr Leu Pro Pro Lys Val Phe Glu Met Leu Leu His

115 120 125

Lys Ile Pro Leu Ile Cys Gln Gln Phe Glu Ala Asp Met Asn Glu Gln

130 135 140

Asp Cys Leu Glu Asp Asp Pro Asp

145 150

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcccaaggta tttgagatg 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcagtcctgt tcattcat 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctctggtaaa gtggatattg t 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtggaatca tattggaaca 20

Claims

1.检测TOMM20L基因表达水平的试剂在制备诊断重度抑郁症产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述TOMM20L基因包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：

特异性识别TOMM20L基因的探针；或

特异性扩增TOMM20L基因的引物；或

特异性结合TOMM20L编码的蛋白的抗体或配体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述特异性扩增TOMM20L基因的引物序列对如SEQ IDNO.3和SEQ IDNO.4所示。

5.体外检测样本中TOMM20L表达水平的产品在制备诊断重度抑郁症工具中的应用，其特征在于，所述产品包括制剂、芯片或试剂盒。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述芯片包括基因芯片、蛋白芯片，所述基因芯片包括用于检测TOMM20L基因转录水平的针对TOMM20L基因的寡核苷酸探针，所述蛋白芯片包括TOMM20L蛋白的特异性抗体或配体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测TOMM20L基因转录水平的试剂、或芯片，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测TOMM20L蛋白表达水平的试剂、或芯片。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括：

检测TOMM20L基因或蛋白表达水平的一种或多种试剂；和

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括通过RT-PCR法、qRT-PCR法、生物芯片检测法、DNA印迹法、原位杂交法、免疫印迹法检测TOMM20L基因或蛋白表达水平的试剂。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述通过qRT-PCR法检测TOMM20L基因表达水平的试剂包括如SEQ IDNO.3和SEQ IDNO.4所示的特异性扩增TOMM20L基因的引物序列。