CN105296659B - 一种与缺血性脑卒中相关的基因标记物 - Google Patents

一种与缺血性脑卒中相关的基因标记物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与缺血性脑卒中相关的基因标记物，METTL9基因在缺血性脑卒中表达上调，通过检测METTL9基因的表达水平可以为缺血性脑卒中患者提供早期诊断，从而实现早发现早治疗，降低缺血脑卒中患者的死亡率。

Description

一种与缺血性脑卒中相关的基因标记物
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种与缺血性脑卒中相关的基因标记物METTL9。
背景技术
缺血性脑卒又称为脑梗死，是指由于脑部血液供应障碍，缺血、缺氧引起的局限性脑组织的缺血性坏死或脑软化，病理生理过程极为复杂，受多种因素影响，其中能量代谢障碍、兴奋性氨基酸毒性作用、炎症反应、半暗带去极化及细胞凋亡等机制共同参与了其病理生理过程。通常有四种类型的脑缺血：短暂性脑缺血发作、可逆性神经功能障碍、进展性卒中、完全性卒中。缺血性脑卒中是严重危害人类健康的疾病，是造成人类死亡的三大疾病之一，是导致肢体瘫痪的主要原因，目前脑血管疾病已经跃居为我国国民死亡原因的第一位，而且，缺血性脑卒中复发率高，国内报道高达30％。
随着人类基因组计划的完成和分子遗传学的发展，基因的研究受到广泛重视，寻找与疾病相关的基因成为当前研究的热点。越来越多的研究证实，基因在缺血性脑卒中的发生发展过程中起着重要的调控作用，因此基因与缺血性脑卒中发病风险的关系也备受关注。
目前，脑卒中的诊断主要依靠临床检查和各种神经成像技术，尽管相比以往来说，医学技术已高度发达，但是尚无可靠的生物标志物可以对缺血性脑卒中进行风险预测和早期诊断。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供与缺血性脑卒中相关的基因标记物，使用基因标记物来诊断疾病具有及时性、特异性和灵敏性，使患者在脑卒中早期就能知晓风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种METTL9基因及其表达产物在制备诊断缺血性脑卒中产品中的应用。
进一步，上面所述诊断产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测METTL9基因及其表达产物的表达水平以诊断缺血性脑卒中的产品。
进一步，所述用RT-PCR诊断缺血性脑卒中的产品至少包括一对特异扩增METTL9基因的引物；所述用实时定量PCR诊断缺血性脑卒中的产品至少包括一对特异扩增METTL9基因的引物；所述用免疫检测诊断缺血性脑卒中的产品包括：与METTL9蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断缺血性脑卒中的产品包括：与METTL9基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断缺血性脑卒中的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与METTL9蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与METTL9基因的核酸序列杂交的探针。
进一步，所述诊断产品包括芯片和/或试剂盒；其中所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒。所述基因检测试剂盒包括SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增METTL9基因和管家基因的引物对；所述SYBRGreen聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。
本发明提供了一种诊断缺血性脑卒中的产品，所述产品能够通过检测METTL9基因的表达水平来诊断缺血性脑卒中。
进一步，上面所述的产品包括芯片、或试剂盒。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测METTL9基因转录水平的针对METTL9基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的METTL9蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测METTL9基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括METTL9蛋白的特异性抗体。其中，所述基因芯片可用于检测包括METTL9基因在内的多个基因(例如，与缺血性脑卒中相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括METTL9蛋白在内的多个蛋白质(例如与缺血性脑卒中相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与缺血性脑卒中的标志物同时检测，可大大提高缺血性脑卒中诊断的准确率。
进一步，上面所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测METTL9基因表达水平过程中所需的试剂。优选地，所述试剂包括针对METTL9基因的引物和/或探针。
进一步，所述基因检测试剂盒包含SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增METTL9基因和管家基因的引物对；所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。
进一步，所述扩增METTL9基因的引物对序列如下：正向引物序列为5’-GGAAGAACAAGTGAATAGTC-3’；反向引物序列为5’-ACACAGGTATGGTAGTCT-3’；所述管家基因为GAPDH，扩增GAPDH的引物序列对如下：正向引物序列为5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’；反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
所述基因检测试剂盒可用于检测包括METTL9基因在内的多个基因(例如，与缺血性脑卒中相关的多个基因)的表达水平。
本发明中与METTL9基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
本发明中所述METTL9蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述METTL9蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与METTL9蛋白的结合能力即可。用于检测蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体，如所述的片段可以通过化学法从头合成或利用重组DNA技术合成。
在本发明的上下文中，“METTL9基因”包括人METTL9基因以及人METTL9基因的任何功能等同物的多核苷酸。METTL9基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中METTL9基因(NC_000016.10)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
优选地，METTL9基因的编码序列包括以下任一种DNA分子：
(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
在本发明的具体实施方案中，所述METTL9基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。
本发明的METTL9基因可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达METTL9的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体所述载体包括病毒载体、真核表达载体。
病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。
真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEF Bos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301等。
在本发明的上下文中，METTL9基因表达产物包括人METTL9蛋白以及人METTL9蛋白的部分肽。所述METTL9蛋白的部分肽含有与缺血性脑卒中相关的功能域。
“METTL9蛋白”包括METTL9蛋白以及METTL9蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括METTL9蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人METTL9的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
优选地，METTL9蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。
在本发明的具体实施方案中，所述METTL9蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。
通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、***、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是METTL9蛋白的融合蛋白。对于与METTL9蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留METTL9蛋白的生物学活性即可。
本发明的METTL9蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留METTL9蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
在本发明的上下文中，“诊断缺血性脑卒中”既包括判断受试者是否已经患有缺血性脑卒中、也包括判断受试者是否存在患有缺血性脑卒中的风险。
在本发明的上下文中，“治疗缺血性脑卒中”包括能消除、减轻、缓解、逆转或预防或延迟病症的任何症状的发生和复发，即包括对疾病的治疗性干预和预防性干预。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了METTL9基因表达与缺血性脑卒中相关，通过检测受试者血液中METTL9的表达，可以判断受试者是否患有缺血性脑卒中、或者判断受试者是否存在患有缺血性脑卒中的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明发现了一种缺血性脑卒中的新的分子标记物-METTL9基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现缺血性脑卒中的早期诊断，从而降低缺血性脑卒中的死亡率。
附图说明
图1显示利用QPCR检测METTL9基因在缺血性脑卒中患者中的表达情况；
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选与缺血性脑卒中相关的基因标志物
1、样品收集
各收集10例正常人血液和缺血性脑卒中患者血液样本，上述所有标本的取得均通过伦理委员会的同意。
2、RNA样品的制备及质量分析
2.1RNA样品的制备
(1)匀浆处理
直接取血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10min，10,000rpm离心1min。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1mlTrizol。
(2)分层
a.样品加入TRIzol后，室温放置5min，使样品充***解。4℃12,000rpm离心10min，取上清；
b.每1ml Trizol加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相。
(3)RNA沉淀
a.4℃12,000rpm离心10-15min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相小心的转移到新管中。
b.在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min。4℃12,000rpm离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底。
(4)RNA漂洗
a.RNA沉淀中加入1ml 75％乙醇(用RNase-free水配制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀。每1ml TRIzol加入1ml 75％乙醇。
b.4℃5,000-8,000rpm离心1-2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。室温放置1-2min晾干沉淀。
(5)溶解RNA
沉淀中加入50-100μl RNase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存。
2.2RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)
NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
2.3RNA样品的质量分析(Agilent Technologies 2100Bioanalyzer)
将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，Agilent Technologies2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，观察28S rRNA和18S rRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构建的要求，可以用于文库构建及测序。
3、高通量转录组测序
3.1RNA-seq读段定位
首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的***默认参数。
3.2转录丰度评估
匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。
3.3差异表达基因的检测
将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
4、结果
RNA-seq结果显示，METTL9基因在缺血性脑卒中患者血液中的表达量显著高于正常人的表达量。
实施例2QPCR测序验证METTL9基因的差异表达
1、根据高通量测序的检测结果选择METTL9基因进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择缺血性脑卒中患者血液和正常人血液各80例。
2、RNA提取步骤同实施例1。
3、逆转录：使用TAKARA公司的反转录试剂盒进行操作。具体步骤如下：
(1)取总RNA 2μg进行逆转录，加入Oligo(dT)2μl，充分混匀；70℃水浴；5min后立即冰浴2-3min；
(2)构建25μl反应体系，其中包括5×逆转录缓冲液5μl，dNTP(2.5mM)5μl，RNasin40U/μl，M-MLV 200U/μl，补无核酶水至25μl；
(3)42℃水浴60min后，95℃水浴5min以灭活M-MLV，-20℃储存备用。
4、QPCR扩增
(1)引物设计
根据Genebank中METTL9基因和管家基因GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海博尚生物技术有限公司合成。其中METTL9基因的引物对序列如下：正向引物序列为5’-GGAAGAACAAGTGAATAGTC-3’(SEQ ID NO.3)；反向引物序列为5’-ACACAGGTATGGTAGTCT-3’(SEQ ID NO.4)。GAPDH基因的引物序列对如下：正向引物序列为5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.5)；反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)。
(2)PCR反应体系：正向引物和反向引物各1μl，SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，模板2μl，加去离子水补足至25μl。
其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
(3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×30个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
5、统计学方法
实验采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果如图1所示，与正常人血液相比，METTL9基因在缺血性脑卒中患者血液中的表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.检测METTL9基因及其表达产物表达水平的试剂在制备诊断缺血性脑卒中产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测METTL9基因及其表达产物的表达水平以诊断缺血性脑卒中的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断缺血性脑卒中的产品至少包括一对特异扩增METTL9基因的引物；所述用实时定量PCR诊断缺血性脑卒中的产品至少包括一对特异扩增METTL9基因的引物；所述用免疫检测诊断缺血性脑卒中的产品包括：与METTL9蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断缺血性脑卒中的产品包括：与METTL9基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断缺血性脑卒中的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与METTL9蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与METTL9基因的核酸序列杂交的探针。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片和/或试剂盒；其中所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因检测试剂盒包括SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增METTL9基因和管家基因的引物对；所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述扩增METTL9基因的引物对序列如下：正向引物序列为5’-GGAAGAACAAGTGAATAGTC-3’；反向引物序列为5’-ACACAGGTATGGTAGTCT-3’；所述管家基因为GAPDH，扩增GAPDH的引物序列对如下：正向引物序列为5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’；反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
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